N-甲基-N-苄基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺的应用

摘要

本发明涉及医药技术领域。双特异性蛋白激酶Dyrk1A的基因被发现与唐氏综合征存在着紧密的联系，双特异性蛋白激酶目前已报道的抑制剂有EGCG、harmin、roscovitine、purvalanol等。本发明提供了N-甲基-N-苄基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺在制备双特异性蛋白激酶Dyrk1A抑制剂中的应用。N-甲基-N-苄基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺经过体外激酶活性实验，证明其有明显的抑制Dyrk1A的作用，抑制活性大于EGCG。

权利要求

1.N-甲基-N-苄基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺在制备双特异性蛋白激酶Dyrk1A抑制剂中的应用。

说明书

N-甲基-N-苄基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺

的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及医药技术领域，具体涉及N-甲基-N-苄基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺在制备双特异性蛋白激酶Dyrk1A抑制剂中的应用。

背景技术

[0002] 双 特 异 性 蛋 白 激 酶 (Dual specificity tyrosine(Y)phosphorylation regulatedkinase，Dyrk)家族成员Dyrk1A的基因被发现与唐氏综合征(Down’s syndrome，DS)存在着紧密的联系。Dyrk1A基因与果蝇minibrain(Mnb)基因同源，位于人体21号染色体DS关键区域(21q22.2)，它编码的蛋白Dyrk1A广泛分布于儿童和成人的各个组织中，尤其在脑组织中高表达，对神经发育起重要的作用。DS患者和Ts65Dn小鼠Dyrk1A的表达含量都明显比正常的表达水平高，而过表达Dyrk1A的转基因小鼠会出现和DS相似的症状，如学习能力下降和记忆缺陷。2006年《nature》中的一篇文章(Gwack Y，Rao A，Nature.2006 Jun1；441(7093)：646-50)阐述了Dyrk1A过表达与引起唐氏综合征相似性症状关系的部分分子机制，指出：21号染色体成三倍体后，Dyrk1A剂量增至正常的1.5倍，可使涉及NFAT转录因子的信号通道的调控失去稳定性。另一项研究发现NFATc1-4突变的小鼠会表现出唐氏综合征的几乎全部特点。所以，Dyrk1A是唐氏综合征的重要靶标，针对它设计的特异性阻断剂很有可能成为研究和治疗唐氏综合征的潜在药物。

[0003] 双特异性蛋白激酶目前已报道的抑制剂包括茶多酚(EGCG)(Adayev，T.，et al，Biochemistry，2006.45(39)：p.12011-9.)、harmin、roscovitine、purvalanol 等 (Bain，J.，et al，Biochem J，2007.408(3)：p.297-315.)。近期，刚有文章阐述利用EGCG来治疗过表达Dyrk1A转基因小鼠来缓解大脑功能缺陷的文章(Guedj，F.，et al，PLoS ONE，2009.4(2)：p.e4606)，这说明Dyrk1A抑制剂应用于临床治疗唐氏综合征相关的脑功能缺陷疾病应该有广阔的应用前景。

[0004] N-甲基-N-苄基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺(N-benzyl-3-chloro-6-methoxy-N-methyl-1-benzothiophene-2-carboxamide)由荷兰specs公司合成，至今未见该化合物的相关报道。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供N-甲基-N-苄基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺在制备双特异性蛋白激酶Dyrk1A抑制剂中的应用。

[0006] 本发明提供了N-甲基-N-苄基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺作为双特异性蛋白激酶DyrkA抑制剂的新用途。

[0007] N-甲基-N-苄基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺，化学结构式如下所示：

[0008]

[0009] N-甲基-N-苄基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺可购自荷兰specs公司(网址：http://www.specs.com/)，是specs公司提供的化合物库中的化合物，编号：AN-329/41189598。

[0010] N-甲基-N-苄基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺经过体外激酶活性实验，其有明显的抑制Dyrk1A的作用，在50μM浓度对Dyrk1A的抑制率为80.9％，高于EGCG在50μM浓度对Dyrk1A的抑制率(75.39％)，本发明化合物抑制活性大于EGCG，可以用作Dyrk1A抑制剂。

[0011] 根据EGCG作为Dyrk1A抑制剂应用于临床治疗唐氏综合征相关报道，提示N-甲基-N-苄基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺何作为制备治疗唐氏综合征的药物。而且本发明化合物成本低廉，毒副作用小。

附图说明

[0012] 图1是本发明N-甲基-N-苄基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺在体外抑制双特异性蛋白激酶Dyrk1A的抑制曲线图。

具体实施方式

[0013] 下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述。

[0014] 实施例1：N-甲基-N-苄基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺与EGCG体外激酶活性实验

[0015] 体外激酶活性实验应用promega公司提供的Kinase-Glo PlusLuminescent Kinase Assay试剂盒，实验步骤严格按照试剂盒附带的说明书操作。步骤如下：

[0016] 1、主要试剂和仪器：

[0017] Dyrk1A购自美国invitrogen公司，Part Number：PV3785，Lot Number：38993E；

[0018] Deph-osphorylated MBP 购 自 美 国 MILLIPORE 公 司，Catalog#13-110，Lot#DAM1475041；

[0019] ATP购自Genebase(上海捷倍思基因技术有限公司)，Amresco公司产；

[0020] Kinase-Glo Plus Luminescent Kinase Assay 购 自 美 国Promega 公 司，Catalog#V3771，System Lot#257740；

[0021] N-甲基-N-苄基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺(本发明化合物)购自specs公司；

[0022] EGCG购自上海安普生物科技有限公司。

[0023] 酶稀释缓冲液：20mM Tris(pH 7.5)，10％Glycerol，0.02％Triton X-100，0.1mg/mL BSA，0.5mM Na3VO4，2mM DTT；

[0024] 酶反应缓冲液：25mM Tris(pH 7.5)，10mM MgCl2，0.5mM EGTA，0.5mMNa3VO4，2.5mM DTT，0.01％ Triton X-100

[0025] 酶 标 仪 为Tecan GENios；酶 标 板 为costarR solid white，flat-bottom96-wellplates；水浴锅为上海博迅实业有限公司医疗设备厂产的HHS型电热恒温水浴锅。

[0026] 2、实验步骤：

[0027] 检测N-甲基-N-苄基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺和阳性化合物对照EGCG在50μM浓度对Dyrk1A激酶的抑制作用：

[0028] 以100％二甲亚砜(DMSO)为溶剂分别将N-甲基-N-苄基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺和EGCG配成10mM母液，临用前用酶反应缓冲液稀释成250μM(含5％DMSO)。

[0029] (1)取3个EP管，编号1、2和3，向管1加入6μl化合物(250μM)，另外2管加入6μl EGCG和含5％DMSO的酶反应缓冲液作阳性和阴性对照；

[0030] (2)每管加入6μl酶反应缓冲液；

[0031] (3)向管1和管2中加入6μl浓度为5ng/μl的Dyrk1A；向管3中加入6μl的酶稀释缓冲液；

[0032] (4)每管加入6μl MBP(1μg/μl)；

[0033] (5)每管加入6μl ATP(5μM)，立即混匀；

[0034] (6)30℃反应2小时；

[0035] (7)加入等体积的Kinase-GloR Plus Reagent，混匀；

[0036] (8)室温避光反应10分钟；

[0037] (9)点样于costarR solid white，flat-bottom 96-well plates中；

[0038] (10)用酶标仪测相对荧光单位(relative luminescent unit，RLU)，测定参数：integration time值为1000ms，Gain值为150。

[0039] (11)计算化合物对Dyrk1A磷酸化的抑制率，用如下公式：I＝[RLU(Dyrk1A+MBP+EGCG+ATP+Reagent)-RLU(Dyrk1A+MBP+ATP+Reagent)]/[RLU(M-BP+ATP+Reagent)-RLU(Dyrk1A+MBP+ATP+Reagent)]×100％

[0040] 3、实验结果：

[0041] 得到的结果如下：

[0042]样品 化合物 终浓度 萤光值 抑制率
ATP 1μM 12637
DYRK1A+MBP+ATP+DMSO 2960
DYRK1A+MBP+ATP+EGCG 50μM 9121 75.39％
DYRK1A+MBP+ATP+
本发明化合物 50μM 10785 80.86％

[0043] EGCG在50μM浓度对Dyrk1A的抑制率为75.39％，本发明化合物在50μM浓度对Dyrk1A的抑制率为80.9％，抑制活性大于EGCG。

[0044] 实施例2：不同浓度N-甲基-N-苄基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺体外激酶活性实验

[0045] 1、主要试剂和仪器：同实施例1

[0046] 2、实验步骤：

[0047] 对N-甲基-N-苄基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺在不同浓度下对Dyrk1A抑制活性做了量效分析：

[0048] 仿照实例1的实验步骤，将本发明化合物设置六个不同的终浓度：

[0049] (1)1.5625μM；(2)3.125μM；(3)6.25μM；

[0050] (4)12.5μM；(5)25μM；(6)50μM；(7)100μM；

[0051] 每个浓度实验重复三次。

[0052] 3、实验结果：

[0053] 得到的结果如下：

[0054]

[0055] 抑制曲线如图1；

[0056] 并根据上述结果计算出N-甲基-N-苄基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺对Dyrk1A的IC50＝6.39μM。

[0057] 本发明经实验表明，N-甲基-N-苄基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺对Dyrk1A有明显的抑制作用，所以N-甲基-N-苄基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺可以用作Dyrk1A抑制剂。继而提示N-甲基-N-苄基-3-氯-6-甲氧基-苯并噻吩-2-甲酰胺可以作为制备治疗唐氏综合征的药物。本发明具有良好的药物应用前景。