制备抗PINK1多克隆抗血清的多肽及其应用

摘要

本发明公开了制备抗PINK1多克隆抗血清的多肽及其应用。本发明的多肽，是如下a)或b)的多肽：a)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的多肽；b)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸由a)衍生的多肽。本发明还公开了编码该多肽的DNA分子。本发明制备的抗PINK1多克隆抗血清，既能用于Western blot的检测，也能应用于免疫组化的分析，这在PD及其与PINK1相关疾病的诊断及治疗中具有重要意义。

权利要求

1.一种多肽，是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的多肽。

2.编码权利要求1所述多肽的DNA分子。

3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子的核苷酸序列是序列表中序列1。

4.含有权利要求2或3所述DNA分子的重组表达载体。

5.含有权利要求2或3所述DNA分子的转基因细胞系或重组菌。

6.权利要求1所述的多肽在制备抗PINK1多克隆抗血清中的应用。

7.权利要求2或3所述DNA分子在制备抗PINK1多克隆抗血清中的应用。

8.一种抗PINK1多克隆抗血清，是以权利要求1所述的多肽为抗原免疫动物获得的抗血清。

9.根据权利要求8所述的抗血清，其特征在于：权利要求1所述的多肽为包涵体。

说明书

制备抗PINK1多克隆抗血清的多肽及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及制备抗PINK1多克隆抗血清的多肽及其应用。

背景技术

[0002] 帕金森病(Parkinson’s Desease PD)是继老年性痴呆的第二大常见的神经系统退行性疾病。其临床特点是静止性震颤，运动迟缓，肌张力增强。典型的神经病理学特点是中脑黑质致密区多巴胺神经元选择性变性缺失及纹状体多巴胺含量明显减少。此外，尚存神经元胞浆内出现纤维样嗜酸性包涵体——路易体(Lewy body)，Lewy体的成分有泛素(ubiquitin)、α-突触核蛋白(α-Synuclein)和PETEN诱导的激酶1(PINK1)等 (Miratul M.K.Muqit，Patrick M.Abou-Sleiman，AdrianT.Saurin，et al.Altered cleavage and localization of PINK1 to aggresomesin the presence of proteasomal stress Journal of Neurochemistry 2006，98，156-169)。至今发现的与PD相关的基因包括α-Synuclein，LRRK2，UCH-L1，parkin，DJ-1，PINK1等(Agnes Petit，Toshitaka Kawarai，Erwan Paitel，et al.Wild-type PINK1 Prevents Basal and Induced Neuronal Apoptosis，a ProtectiveEffect Abrogated by Parkinson Disease-related Mutations THE JOURNAL OFBIOLOGICAL CHEMISTRY 2005，280(40)：34025-34032)。这些基因突变后可导致蛋白变性，氧化应激和线粒体功能障碍，激酶活性的改变( B.SchulzUpdate on the pathogenesis of Parkinson’s disease J Neurol(2008)255[Suppl5]：3-7)。很多实验室都致力于将这些蛋白质归结到同一信号通路，以阐明PD发病机制、发现新的治疗靶点。

[0003] PINK1(PTEN-induced kinase 1)基因是在癌基因PTEN的研究中发现的，并因此而命名。2004年发现PINK1突变与常染色体隐形遗传性PD有关(Valente E.M.，Abou-Sleiman P.M.，Caputo V.，et al.Hereditary early-onset Parkinson’sdisease caused by mutations in PINK1 Science 2004，304(5674)：1158-1160)。它定位于染色体1p35-36，在部分PD患者的病理学检测中发现PINK1蛋白是路易体的组成成分，基因包含8个外显子，长度1.8Kb，编码一个581个氨基酸的蛋白质(Julia W.Pridgeon PINK1 Protects against Oxidative Stress byPhosphorylating Mitochondrial Chaperone PLoS BIOLOGY 2007，5(7)：172)。PINK1基因可以被PTEN转录激活，其转录本普遍表达，但在富含线粒体的组织中高度表达，如心肌，骨骼肌及睾丸组织等。预测PINK1编码一个34个氨基酸组成的线粒体定向转移基序(在34和35残基之间有一个线粒体加工肽酶的切割2+
位点)和一个高度保守的蛋白激酶结构域(156～509氨基酸残基)，与Ca /钙调素家族的丝/苏氨酸激酶具有高度同源性(Petit，A.，Kawaeai，T.，Paitel，E.，et al.Wild-type PINK1 prevents basal and induced neuronal apoptosis，a protectiveeffect abrogated by Parkinson disease-related mutations.J Biol Chem.2005280(40)：
34025-32.Silvestri，L.，Caputo，V.，Bellacchio，E.，et al.Mitochondrial import and enzymatic activity of PINK1 mutants associated torecessive parkinsonism.Hum.Mol.Genet.2005，14(22)，3477-3492)。PINK1在细胞核中被转录后，在细胞浆中被翻译，然后被导入线粒体中，其导入仅需要N端的线粒体转移基序(Chun Zhou，Yong Huang，Yufang Shao，et al.The kinasedomain of mitochondrial PINK1 faces the cytoplasm PNAS 2008，105(33)：12022-12027)。PINK1在细胞中的位置报导不一，目前认为它既存在于线粒体，也可以存在于胞浆中。它能位于线粒体的内膜，横跨线粒体外膜，使其激酶结构域暴露于细胞浆，这种结构可能有利于其与胞浆中的底物相互作用。这种结构的形成主要依赖于N端转移基序后面的跨膜结构域(94～110氨基酸残基)，并且常见激酶结构域的PINK1突变体这种结构没有发生改变。大多蛋白激酶的C端含有功能性基序，可以调节激酶的催化活性，结合的底物及调节蛋白，PINK1的相应结构域位于C端激酶结构域的外侧(512～581氨基酸残基)(Mills RD，Sim CH，Mok SS，etal.Biochemical aspects of the neuroprotective mechanism of PTEN-inducedkinase-1(PINK1)J Neurochem 2008，
105(1)：18-33)。PINK1在细胞内能被蛋白酶剪切成不同的形式，包括全长(～66kDa)及不同大小的片断(55kDa，46kDa)等，具体机制不清。PINK1可以通过泛素蛋白酶体系统进行降解。DJ-1与PINK1能够相互作用，并增强全长PINK1蛋白水平的稳定性(Beisha Tang，Hui Xiong，PingSun，et al.Association of PINK1 and DJ-1 confers digenicinheritance ofearly-onset Parkinson’s disease Human Molecular Genetics 2006，15(11)：
1816-1825)，而Hsp90与PINK1相互作用能增强PINK1各种剪切体的蛋白稳定性(William Lin1 and Un Jung Kang1.Characterization of PINK1 processing，stability，and subcellular localization J Neurochem 2008，106(1)：464-474)。

[0004] 线粒体是真核细胞的重要的细胞器，它是产生ATP的重要场所，在调控细胞生存+和死亡方面发挥了重要作用。MPTP所引起的PD症状是由于自身代谢形成的MPP 抑制了呼吸链复合体I所致，所以人们开始研究线粒体在PD中的作用(Orth M，Schapira AH Mitochondria and Degenerative DisordersAmerican Journal ofMedical Genetics Am J Med Genet.2001，106(1)：27-3)。mtDNA没有组蛋白的保护，所以无法对DNA序列的突变进行完全的修复。线粒体在产生ATP的过程中也产生了一些自由基和活性氧，这些活性氧被认为很容易诱导mtDNA突变(Simon DK，Lin MT，Zheng L，et al.Somatic mitochondrial DNA mutations in cortex andsubstantia nigra in aging and Parkinson，s disease Neurobiol Aging.2004，25(1)：71-81 14.)。研究表明，PD患者基底神经节mtDNA的变异程度要明显高于正常人，且mtDNA与PD患者complex I的功能缺陷有直接的关系(MawrinC，Kirches E，Krause G，et al.Region-specific analysis of mitochondrialDNA deletions in neurodegenerative disorders in humans Neurosci Lett.2004357(2)：111-4.)。且PD患者中线粒体显示了complex I活性降低和活性氧产生增多(Schapira AH，Cooper JM，Dexter D，et al.Mitochondrial complex Ideficiency in Parkinson’s disease Lancet.1989，1(8649)：1269.SwerdlowRH，Parks JK，Miller SW，et al.(1996)Origin and functional consequencesof the complex I defect in Parkinson’s disease Ann Neurol.1996，40(4)：663-71.)。线粒体在凋亡的过程中起关键的作用并可以在几个水平上调控凋亡。1)保持ATP的产生2)维持线粒体的跨膜电位(ΔΨm)和释放特定凋亡因子 (J.D.Ly，D.R.Grubb，A.Lawen The mitochondrial membranepotential(ΔΨm)in apoptosis；an update Apoptosis 2003 8：115-128)。PD患者的黑质多巴胺能神经元有凋亡的发生，MPTP制造的动物模型的黑质多巴胺细胞有明显的凋亡。对MPTP成模的鼠，猴应用抗凋亡剂后，多巴胺能神经元的存活率增高。可见，PD的发病过程中由线粒体介导的凋亡也起到了重要作用。

[0005] PINK1是与线粒体直接相关的PD致病基因。内源性的及重组标记的PINK1都可以存在于线粒体中(Beilina A.，Van Der Brug M.，Ahmad R.，et al.Mutationsin PTEN-induced putative kinase 1 associated with recessive parkinsonismhave differential effects on protein stability.Proc Natl Acad Sci USA2005，102(15)：5703-5708)。果蝇实验表明PINK1突变可直接损伤线粒体，降低ATP的量，使多巴胺神经元缺失(Park J，Lee SB，Lee S，et al.Mitochondrialdysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin 2006，441(7097)：1157-61)；PINK1沉默后出现的线粒体膜电势差(ΔΨ)下降、ATP产量下降及细胞凋亡等线粒体功能障碍；PINK1的RNAi恢复实验证实，PINK1可减轻线粒体功能障碍。在SH-SY5Y细胞中，PINK1异常可导致由于线粒体凋亡所致的细胞活力降低；而PINK1缺乏则导致了氧化应激所致的广泛的线粒体功能障碍和异常的线粒体形态(Alison Wood-Kaczmar，Sonia Gandhi，Zhi Yao，et al.PINK1 IsNecessary for Long Term Survival and Mitochondrial Function in HumanDopaminergic Neurons PLoS BIOLOGY 2008，3(6)：e2455)。这些结果表明PINK1保护功能很可能是通过对抗氧化应激及神经毒性造成的线粒体形态及功能的异常来完成的。
由于果蝇中PINK1突变造成线粒体障碍可以被过表达Bcl-2改善，所以推测PINK1的保护功能可能是通过增强Bcl-2来抑制前凋亡蛋白细胞色素C等的释放。与PD相关的PINK1突变点(如G309D，L347P，W437X等)大多都在蛋白激酶结构域，由此推测，PINK1保护功能的发挥主要依赖于蛋白激酶结构域。

[0006] 越来越多的证据表明PINK1能与参与PD病变和线粒体障碍的其它信号蛋白相互作用。至今发现的三个底物分别是E3泛素连接酶Parkin，线粒体激酶HtrA2以及线粒体伴侣蛋白肿瘤坏死因子受体相关蛋白TRAP1(又称热休克蛋白75)。PINK1如何调节这些蛋白以维持细胞的存活，至今仍不是很清楚。

[0007] 果蝇中发现PINK1和Parkin的突变体有很多相似的表型，如线粒体膨大的紊乱的肌纤维，肌细胞的调亡，特定神经簇的多巴胺神经元的缺失等。Parkin过表达能改善PINK1突变导致的症状，反之则不能，表明PINK1和Parkin作用于同一途径且PINK1在上游来调节细胞的凋亡(Angela C.Poole，Ruth E.Thomas，LaurieA.Andrews，et al.The PINK1/Parkin pathway regulates mitochondrialmorphology PNAS 2008，105(5)：1638-1643)。并且有文献表明PINK1/Parkin通路能够促进线粒体分裂，其突变体导致的线粒体及组织结构的紊乱是由于线粒体分裂减少造成的(Pridgeon J.W.，Olzmann J.A.，Chin L.-S.，et al.PINK1Protects against Oxidative Stress by Phosphorylating MitochondrialChaperone TRAP1 PLoS Biol.2007，5(7)：1494-1503)。PINK1/Parkin通路可能参与了多条信号通路，如IKK/NFκB，JNK以及PI3-kinase/Akt，这还有待于进一步的研究证明。

[0008] TRAP1的具体功能至今仍不清楚。文献报导干扰掉TRAP1后能够增加氧化应激所导致的细胞色素C的释放及细胞的凋亡，而过表达后则能抑制细胞毒素导致的ROS的产生(Hua G.，Zhang Q.and Fan Z.Heat shock protein 75(TRAP1)antagonizes reactive oxygen species generation and protects cells fromgranzyme M-mediated apoptosis J Biol Chem. 282(28)：20553-20560)。TRAP1被认为是PINK1的底物之一，在体外它能够直接被PINK1磷酸化。两者可以共定位于线粒体膜间隙和线粒体内膜。有实验证明，细胞受氧化应激刺激后，TRAP1的磷酸化水平提高，而过表达PINK1能够提高其磷酸化水平。这提示了TRAP1可能参与了PINK1的细胞保护功能。其磷酸化位点等机制仍需进一步的探讨。

[0009] HtrA2是一种丝氨酸蛋白酶(又称Omi)，在凋亡刺激下，它能从线粒体中释放到胞浆中，与凋亡蛋白抑制因子结合(IAPs)，从而抑制凋亡的发生。HtrA2和PINK1均可位于线粒体膜间隙(Strauss K.M.，Martins L.M.，Plun-Favreau H.，et al.Loss of function mutations in the gene encoding Omi/HtrA2 in Parkinson’sdisease Hum Mol Genet2005，14(15)：2099-2111)。研究发现两者能够相互结合并在线粒体中形成复合物，而这种结合促进了HtrA2的Ser-142位点被应激激活激酶p38γ磷酸化(Plun-Favreau H.，Klupsch K.，Moisoi N.，et al.Themitochondrial protease HtrA2 is regulated by Parkinson’s disease-associatedkinase PINK1 Nat Cell Biol.9(11)：1243-1252)，而这种磷酸化形式能够抑制神经毒性导致的细胞凋亡。其具体的机制仍在研究之中。

[0010] 此外有研究报导，DJ-1与PINK1能够相互作用，并增强全长PINK1蛋白水平的稳定性，共同抵制细胞毒性介导的凋亡。

[0011] 综上所述，在PD中PINK1发挥其保护功能与线粒体密切相关。PINK1的调节，底物，作用位点及PINK1参与的各条信号通路如何相互作用，这些问题仍有待进一步的研究发现。

发明内容

[0012] 本发明的目的是提供一种制备抗PINK1多克隆抗血清的多肽及其应用。

[0013] 本发明所提供的制备抗PINK1多克隆抗血清的多肽，命名为PINK1的激酶结构域，是如下a)或b)的多肽：

[0014] a)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的多肽；

[0015] b)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸由a)衍生的多肽。

[0016] 为了使a)的多肽便于纯化，可在由序列表中序列2所示的多肽的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

[0017] 表1.标签的序列

[0018]标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tagII 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL

[0019] 上述b)中的多肽可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述b)中的多肽的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

[0020] 所述多肽的编码基因也属于本发明的保护范围。

[0021] 所述多肽的编码基因是如下1)或2)或3)：

[0022] 1)其核苷酸序列是序列表中序列1；

[0023] 2)在严格条件下与1)限定的DNA片段杂交且编码所述多肽的DNA分子；

[0024] 3)与1)或2)的DNA分子具有90％以上的同源性，且编码所述多肽的DNA分子。

[0025] 所述步骤3)中的DNA分子，与1)的DNA分子最好有95％以上的同源性。

[0026] 上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在68℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

[0027] 扩增所述DNA分子全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

[0028] 含有上述所述DNA分子的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。

[0029] 所述的多肽可用来制备抗PINK1多克隆抗血清。

[0030] 该抗PINK1多克隆抗血清，是以所述的多肽为抗原免疫动物获得的多克隆抗血清。所述的多肽形成包涵体。

[0031] 所述的抗PINK1多克隆抗血清也属于本发明的保护范围。

[0032] 实验证明用PINK1的激酶结构域免疫新西兰大白兔，成功获得了抗PINK1多克隆抗血清，Dot blot显示效价可达到1∶3000。初步盐析纯化后Western blot显示此抗PINK1多克隆抗血清可识别重组人PINK1，还可识别大鼠脑匀浆、小鼠脑匀浆、正常人脑匀浆及人脑膜瘤脑匀浆中的PINK1。这表明所获抗PINK1多克隆抗血清对人PINK1是特异性的，并可与大鼠、小鼠发生交叉反应。人PINK1与大鼠、小鼠PINK1氨基酸序列有高度同源性，此抗体识别的部分是人、大鼠、小鼠PINK1所共有的片段。与大鼠、小鼠PINK1的交叉反应说明该抗PINK1多克隆抗血清不仅可以应用于动物PD模型的研究，而且还可应用于人类神经退行性疾病如帕金森病和路易体相关疾病的早期诊断，对进一步阐明PINK1蛋白质的生理功能和其在PD发病过程中的作用具有重要意义。用抗PINK1多克隆抗血清进行了大鼠脑切片的免疫组织化学研究，结果显示PINK1免疫性物质分布于全脑广泛部位，如嗅球、皮层、海马、纹状体、黑质、中脑导水管和红核等，对于不同的细胞其亚细胞定位也有所区别。因此所述，本发明制备的抗PINK1多克隆抗血清，既能用于Western blot的检测，也能应用于免疫组化的分析，这在PD及其与PINK1相关疾病的诊断及治疗中具有重要意义。

附图说明

[0033] 图1为免疫用抗原鉴定。

[0034] 图2为Dot blot检测效价抗PINK1多克隆抗血清。

[0035] 图3为Western blot检测抗PINK1多克隆抗血清的敏感性和特异性。

[0036] 图4为western blot检测抗PINK1多克隆抗血清与人脑膜瘤匀浆中PINK1蛋白的结合。

[0037] 图5为PINK1免疫活性物质在嗅球的分布。

[0038] 图6为PINK1免疫活性物质在皮层的分布。

[0039] 图7为PINK1免疫活性物质在海马的分布。

[0040] 图8为PINK1免疫活性物质在黑质的分布。

[0041] 图9为PINK1免疫活性物质在小脑的分布。

[0042] 图10为PINK1免疫活性物质在中脑水管的分布。

[0043] 图11为PINK1免疫活性物质在红核的分布。

[0044] 图12为PINK1免疫活性物质在皮层的分布。

[0045] 图13为PINK1免疫活性物质在大脑脚的分布。

[0046] 具体实施方式

[0047] 下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。

[0048] 一、动物免疫用重组人PINK1的表达和纯化

[0049] 人PINK1的激酶结构域(kinase domain)由425个氨基酸组成，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。从正常人胚胎脑中提取总RNA，反转录成cDNA，用引物1(5`CCC AAG TTT GTT GTG ACC G3`)和引物2(3`TGT AAT TTC CCA CTC CCGTA5`)PCR扩增编码PINK1的激酶结构域的DNA，将PCR扩增得到的编码人PINK1的激酶结构域的DNA插入pET-28a载体，构成重组质粒pET-28a-PINK1。将pET-28a-PINK1转化至BL21(DE3)感受态细胞，取单菌落植入10mL 2×YTA-amp液体培养基(每升含16g蛋白胨、10g酵母提取物、5g NaCl和0.1g氨苄西林)，37℃过夜振荡预培养后转移至1L新鲜2×YTA-amp培养基中，37℃振荡培养3h，加IPTG(终浓度0.1mmol/L)，继续培养4h后收集菌体，以冰冷0.01mol/L PBS悬浮细菌，超声充分破碎，向破碎的菌液中添加Triton X-100(终浓度为1％)，室温放置30min，离心(4℃，15000g)1h，弃净上清。用30ml含4％triton X-100的水溶液悬浮沉淀，37℃震荡(230转/分)30分钟。离心(4℃，15000g)1h，弃上清。再重复1次4％Triton X-100的水溶液洗涤过程。用脱离子水洗涤沉淀2次(每次30分钟)，弃净上清。将6mol/L盐酸胍5ml添加至沉淀，充分悬浮。离心(4℃，15000g)1h，将上清转移至透析袋中，用PBS缓冲液透析过夜(中间更换2次PBS缓冲液)。将有絮状析出的透析袋内容物转移至15ml离心管中，用超声波处理蛋白液20分钟，得到重组人PINK1蛋白质。蛋白质的定量采用BCA法，以牛血清白蛋白(BSA)为标准。蛋白纯度鉴定采用SDS-PAGE。

[0050] SDS-PAGE如图1所示，重组人PINK1在大肠杆菌中高效表达形成包涵体。用6M盐酸胍处理包涵体，再经透析和超声波溶解后获得的重组人PINK-1，相对分子质量约为40kd的单一条带。

[0051] 图1A中，泳道1：细菌破碎液离心后的上清液；泳道2：细菌破碎液离心后的沉淀再悬浮液。

[0052] 图1B中，泳道1：普通标准分子量Marker；泳道2：纯化后PINK1 100ng；泳道3：纯化后PINK1 140ng；泳道4：纯化后PINK1 180ng；泳道5：纯化后PINK1 220ng；泳道6：纯化后PINK1 260ng；泳道7：纯化后PINK1 300ng；泳道8：纯化后PINK1 340ng；泳道9：彩色标准分子量Marker。

[0053] 二、免疫动物

[0054] 将250μg(250μl)重组人PINK1混于250μl完全福氏佐剂(Sigma公司)，水中超声达到完全乳化程度。按125μg/只的抗原剂量，分别免疫2只新西兰大耳白兔(背部皮下注射，每次注射一位点)。每隔一周强化免疫一次，共3次。强化免疫时使用福氏不完全佐剂(Sigma公司)混合乳化，方法、抗原量同第一次。第三次强化免疫后三天采血，Dot blot检测效价。

[0055] Dot blot检测方法如下：

[0056] 用0.1％明胶包被硝酸纤维膜(NC膜)。自然干燥后，在NC膜上分别滴加重组人PINK1 3000、1500、300和150ng，80℃多聚甲醛交联30m，4℃下与初步纯化后的抗血清(稀释至体积分数1∶3000)共同孵育过夜。二抗(购自北京中杉金桥公司)为生物素化羊抗兔IgG(稀释至体积分数1∶1200)，室温下与NC膜反应3h后再与辣根过氧化物酶(北京中杉金桥公司，稀释至体积分数1∶1200)共同孵育3h，DAB法显色。

[0057] Dot blot分析结果如图2表明，用PINK1的激酶结构域免疫过的新西兰大白兔，所获得的抗血清稀释至1∶3000之后，仍能识别MN9D细胞中的PINK1。

[0058] 效价达到1∶3000，采血，分离血清，-20℃保存。

[0059] 将各批次所采同质血清混合，38-40％硫酸铵盐析两次；第二次离心后所得沉淀用0.01M PBS重悬，放入半透膜袋中，将半透膜袋在含0.15mol/L NaCl的50mMTris-Hcl(PH7.4))中4℃3h，换液一次，过夜；收集获得抗PINK1多克隆抗血清，添加
0.01％叠氮钠，分装，-20℃保存。

[0060] 三、Western blot分析

[0061] 取正常大鼠脑组织、小鼠脑组织，正常人脑组织和人脑膜瘤分别制成匀浆，方法如下：6000g，4℃离心30min获上清，加入5×loading 1∶4(北京普利来公司)后95℃变性5min，分别获得大鼠脑组织、小鼠脑组织、正常人脑组织和人脑膜瘤匀浆；用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后大鼠脑匀浆，将凝胶中蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上(半干转方法)；用5％(质量百分含量)脱脂牛奶封闭PVDF膜1h，再将膜与初步纯化后的抗PINK1多克隆抗血清(稀释至体积分数1∶5000，其中含1％牛奶)4℃过夜；TBST洗3次，10m/次；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(稀释至体积分数
1∶10000，其中含1％牛奶)共同孵育1h；TBST洗3次，10m/次；用ECL法显色(ECL试剂购自北京中山公司)。

[0062] Western blot分析结果如图3和4所示，表明该抗PINK1多克隆抗血清稀释至体积分数1∶7500时，既可以识别重组人PINK1，还可识别大鼠脑匀浆、小鼠脑匀浆，正常人脑组织及人脑膜瘤脑匀浆中的PINK1，所识别蛋白质的相对分子质量均为40kd左右，但存在种属差别。

[0063] 图3中，A为抗PINK1多克隆抗血清的敏感性，1-12：PINK1的激酶结构域(130ng-20ng)；

[0064] B为Western blot检测抗PINK1多克隆抗血清的特异性-1，左为Western blot检测，右为吸收实验(吸收实验是用足够量抗原与所得抗血清充分混合4℃过夜，之后将混合液充当一抗，western blot检测样品)1：正常人胚胎脑匀浆10ug：2、小鼠脑匀浆10ug 3：大鼠脑匀浆10ug、4：重组PINK1 100ng。

[0065] C为Western blot检测抗PINK1多克隆抗血清的特异性-2；左为Western blot检测，右为吸收实验，1：人脑膜瘤匀浆10ug，2：小鼠脑匀浆10ug，3：大鼠脑匀浆10ug，4：重组PINK1 100ng。

[0066] 图B与C共同说明，PINK1在正常人脑中及脑膜瘤中分子量有所差异。

[0067] 图4中，1-10：抗PINK1多克隆抗血清(1∶1000稀释、1∶2000稀释、1∶3000稀释、1∶4000稀释、1∶5000稀释、1∶6000稀释、1∶7000稀释、1∶8000稀释、1∶9000稀释、1∶10000稀释)；1-10泳道上样量均为人脑膜瘤匀浆25ug/泳道。

[0068] 四、免疫组化分析

[0069] 正常大鼠经4％(质量百分含量)多聚甲醛(PFA)灌流固定后取脑，30％蔗糖(用4％PFA配置)后固定48小时，冷冻切片(40μm/片)。切片经PBST(其中含0.03％(体积百分含量)TritonX-100)，1N盐酸，3％(体积百分含量)H2O2和5％(体积百分含量)牛奶处理后，与初步纯化后的抗PINK1多克隆抗血清(稀释至体积分数1∶5000)过夜、二抗(生物素化的羊抗兔IgG，稀释至体积分数1∶1000)室温3h以及辣根过氧化物酶(稀释至体积分数1∶1000)室温3h反应后，DAB法显色。

[0070] DAB法显色结果如图5至图13所示，用初步纯化后的抗PINK1多克隆抗血清进行大鼠脑切片的免疫组化研究，在嗅球、皮层、海马、纹状体、黑质和红核等可见较强的PINK1免疫活性。

[0071] 序列表

[0072] <110>首都医科大学

[0073] <120>制备抗PINK1多克隆抗血清的多肽及其应用

[0074] <160>2

[0075] <210>1

[0076] <211>1278

[0077] <212>DNA

[0078] <213>

[0079] <400>1

[0080] ctgatagggc agtccattgg taagggctgc agtgctgctg tgtatgaagc caccatgcct 60[0081] acattgcccc agaacctgga ggtgacaaag agcaccgggt tgcttccagg gagaggccca 120[0082] ggtaccagtg caccaggaga agggcaggag cgagctccgg gggcccctgc cttccccttg 180[0083] gccatcaaga tgatgtggaa catctcggca ggttcctcca gcgaagccat cttgaacaca 240[0084] atgagccagg agctggtccc agcgagccga gtggccttgg ctggggagta tggagcagtc 300[0085] acttacagaa aatccaagag aggtcccaag caactagccc ctcaccccaa catcatccgg 360[0086] gttctccgcg ccttcacctc ttccgtgccg ctgctgccag gggccctggt cgactaccct 420[0087] gatgtgctgc cctcacgcct ccaccctgaa ggcctgggcc atggccggac gctgttcctc 480[0088] gttatgaaga actatccctg taccctgcgc cagtaccttt gtgtgaacac acccagcccc 540[0089] cgcctcgccg ccatgatgct gctgcagctg ctggaaggcg tggaccatct ggttcaacag 600[0090] ggcatcgcgc acagagacct gaaatccgac aacatccttg tggagctgga cccagacggc 660[0091] tgcccctggc tggtgatcgc agattttggc tgctgcctgg ctgatgagag catcggcctg 720[0092] cagttgccct tcagcagctg gtacgtggat cggggcggaa acggctgtct gatggcccca 780[0093] gaggtgtcca cggcccgtcc tggccccagg gcagtgattg actacagcaa ggctgatgcc 840[0094] tgggcagtgg gagccatcgc ctatgaaatc ttcgggcttg tcaatccctt ctacggccag 900[0095] ggcaaggccc accttgaaag ccgcagctac caagaggctc agctacctgc actgcccgag 960[0096] tcagtgcctc cagacgtgag acagttggtg agggcactgc tccagcgaga ggccagcaag 1020[0097] agaccatctg cccgagtagc cgcaaatgtg cttcatctaa gcctctgggg tgaacatatt 1080[0098] ctagccctga agaatctgaa gttagacaag atggttggct ggctcctcca acaatcggcc 1140[0099] gccactttgt tggccaacag gctcacagag aagtgttgtg tggaaacaaa aatgaagatg 1200[0100] ctctttctgg ctaacctgga gtgtgaaacg ctctgccagg cagccctcct cctctgctca 1260[0101] tggagggcag ccctgtga 1278[0102] <210>2

[0103] <211>425

[0104] <212>PRT

[0105] <213>

[0106] <400>2

[0107] Leu Ile Gly Gln Ser Ile Gly Lys Gly Cys Ser Ala Ala Val Tyr Glu[0108] 1 5 10 15[0109] Ala Thr Met Pro Thr Leu Pro Gln Asn Leu Glu Val Thr Lys Ser Thr[0110] 20 25 30

[0111] Gly Leu Leu Pro Gly Arg Gly Pro Gly Thr Ser Ala Pro Gly Glu Gly[0112] 35 40 45

[0113] Gln Glu Arg Ala Pro Gly Ala Pro Ala Phe Pro Leu Ala Ile Lys Met[0114] 50 55 60

[0115] Met Trp Asn Ile Ser Ala Gly Ser Ser Ser Glu Ala Ile Leu Asn Thr[0116] 65 70 75 80[0117] Met Ser Gln Glu Leu Val Pro Ala Ser Arg Val Ala Leu Ala Gly Glu[0118] 85 90 95[0119] Tyr Gly Ala Val Thr Tyr Arg Lys Ser Lys Arg Gly Pro Lys Gln Leu[0120] 100 105 110

[0121] Ala Pro His Pro Asn Ile Ile Arg Val Leu Arg Ala Phe Thr Ser Ser[0122] 115 120 125

[0123] Val Pro Leu Leu Pro Gly Ala Leu Val Asp Tyr Pro Asp Val Leu Pro[0124] 130 135 140

[0125] Ser Arg Leu His Pro Glu Gly Leu Gly His Gly Arg Thr Leu Phe Leu[0126] 145 150 155 160[0127] Val Met Lys Asn Tyr Pro Cys Thr Leu Arg Gln Tyr Leu Cys Val Asn[0128] 165 170 175[0129] Thr Pro Ser Pro Arg Leu Ala Ala Met Met Leu Leu Gln Leu Leu Glu[0130] 180 185 190

[0131] Gly Val Asp His Leu Val Gln Gln Gly Ile Ala His Arg Asp Leu Lys[0132] 195 200 205

[0133] Ser Asp Asn Ile Leu Val Glu Leu Asp Pro Asp Gly Cys Pro Trp Leu[0134] 210 215 220

[0135] Val Ile Ala Asp Phe Gly Cys Cys Leu Ala Asp Glu Ser Ile Gly Leu[0136] 225 230 235 240[0137] Gln Leu Pro Phe Ser Ser Trp Tyr Val Asp Arg Gly Gly Asn Gly Cys[0138] 245 250 255[0139] Leu Met Ala Pro Glu Val Ser Thr Ala Arg Pro Gly Pro Arg Ala Val[0140] 260 265 270

[0141] Ile Asp Tyr Ser Lys Ala Asp Ala Trp Ala Val Gly Ala Ile Ala Tyr[0142] 275 280 285

[0143] Glu Ile Phe Gly Leu Val Asn Pro Phe Tyr Gly Gln Gly Lys Ala His[0144] 290 295 300

[0145] Leu Glu Ser Arg Ser Tyr Gln Glu Ala Gln Leu Pro Ala Leu Pro Glu[0146] 305 310 315 320[0147] Ser Val Pro Pro Asp Val Arg Gln Leu Val Arg Ala Leu Leu Gln Arg[0148] 325 330 335[0149] Glu Ala Ser Lys Arg Pro Ser Ala Arg Val Ala Ala Asn Val Leu His[0150] 340 345 350

[0151] Leu Ser Leu Trp Gly Glu His Ile Leu Ala Leu Lys Asn Leu Lys Leu[0152] 355 360 365

[0153] Asp Lys Met Val Gly Trp Leu Leu Gln Gln Ser Ala Ala Thr Leu Leu[0154] 370 375 380

[0155] Ala Asn Arg Leu Thr Glu Lys Cys Cys Val Glu Thr Lys Met Lys Met[0156] 385 390 395 400[0157] Leu Phe Leu Ala Asn Leu Glu Cys Glu Thr Leu Cys Gln Ala Ala Leu[0158] 405 410 415[0159] Leu Leu Cys Ser Trp Arg Ala Ala Leu

[0160] 420 425