高温木聚糖酶的制备方法

摘要

本发明涉及生物技术领域。本高温木聚糖酶的制备方法由以下步骤组成：一、粗酶液的制备：将Thermobifida halotolerans YIM 90462T以体积百分比5-10％的接种量接入液体种子培养基中，振荡培养，以体积百分比5-10％的转接于液体发酵培养基中，得粗酶液；二、用截留分子量为10KDa的超滤膜包将粗酶液的体积浓缩至原来的1/6；三、浓缩后的酶液加硫酸铵至50％饱和度，离心取沉淀，溶解在缓冲液中；四、将所得液离心取上清液，加到pH8.0、0.3M硫酸铵的Tris-HCl缓冲液平衡好的Butyl-Sepharose层析柱；五、将所得液离心取上清液，加到pH8.0、0.3M硫酸铵的Tris-HCl缓冲液平衡好的Phenyl-Sepharose层析柱，用无硫酸铵pH8.0的Tris-HCl缓冲液洗脱；六、加到pH8.0的Tris-HCl缓冲液平衡好的Q-Sepharose层析柱，将洗脱峰按保留时间的先后收集，保留有木聚糖酶活性的部分。最终获得酶活活力为573U/ml，纯化收率为9％。

权利要求

1.一种高温木聚糖酶的制备方法，其特征在于由以下步骤组成：

T

一、粗酶液的制备：将Thermobifida halotolerans YIM 90462 以5-10％的体积百分比的接种量接入液体种子培养基中，在37～45℃的条件下振荡培养至指数生长期，将处于指数生长期的菌液以5-10％的体积百分比的接种量转接于液体发酵培养基中，所述的液体发酵培养基中含有质量体积百分比为0.1-2％的AVICEL，在37～45℃培养至稳定期初期，将发酵液离心，取上清液，滤纸过滤，得粗酶液；

二、用截留分子量为10KDa的超滤膜包将粗酶液的体积浓缩至原来的1/6；

三、浓缩后的酶液加硫酸铵至30％饱和度，离心取上清液，继续加硫酸铵至50％饱和度，离心取沉淀，溶解在pH8.0、0.3M硫酸铵的Tris-HCl缓冲液中；

四、将步骤(三)所得液离心取上清液，加到pH8.0、0.3M硫酸铵的Tris-HCl缓冲液平衡好的Butyl-Sepharose层析柱，将透过峰按保留时间的先后分别收集，直至缓冲液流过

8-10个层析柱体积，保留有木聚糖酶活性的透过峰酶液部分；

五、将步骤(四)所得液离心取上清液，加到pH8.0、0.3M硫酸铵的Tris-HCl缓冲液平衡好的Phenyl-Sepharose层析柱，用无硫酸铵pH8.0的Tris-HCl缓冲液洗脱，收集所有洗脱峰组分；

六、将步骤(五)所得液离心取上清液，加到pH8.0的Tris-HCl缓冲液平衡好的Q-Sepharose层析柱，用含NaClpH8.0的Tris-HCl缓冲液洗脱，首先使洗脱液电导达到

30mS/cm，将洗脱峰按保留时间的先后收集，直至缓冲液流过5-10个层析柱体积，保留有木聚糖酶活性的部分，即为本发明产品。

说明书

高温木聚糖酶的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域。

背景技术

[0002] 木聚糖是一种半纤维素，从含量上说是第二大的天然多糖。木聚糖类半纤维素是一类可再生而又亟待开发利用的碳水化合物，经生物降解后所产生的木糖和少量其它单糖，可以用作基本碳源生产各种发酵产品，包括有机酸、氨基酸、单细胞蛋白、糖醇、工业酶类、溶剂或燃料醇。木聚糖酶系主要包括两种酶，一种是β-1，4-木聚糖酶，另一种是β-木聚糖酶，二者共同作用可将木聚糖降解成单糖。木聚糖酶在生物转化、食品、医药、能源、造纸、饲料工业中具有重要作用。能产生木聚糖酶的微生物有很多种：真菌、细菌、放线菌均可产生木聚糖酶等。根据国内外研究报道，产生木聚糖酶的放线菌主要有Streptomyces lividans、Thermobifidafusca等；细菌主要有Bacillus subtilis、Pseudomonas fluorescents等。产木聚糖酶真菌主要有Aspergillusniger、Aspergillus nidulans、Aspergillus phoenicis、Trichoderma reesei、Trichoderma koningii.[0003] 不同种(属)的所微生物产生的木聚糖酶理化性质各不相同，分子量在9500-243000道尔顿、等电点在3.6-10.3都有分布。酶活最适温度一般在50℃左右，最适pH值跟其微生物来源的不同而不同，多数为pH 4.0-6.0，产碱性木聚糖酶的微生物较少。

[0004] 不同种(属)的微生物产木聚糖酶的能力差异也很大。以分批液体发酵中每毫升培养液所产生的木聚糖酶活做比较。国外文献报道中，Samain E等人报道的Bacillus sp.XE产木聚糖酶最高活力为380IU/ml(1997，Journal of Biotechnology 58，71-78)；Dhillon A等人报道的Bacillus circulans AB 16最高产酶活力为55IU/ml(2000，Process Biochemistry，35，849-856)；kohli U 等 人 报 道 的 Thermoactinomyces thalphilus subgroup C.的最高酶活为42IU/ml(2001，Enzyme and Microbial Technology 28，
606-610)。国内报道中，曲音波等人报道的由Bacillus pumilus A30产生木聚糖酶活力最高，为431IU/ml(2000，中国生物化学与分子生物学报)。

[0005] 不同微生物产木聚糖酶的温度耐受性差异很大。因为耐热或耐高温木聚糖酶在工业应用中有很多优点，所以近年来关于这方面的专利文献报道较多。如CN1143387公开了一种热稳定性木聚糖酶，介绍的木聚糖酶在80℃以上有活性。CN00814240.8公开了改进G11家族木聚糖酶的热稳定性的方法，并且扩展了其pH稳定性范围。中国专利申请号200710065854.8公开了一种“基因重组毕赤酵母生产耐高温木聚糖酶的方法”，是从黑曲霉(Aspergillusnigervarniger strain N402)中分离出木聚糖酶基因，在真核表达系统毕赤酵母中高效表达。使用了黑曲霉Aspergillus nigervarniger strain N402木聚糖酶基因，采用了毕赤酵母表达载体PGAP Z alphaA和宿主菌株巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)SMD1168、GS115，所构建的基因工程酵母具有生产耐高温木聚糖酶的能力，所构建的基因工程酵母除具有宿主菌株SMD1168和GS115的形态、遗传和生理生化特征外，还包含黑曲霉Aspergillus nigervarnigerstrain N402木聚糖酶基因，具有生产耐高温木聚糖酶的能力。

[0006] 工业上，木聚糖酶已经广泛的应用于纸浆的漂白。在漂白过程中，需要具有耐高温、耐碱以及分子量低的木聚糖酶。虽然，可以产生木聚糖酶的微生物很多，但由于绝大多数微生物的木聚糖酶为中低温或偏酸性，在工业应用上受到了很大限制。因而，对具有这些性质的木聚糖酶的开发与研究就显得十分必要了。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供一种由微生物菌种发酵液产生、分离、纯化制备高温木聚糖酶的方法。

[0008] 本发明所述的高温木聚糖酶的制备方法由以下步骤组成：

[0009] 一、粗酶液的制备：将Thermobifida halotolerans YIM 90462T以5-10％的体积百分比的接种量接入液体种子培养基中，在37～45℃的条件下振荡培养至指数生长期，将处于指数生长期的菌液以5-10％的体积百分比的接种量转接于液体发酵培养基中，在37～45℃培养至稳定期初期，将发酵液离心，取上清液，滤纸过滤，得粗酶液；

[0010] 三、用截留分子量为10KDa的超滤膜包将粗酶液的体积浓缩至原来的1/6；

[0011] 三、浓缩后的酶液加硫酸铵至30％饱和度，离心取上清液，继续加硫酸铵至50％饱和度，离心取沉淀，溶解在pH8.0、0.3M硫酸铵的Tris-HCl缓冲液中；

[0012] 四、将步骤(三)所得液离心取上清液，加到pH8.0、0.3M硫酸铵的Tris-HCl缓冲液平衡好的Butyl-Sepharose层析柱，将透过峰按保留时间的先后分别收集，直至缓冲液流过8-10个层析柱体积，保留有木聚糖酶活性的透过峰酶液部分；

[0013] 五、将步骤(四)所得液离心取上清液，加到pH8.0、0.3M硫酸铵的Tris-HCl缓冲液平衡好的Phenyl-Sepharose层析柱，用无硫酸铵pH8.0的Tris-HCl缓冲液洗脱，收集所有洗脱峰组分；

[0014] 六、将步骤(五)所得液离心取上清液，加到pH8.0的Tris-HCl缓冲液平衡好的Q-Sepharose层析柱，用含NaClpH8.0的Tris-HCl缓冲液洗脱，首先使洗脱液电导达到30mS/cm，将洗脱峰按保留时间的先后收集，直至缓冲液流过5-10个层析柱体积，保留有木聚糖酶活性的部分，即为本发明产品。

[0015] 本发明步骤一所述的Thermobifida halotolerans YIM 90462T是耐盐高温双歧菌(刊登于Thermobifida halotolerans sp.nov.，isolated from a salt mine sample，and emended description ofthe genus hermobifida Yang et al.Int J SystEvol Microbiol.2008；58：1821-1825)。所述的液体种子培养基和液体发酵培养基均可以采用现有培养基，但在液体发酵培养基中应含有质量体积百分比为0.1-2％(w/v)的AVICEL，只有这样才能保证本发明所述酶的产生。所述的指数生长期为2-3天，所述的稳定期初期为5-7天，当培养至稳定期初期时即为产酶高峰期。每毫升发酵液活性可达7U。

[0016] 上述步骤四、六中所涉及的木聚糖酶活性测定方法参考文献M.J.Bailey，P.Biely，K.Poutanen，Journal of Biotechnology 23(1992)257-270。具体方法为准确称取0.50g的桦木木聚糖溶解于50ml不同pH6.0柠檬酸-磷酸二氢钠缓缓冲液中。取上述底物溶液80μl装于Eppendorf管中，加入20μl合适的稀释酶液，以灭活的酶液为对照。70℃反应30min。反应结束后，迅速加入DNS测定还原糖浓度。DNS法测定还原糖浓度参考文献Use ofdinitrosalicylic acid reagentfor determination of reducing sugar.ANALYTICAL CHEMISTRY.1 959。

[0017] 本发明所述的由耐盐高温双歧菌制备得到的高温木聚糖酶的优点是在70-80℃下具有较高的酶活力，在造纸、生物转化行业有一定的工业应用价值；全部分离纯化过程中均用一种缓冲液(pH8.0 50mMTris-HCl)，且分离纯化过程简单易行。

[0018] 本发明所述的高温木聚糖酶，具有以下酶学性质：

[0019] 1、耐盐高温双歧菌产高温木聚糖酶最适酶活温度为80℃，纯化收率在9％以上，每升发酵液经纯化可获得1159U纯酶。

[0020] 2、耐盐高温双歧菌产生的高温木聚糖酶在4～70℃之间活力较为稳定，达573.3U/ml，在70℃保温2小时，还可保持80％以上的酶活力，达458.6 U/ml；当温度超过
75℃时，酶活力下降很快，在75℃保温120min会导致酶活力下降近80％，达1 14.6 U/ml；
值得注意的是，木聚糖酶在90℃保温40min，酶活仍可以保存原来的30％，达171.99 U/ml，表明耐盐高温双歧菌产木聚糖酶属于典型的高温木聚糖酶。

[0021] 3、耐盐高温双歧菌高温木聚糖酶最适反应pH为6.0，在pH小于4或大于10时，酶活力较低。

[0022] 4、耐盐高温双歧菌产高温木聚糖酶在pH6.0～10.0之间酶活力稳定，在pH6.0～10.0的缓冲液中保温过夜，其残余酶活力均在80％以上，达458.6 U/ml。

[0023] 5、Mn2+、K+、Ba2+、Fe2+对耐盐高温双歧菌高温木聚糖酶有激活作用，Li+、Cd2+、Mg2+、2+ 2+ 2+ + 2+ 2+ 3+ 3+ 2+ 2+ 2+
Zn 、Mn 、Ca 、Na、Pb 、Co 、Al 和Fe 对酶作用不明显，Ni 、Cu 、Hg 对酶有显著的抑制作用。

[0024] 6、变性剂SDS对耐盐高温双歧菌高温木聚糖酶有明显的抑制作用，鳌合剂EDTA和丝氨酸蛋白酶专一抑制剂苯甲基磺酰氟化物(PMSF)对耐盐高温双歧菌产高温木聚糖酶没有抑制作用，表明了耐盐高温双歧菌产高温木聚糖酶对金属离子没有依赖性且其活性中心不含有丝氨酸。

附图说明

[0025] 图1为耐盐高温双歧菌产高温木聚糖酶的反应温度和相对活性的关系曲线。

[0026] 图2为耐盐高温双歧菌产高温木聚糖酶的反应pH和相对活性的关系曲线。

[0027] 图3为耐盐高温双歧菌产高温木聚糖酶的热稳定性曲线。

[0028] 图4为耐盐高温双歧菌产高温木聚糖酶的pH稳定性曲线。

[0029] 上述图2中：

[0030] ◆ 表示pH3.0、3.6、4.8 醋酸-醋酸钠缓冲液。

[0031] ■ 表示pH4、5、6、7、7.6 柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液。

[0032] ▲ 表示pH 7.5、8.5 Tris-HCl缓冲液。

[0033] ● 表示pH9、10 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。

具体实施方式

[0034] 实施例1、

[0035] 一、粗酶液的制备：将Thermobifida halotolerans YIM 90462T以接种量10％(体积百分比)接入液体种子培养基中，在50℃的条件下振荡培养36小时至指数生长期，将处于指数生长期的菌液以接种量10％(体积百分比)转接于液体发酵培养基中，在37～45℃培养至5-7天至稳定期初期即为产酶高峰期，将发酵液离心，取上清液，滤纸过滤，得粗酶液；

[0036] 二、用截留分子量为10KDa的超滤膜包将粗酶液的体积浓缩至原来的1/6；

[0037] 三、浓缩后的酶液加硫酸铵至30％饱和度，离心取上清液，继续加硫酸铵至50％饱和度，离心取沉淀，溶解在pH8.0、0.3M硫酸铵的Tris-HCl缓冲液中；

[0038] 四、将步骤(三)所得液离心取上清液加到pH8.0、0.3M硫酸铵的Tris-HCl缓冲液平衡好的Butyl-Sepharose层析柱，将透过峰按保留时间的先后每四毫升收集一管，直至缓冲液流过10个层析柱体积，按照参考文献Journal of Biotechnology 23(1992)257-270中的方法对所收集的各管中的酶液进行木聚糖酶测定，保留木聚糖酶酶液部分；

[0039] 五、将步骤(四)所得液离心取上清液加到pH8.0、0.3M硫酸铵的Tris-HCl缓冲液平衡好的Phenyl-Sepharose层析柱，用无硫酸铵pH8.0的Tris-HCl缓冲液洗脱，收集所有洗脱峰组分；

[0040] 六、将步骤(五)所得液离心取上清液加到pH8.0的Tris-HCl缓冲液平衡好的Q-Sepharose层析柱，用含NaClpH8.0的Tris-HCl缓冲液洗脱，首先使洗脱液电导达到30mS/cm，将洗脱峰按保留时间的先后每四毫升收集一管，直至缓冲液流过10个层析柱体积，保留有木聚糖酶活性的部分，即为本发明产品。

[0041] 通过对本产品的底物特异性研究，不同的底物分别为桦木木聚糖，羧甲基纤维素，PNPG(4-Nitrophenyl β-D-glucopyranoside)和AVICEL(微晶纤维素)，发现其木聚糖酶活性远远高于其纤维素酶活性，可以确定本产品是典型的木聚糖酶。

[0042] 底物特异性试验中，纤维素酶活性测定方法参考文献Methods for Measuring CellulaseActivities.T.M.WOOD et al.METHODS IN ENZYMOLOGY，VOL.160。木聚糖酶活性参考文献Journal of Biotechnology 23(1992)257-270。

[0043] 在步骤一中的所述的种子培养基的组成：

[0044] 10×大量盐溶液 100ml

[0045] 50×微量量盐溶液 20ml

[0046] Peptone 5g

[0047] 加水定容至1L。

[0048] 上面提到的10×大量盐溶液配方为：

[0049] NaCl 15g

[0050] (NH4)2SO4 31g

[0051] Na2HPO4 91g

[0052] 加水定容至1L。

[0053] 上面提到的50×微量量盐溶液配方为：

[0054] EDTA 0.5g

[0055] MgSO4 2.00g

[0056] ZnSO4 0.08g

[0057] FeSO4 0.2g

[0058] MnSO4 0.15g

[0059] CaCl2 0.2g

[0060] 加水定容至200ml。

[0061] 在步骤一中的所说的发酵培养基的组成：

[0062] Peptone 10g

[0063] Yeast 5g

[0064] NaCl 10g

[0065] AVICEL(微晶纤维素sigma公司) 1-20g

[0066] 加水定容至1L。