甲酯化鲁米诺酶促化学发光底物系统转让专利
申请号 : CN200810052361.5
文献号 : CN101526479B
文献日 : 2010-09-15
发明人 : 赵学勤 , 徐嘉辙
申请人 : 天津遄赫工贸有限公司
摘要 :
本发明公开了一种甲酯化鲁米诺酶促化学发光底物系统，由A试剂和B试剂组成，所述A试剂由0.90mM的甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺和pH为9.6的0.01M-0.05M碳酸盐缓冲液组成，所述B试剂由pH为9.6的0.01M-0.05M碳酸盐缓冲液、0.05mM-0.1mM过氧化脲和0.15mM-0.30mM过氧苯酚组成。本发明的甲酯化鲁米诺酶促化学发光底物系统的发光强度在4～6个量级之间与测定物质浓度间呈现良好的线性关系，在较广的检测范围内确保了高灵敏度，完全能满足临床检测之需。
权利要求 :
1.一种甲酯化鲁米诺酶促化学发光底物系统，其特征是由A试剂和B试剂组成，所述A试剂由0.90mM的甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺和pH为9.6的0.01M-0.05M碳酸盐缓冲液组成，所述B试剂由pH为9.6的0.01M-0.05M碳酸盐缓冲液、0.05mM-0.1mM过氧化脲和0.15mM-0.30mM过氧苯酚组成。
2.根据权利要求1所述的一种甲酯化鲁米诺酶促化学发光底物系统，其特征是所述B试剂由pH为9.6的0.03M碳酸盐缓冲液、0.07mM过氧化脲和0.20mM过氧苯酚组成。
说明书 :
技术领域
本发明涉及一种酶促化学发光底物，特别是涉及一种甲酯化鲁米诺酶促化学发光底物系统。
发明背景
近年来随着分子生物学，基础免疫学和免疫化学等学科的进展以及应用现代高新技术建立的仪器分析日趋发展，免疫标记技术也不断完善和更新；放射免疫，酶联免疫技术已逐步被免疫发光技术所取代。现今，酶促底物发光技术已成为推广及应用最快的免疫分析方法。酶促底物发光技术是将酶联免疫方法中的显色底物更换为发光底物，与相应的酶发生氧化还原反应，产生光量子；通过计数光量子来确定待检测物质的量。用于酶促发光法中的首选标记物即辣根过氧化物酶(HRP)，均以鲁米诺(Luminol)类物质作为发光底物，但必需加入增强剂(液)及催化剂等多种成分以解决光信号弱，灵敏度底和量程短的问题，经查阅国内，外文献后发现，大多数研究者都是在增强剂上进行改进以提高技术水平，少有对发光底物系统，尤其对不需要增强剂的底物系统进行研究。酶促发光免疫检测技术中关键试剂即发光底物，其原理是底物在特定条件下，经标记在抗原或抗体上的辣根过氧化物酶(HRP)催化，发生氧化还原反应，产生光子，经化学发光仪测量光信号的强度，以标准物发光信号的强度为纵坐标(Y轴)以标准物浓度为横坐标(X轴)得以检测被测物质的含量。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种不需要增强剂就可以应用于化学发光酶免疫测定技术中的甲酯化鲁米诺酶促化学发光底物系统。
本发明的技术方案概述如下：
一种甲酯化鲁米诺酶促化学发光底物系统，由A试剂和B试剂组成，所述A试剂由0.90mM的甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺和pH为9.6的0.01M-0.05M碳酸盐缓冲液组成，所述B试剂由pH为9.6的0.01M-0.05M碳酸盐缓冲液、0.05mM-0.1mM过氧化脲和0.15mM-0.30mM过氧苯酚组成。
优选的是：所述B试剂由pH为9.6的0.03M碳酸盐缓冲液、0.07mM过氧化脲和0.20mM过氧苯酚组成。
本发明的优点是：
1.检测范围广，本发明的甲酯化鲁米诺酶促化学发光底物系统的发光强度在4～6个量级之间与测定物质浓度间呈现良好的线性关系，在较广的检测范围内确保了高灵敏度，完全能满足临床检测之需。
2.灵敏度高，本发明的底物系统具有高信号强度和低背景，且无需其它的信号增强剂。
3.光信号持续时间长，该本发明的底物系统的光信号稳定时间可持续2.5小时，为临床检测中的多次重复测量提供了可靠的保证。
4.减少抗体用量2-3倍，极大的保证了应用本发明制备的试剂盒系列的低成本。
5.分析方法简便快速。
6.与现有的化学发光底物相比具有组成成份简单，价格低廉，制备方法简单。
将本发明的一种甲酯化鲁米诺酶促化学发光底物系统，应用于化学发光酶免疫测定技术中，拟建立一系列新的临床检测试剂盒。
本发明的技术方案概述如下：
一种甲酯化鲁米诺酶促化学发光底物系统，由A试剂和B试剂组成，所述A试剂由0.90mM的甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺和pH为9.6的0.01M-0.05M碳酸盐缓冲液组成，所述B试剂由pH为9.6的0.01M-0.05M碳酸盐缓冲液、0.05mM-0.1mM过氧化脲和0.15mM-0.30mM过氧苯酚组成。
优选的是：所述B试剂由pH为9.6的0.03M碳酸盐缓冲液、0.07mM过氧化脲和0.20mM过氧苯酚组成。
本发明的优点是：
1.检测范围广，本发明的甲酯化鲁米诺酶促化学发光底物系统的发光强度在4～6个量级之间与测定物质浓度间呈现良好的线性关系，在较广的检测范围内确保了高灵敏度，完全能满足临床检测之需。
2.灵敏度高，本发明的底物系统具有高信号强度和低背景，且无需其它的信号增强剂。
3.光信号持续时间长，该本发明的底物系统的光信号稳定时间可持续2.5小时，为临床检测中的多次重复测量提供了可靠的保证。
4.减少抗体用量2-3倍，极大的保证了应用本发明制备的试剂盒系列的低成本。
5.分析方法简便快速。
6.与现有的化学发光底物相比具有组成成份简单，价格低廉，制备方法简单。
将本发明的一种甲酯化鲁米诺酶促化学发光底物系统，应用于化学发光酶免疫测定技术中，拟建立一系列新的临床检测试剂盒。
附图说明
图1为不同辣根过氧化物酶(HRP)化学发光底物系统发光信号强度和持续时间比较。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种甲酯化鲁米诺酶促化学发光底物系统，由A试剂和B试剂组成，所述A试剂由0.90mM的甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺和pH为9.6的0.03M碳酸盐缓冲液组成，所述B试剂由pH为9.6的0.03M碳酸盐缓冲液、0.07mM过氧化脲和0.20mM过氧苯酚组成。
实施例2
一种甲酯化鲁米诺酶促化学发光底物系统，由A试剂和B试剂组成，所述A试剂由0.90mM的甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺和pH为9.6的0.01M碳酸盐缓冲液组成，所述B试剂由pH为9.6的0.01M碳酸盐缓冲液、0.08mM过氧化脲和0.15mM过氧苯酚组成。
实施例3
一种甲酯化鲁米诺酶促化学发光底物系统，由A试剂和B试剂组成，所述A试剂由0.90mM的甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺和pH为9.6的0.05M碳酸盐缓冲液组成，所述B试剂由pH为9.6的0.05M碳酸盐缓冲液、0.05mM过氧化脲和0.30mM过氧苯酚组成。
实施例4
一种甲酯化鲁米诺酶促化学发光底物系统，由A试剂和B试剂组成，所述A试剂由0.90mM的甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺和pH为9.6的0.03M碳酸盐缓冲液组成，所述B试剂由pH为9.6的0.03M碳酸盐缓冲液、0.1mM过氧化脲和0.20mM过氧苯酚组成。
本发明所用的甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺制备可以按本领域公知常识进行制备，其中之一的方法是：
(一)试剂：
1甲醇
2镁带：需要用6NHC处理镁带，或用砂纸打亮，称取2.5克
3碘片
4浓硫酸
5浓盐酸
61N氢氧化钠
7N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺
(二)操作步骤：
1、无水甲醇的制备：将镁带2.5克，碘片0.3克加入圆底烧瓶中，再加入30ml甲醇，可见发生沸腾反应，Mg在I的引发下与水作用生成Methoxide(甲醇盐)。反应1小时后，再加入700m1甲醇，加热沸腾回流反应30分钟后，蒸馏，收集流出液即为无水甲醇。
2、N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺的甲酯化：采用蒸馏回流反应装置附加安全瓶将N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺，无水甲醇，浓硫酸，浓盐酸及1N氢氧化钠分别以适当的浓度加入到不同反应瓶中，经甲酯化反应后，在20℃-30℃下放置18-30小时，使N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺完全甲酯化，将产物减压抽干，加入5ml无水甲醇再减压抽干，再加入5ml无水甲醇减压抽干，获得干粉即为甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺，在室温下可长期保存。
效果验证数据：检测灵敏度：0.1pg/ml 信号持续时间：2小时
抗血清稀释度可达：1∶20万
保质期：暂定9个月
保存条件：室温
优点：本公司所发明的甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺作为酶发光底物与当前现有的产品比较有下述优点：
1灵敏度高
2不需要增强剂
3持续发光时间长
4低的背景信号
以上特点可通过图1显示。
图1中
0.90mM甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺发光信号
加入增强剂的1.5mM N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺发光信号
加入增强剂的0.9mM N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺发光信号
无增强剂的1.5mM N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺发光信号
1.5mM N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺背景信号
0.90mM甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺背量信号
实施例1
一种甲酯化鲁米诺酶促化学发光底物系统，由A试剂和B试剂组成，所述A试剂由0.90mM的甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺和pH为9.6的0.03M碳酸盐缓冲液组成，所述B试剂由pH为9.6的0.03M碳酸盐缓冲液、0.07mM过氧化脲和0.20mM过氧苯酚组成。
实施例2
一种甲酯化鲁米诺酶促化学发光底物系统，由A试剂和B试剂组成，所述A试剂由0.90mM的甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺和pH为9.6的0.01M碳酸盐缓冲液组成，所述B试剂由pH为9.6的0.01M碳酸盐缓冲液、0.08mM过氧化脲和0.15mM过氧苯酚组成。
实施例3
一种甲酯化鲁米诺酶促化学发光底物系统，由A试剂和B试剂组成，所述A试剂由0.90mM的甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺和pH为9.6的0.05M碳酸盐缓冲液组成，所述B试剂由pH为9.6的0.05M碳酸盐缓冲液、0.05mM过氧化脲和0.30mM过氧苯酚组成。
实施例4
一种甲酯化鲁米诺酶促化学发光底物系统，由A试剂和B试剂组成，所述A试剂由0.90mM的甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺和pH为9.6的0.03M碳酸盐缓冲液组成，所述B试剂由pH为9.6的0.03M碳酸盐缓冲液、0.1mM过氧化脲和0.20mM过氧苯酚组成。
本发明所用的甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺制备可以按本领域公知常识进行制备，其中之一的方法是：
(一)试剂：
1甲醇
2镁带：需要用6NHC处理镁带，或用砂纸打亮，称取2.5克
3碘片
4浓硫酸
5浓盐酸
61N氢氧化钠
7N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺
(二)操作步骤：
1、无水甲醇的制备：将镁带2.5克，碘片0.3克加入圆底烧瓶中，再加入30ml甲醇，可见发生沸腾反应，Mg在I的引发下与水作用生成Methoxide(甲醇盐)。反应1小时后，再加入700m1甲醇，加热沸腾回流反应30分钟后，蒸馏，收集流出液即为无水甲醇。
2、N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺的甲酯化：采用蒸馏回流反应装置附加安全瓶将N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺，无水甲醇，浓硫酸，浓盐酸及1N氢氧化钠分别以适当的浓度加入到不同反应瓶中，经甲酯化反应后，在20℃-30℃下放置18-30小时，使N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺完全甲酯化，将产物减压抽干，加入5ml无水甲醇再减压抽干，再加入5ml无水甲醇减压抽干，获得干粉即为甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺，在室温下可长期保存。
效果验证数据：检测灵敏度：0.1pg/ml 信号持续时间：2小时
抗血清稀释度可达：1∶20万
保质期：暂定9个月
保存条件：室温
优点：本公司所发明的甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺作为酶发光底物与当前现有的产品比较有下述优点：
1灵敏度高
2不需要增强剂
3持续发光时间长
4低的背景信号
以上特点可通过图1显示。
图1中
0.90mM甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺发光信号
加入增强剂的1.5mM N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺发光信号
加入增强剂的0.9mM N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺发光信号
无增强剂的1.5mM N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺发光信号
1.5mM N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺背景信号
0.90mM甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-异鲁米诺背量信号