制备用于缓释的、具有改善的可分散性和可注射性的微球的方法

摘要

公开了一种使用喷雾干燥制备缓释微球的方法，所述微球包含作为载体的生物可降解聚合物和药物。所述方法包括制备含有生物可降解聚合物、药物和溶剂的溶液、悬液或乳液；喷雾干燥所述溶液、悬液或乳液；并在含有聚乙烯醇的水溶液中悬浮喷雾干燥的微球，以除去残余溶剂并提高所述微球表面的亲水性。所述方法能够制备这样的微球：其具有高药物封装效率、几乎没有由于残余溶剂引起的毒性问题并具有良好的可注射性。当给予身体时，依据本发明制备的微球以持续的方式在预先确定的时间段内释放有效浓度的药物，并因此被用于疾病的治疗。

权利要求

1.制备缓释微球的方法，所述方法通过含有生物可降解聚合物、药物和溶剂的溶液、悬液或乳液的喷雾干燥来获得喷雾干燥的微球，特征在于所述方法包括：在含有浓度范围重量体积比为0.05-10％的聚乙烯醇的水溶液中分散所述喷雾干燥的微球5分钟或更长时间，以除去残余溶剂并提高所述微球的分散性；和回收、清洗并冷冻干燥所得微球，其中在分散于含聚乙烯醇的水溶液中时，聚乙烯醇以重量计0.02％到1.0％的量被包衣在所述缓释微球上，其中所述生物可降解聚合物是聚交酯或丙交酯/乙交酯共聚物，并且

其中所述药物选自亮丙瑞林、牛血清白蛋白和奥曲肽。

2.依据权利要求1所述的方法，其中在分散于含聚乙烯醇的水溶液中时，所述缓释微球中的所述残余溶剂被额外除去20％以上。

3.加载药物的缓释微球，其通过下述制备：将含有生物可降解聚合物、药物和溶剂的溶液、悬液或乳液喷雾为液滴并干燥所述液滴以除去所述溶剂并获得喷雾干燥的微球，特征在于在含有浓度范围重量体积比为0.05-10％聚乙烯醇的水溶液中分散所述喷雾干燥的微球5分钟或更长时间，以便以重量计0.02％到1.0％的量将聚乙烯醇包衣在所述微球上，其中所述生物可降解聚合物是聚交酯或丙交酯/乙交酯共聚物，并且其中所述药物选自亮丙瑞林、牛血清白蛋白和奥曲肽。

说明书

制备用于缓释的、具有改善的可分散性和可注射性的微球

的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及制备缓释微球(sustained release microsphere)的方法，所述微球包含作为载体的生物可降解聚合物和药物。这样的微球是可注射的缓释制剂，其能够实现药物的缓释和均匀释放，以便在皮下或肌肉注射后在体内保持其生物活性。

背景技术

[0002] 多种方法已经被用于将生物活性剂封装进聚合物的微球中，用于缓释。它们中大多数基于相分离(USP4,673,595；EP52，510)、熔融挤出后低温粉碎(cryopulverization)(USPs5,134,122；5,192,741；5,225,205；5,431,348；5,439,688；5,445,832 和5,776,885)、复乳蒸发(double emulsion evaporation)(w/o/w，水/油/水)(美国专利 号 4,652,441；4,711,782；4,954,298；5,061,492；5,330,767；5,476,663；5,480,656；
5,611,971；5,631,020和5,631,021)、单乳蒸发(o/w，油/水)(美国专利号4,389,330和5,945,126；Shameem M，Lee Hee Yong，Deluca P.P.，AAPS Pharmsci.，1(3)article 7，
1999；Kostanski J.W.，Pharm.Dev.Tech.5，585-596，2000)和喷雾干燥(IE920956)。

[0003] 相分离封装是用于制备微球的方法，其中生物可降解聚合物被溶解在过量的有机溶剂中，如二氯甲烷，并且溶解于少量水的药物在搅拌的情况下被加入该聚合物溶液。硅油随后以恒定的速率被加入该聚合物-药物混合物以形成早期微球，并且过量的非溶剂如三氯氟甲烷被加入该溶液以从早期微球中提取有机溶剂。固化的微球通过过滤回收，并在加压下干燥。然而，该相分离方法在以下方面有问题。由于有毒溶剂如二氯甲烷不能通过加压干燥充分除去，残余溶剂降低了制剂的稳定性，并且当给予机体时也可对健康有害。并且，用于早期微球固化的非溶剂如氟利昂、己烷、庚烷、环己烷和三氯氟甲烷的过量使用在大量生产中不是成本有效的并引起严重的环境污染。

[0004] 比较而言，熔融挤出后低温粉碎允许有毒溶剂的最少使用。该方法是制备微球的方法，其中生物可降解聚合物与药物的混合物在高温下通过挤压机被熔融挤出并在低温下被粉碎。生物可降解聚合物-药物混合物可通过下述方法获得：使用搅拌器在诸如二氯甲烷的溶剂中均匀混合聚合物与药物并使用旋转蒸发器或真空干燥器除去有机溶剂；或在低温下低温研磨并细筛每种粉末且混合两种细粉。后一种情况不存在残余有毒溶剂的问题，因为在微球制备过程中没有使用有毒溶剂。然而，制备微粒的步骤不排除聚合物与药物之间相互作用、以及由于熔融挤出时的高温和高压引起药物变性、和由于低温粉碎过程中局部产生的热引起药物变性的可能性。该方法也难于用以制备具有均一尺寸因而容易注射的微球。

[0005] 除了残余溶剂、大量制备的困难和药物变性的问题外，这两种制备微球的方法还有另外的缺点，在于用于药物缓释的生物可降解聚合物是不亲水的，并因此在用于注射的水悬液中分散不良。

[0006] 水包油包水(water-in-oil-in-water)(w/o/w)复乳蒸发通常用于封装亲水药物如肽或蛋白质到聚合物微球中。在该W/O/W方法中，亲水药物被溶解在水中，并且该水相被分散到包含生物可降解聚合物的有机相中，以产生初级乳液(油包水)。该初级乳液被再次分散到含有乳化剂的次级水相中。单乳蒸发(水包油(o/w))通常用于亲脂药物的封装。在该O/W方法中，药物和生物可降解聚合物被共溶解在适当的有机溶剂(如甲醇和二氯甲烷)的混合物中，并且产生的溶液被分散在水相中。在两种乳液蒸发方法中，随着在聚合物分散在水相的过程中有机溶剂通过提取或蒸发除去，聚合物溶解度降低并因此固化形成微球。在这些方法中，技术上重要的因素是生物活性药物的封装效率。

[0007] 当分散在水相时，大多数亲水药物大量渗漏，导致低封装效率。为解决这个问题，Okada等在基于复乳蒸发的微球制备中采用了诸如明胶的材料。该材料提高了初级乳液的粘度并降低了药物(LHRH衍生物)向次级乳液中的扩散速率，产生增强的药物封装(Okada，H.和Toguchi，H.，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.，12，1-99，1995)。相似地，单乳蒸发方法也可以通过适当提高溶解在有机溶剂相中的生物可降解聚合物(PLGA)的浓度而增强药物的封装。典型地，由复乳蒸发制备的微球比由单乳蒸发制备的那些具有更多孔，并因此具有增大的表面积，导致相对高的药物初始释放速率。

[0008] 然而，用于制备微球的单乳和复乳蒸发法，和相分离法一样，具有以下缺点：去除用于溶解生物可降解聚合物的有机溶剂的困难；由于溶剂去除速率的变化引起的大量生产过程的困难；对用于提高初级乳液粘度的明胶的过敏反应；由于初级乳液制备过程中用于制备小微球的强剪切力使药物变性并失去其活性的可能性；有限的药物封装，等等。

[0009] 喷雾干燥法也已经被用于制备细微雾化的颗粒。在这种方法中，典型地，待干燥的材料溶液、或者生物可降解聚合物和药物均一地溶解在其中的悬液或乳液被供给到喷嘴，通过该喷嘴喷雾，并暴露于热空气以蒸发所用的溶剂。具体地，在制备缓释微球的情况下，制备的微球的药物释放速率极大地取决于生物可降解聚合物的组成或含量、添加剂的类型或含量、溶剂的组成等。除了上述加工参数外，影响微球的形态、尺寸或性质的其它参数可被用于控制药物的释放速率，所述参数包括喷出喷射溶液的喷嘴的类型(例如使用压缩空气雾化液滴的类型、当喷雾溶液流入高速旋转的盘时使用离心力雾化液滴的类型、使用振动器震动时产生的超声波雾化液滴的类型等)；喷雾溶液的供给速率；和干燥空气的温度、供给量和供给速率。此外，不像制备缓释微球的其它方法，喷雾干燥法是有利的，因为它提供了连续的过程，这促进了微球的生产并因此有利于将小规模生产转化为大规模生产。

[0010] 尽管喷雾干燥法具有允许微球大规模生产的优点，但它具有如下的缺点。使用的溶剂仅通过喷雾干燥不能充分去除。残余溶剂在长期储存中引起生物可降解聚合物稳定性方面的问题，导致微球药物释放曲线的变化。该方法的另一缺点是由于用于药物封装的生物可降解聚合物大部分是非亲水的，制备的微球悬浮差并因此难以准确给药。

[0011] 如上文所述，制备缓释微球的大多数常规方法采用有毒溶剂，并存在这样的问题，包括所用有毒溶剂的残余、微球尺寸不适合注射、微球差的可悬浮性和难于大量生产。

[0012] 本发明人旨在提供一种制备载有生物活性药物的生物可降解聚合物微球的方法，其通过解决前述问题容易进行大量生产。

发明内容

[0013] 技术问题

[0014] 因此，本发明的一个目的是提供一种方法，其用于制备包含生物可降解聚合物作为载体和活性药物的缓释微球，该微球容易大量生产、不含残余的有毒溶剂，这是制备缓释微球的传统方法的问题；该微球体具有高的药物封装效率，并具有适合注射的均一尺寸。

[0015] 技术方案

[0016] 本发明人进行了深入的研究，并发现，当通过喷雾干燥含有生物可降解聚合物、药物和溶剂的溶液、悬液或乳液获得的微球被悬浮在含有聚乙烯醇的水溶液中以除去残余溶剂时，该微球具有改善的可悬浮性和可注射性及高的药物封装效率，而没有残余的有毒溶剂，由此产生本发明。

[0017] 附图简述

[0018] 本发明的上述及其它目的、特征和其它优点将从以下详述与附图结合中更清楚地理解，其中：

[0019] 图1显示了依据本发明的制备实施例1制备的微球在水溶液中的分散/吸取(withdrawal)速率及可注射性，其中，在根据测试实施例1所述的方法进行测试之后，每一管中微球的吸取速率(图a)和每一管中平均吸取速率的偏差(图b)被测量；

[0020] 图2显示了雄性SD大鼠(n＝5)中血清睾酮的浓度，所述大鼠按测试实施例5所述被皮下注射单一剂量的制备实施例8中制备的加载亮丙瑞林的微球；和

[0021] 图3显示了雄性SD大鼠(n＝6)中血清奥曲肽的浓度，所述大鼠按测试实施例6所述被皮下注射单一剂量的制备实施例9中制备的加载奥曲肽的微球。

[0022] 本发明的最佳实施方式

[0023] 本发明涉及制备缓释微球的方法，其中含有生物可降解聚合物、药物和溶剂的溶液、悬液或乳液被喷雾干燥，并且由此获得的微球被分散在含有聚乙烯醇的水溶液中，由此更容易去除残余溶剂并且在给药时提高了该微球的可悬浮性。

[0024] 详细地，本发明涉及通过溶解和喷雾干燥生物可降解聚合物和药物、在溶解有聚乙烯醇的水溶液中悬浮由此获得的微球并回收、清洗和冷冻干燥该微球而制备缓释微球的方法，所述微球具有高药物封装效率、几乎没有残余溶剂并具有提高的可悬浮性。

[0025] 一方面，本发明提供了制备缓释微球的方法，包括向干燥室中喷雾含有生物可降解聚合物、药物和溶剂的溶液、悬液或乳液，并使用干燥空气干燥它以除去溶剂；和在含有聚乙烯醇的水溶液中分散喷雾干燥的微球，以除去残余溶剂并提高该微球的分散性。

[0026] 术语“生物可降解聚合物”，用在这里，是指当给予身体时，缓慢降解并因此对身体无害的聚合物。这类聚合物的实例包括聚交酯(PLA)、聚乙醇酸交酯(PGA)及其共聚物丙交酯/乙交酯共聚物(PLGA)、聚原酸酯、聚酸酐、聚羟丁酸、聚己酸内酯、聚碳酸烷酯(polyalkylcarbonate)、和它们的衍生物。

[0027] 术语“药物”，用在这里，包括具有生物活性的肽，例如抗癌剂、抗生素、退热剂、镇痛剂、抗炎剂、止咳化痰剂、镇静剂、抗溃疡剂、抗抑郁剂、抗过敏剂、抗糖尿病剂、抗高血脂剂、抗结核剂、激素药剂、骨代谢药剂、免疫抑制剂、血管生成抑制剂、避孕剂和类维生素药剂。特别地，生物活性肽或蛋白药物是优选的。具有生物活性的寡肽的实例包括胰岛素、生长抑素及其衍生物、生长激素、催乳素、促肾上腺皮质激素、黑素细胞刺激激素、促甲状腺素释放激素及其盐和衍生物、甲状腺刺激激素、促黄体生成激素、促卵泡成熟激素、血管加压素及其衍生物、催产素、降血钙素、副甲状腺激素、胰高血糖素、胃泌素、分泌素、肠促胰酶素、缩胆囊素、血管紧张素、人胎盘催乳素、人绒毛膜促性腺激素和脑啡肽及其衍生物。多肽的实例包括内啡肽、干扰素(α-型、β-型、γ-型)、白细胞介素、促吞噬素、促胸腺生成素、胸腺肽、胸腺刺激素、胸腺体液因子(THF)、血清胸腺因子及其衍生物、肿瘤坏死因子、集落刺激因子(CSF)、促胃动素、强啡肽、铃蟾肽、神经降压素、缓激肽、雨蛙肽、尿激酶、天冬酰胺酶、激肽释放酶、P物质、神经生长因子、凝血因子VIII和IX、溶菌酶、多粘菌素B、粘菌素、短杆菌肽、枯草杆菌肽、蛋白合成刺激肽、血管活性肠多肽、血小板衍生生长因子、生长激素释放因子、骨多形性蛋白、表皮生长因子和促红细胞生成素。

[0028] 在本发明中，包含聚乙烯醇的水溶液被使用，以在喷雾干燥后立即更有效地去除微球内的残余溶剂，并在给药时在注射溶液中很好地分散微球。该水溶液通过额外的清洗步骤除去，并最终在微球中残留低于1％的量。并且，当微球被悬浮在聚乙烯醇的水溶液中以去除残余溶剂时，残余溶剂的去除速度可通过改变悬液的温度来控制。使用这一特征，在小规模生产时，残余溶剂可在室温或环境温度下在短时间内被除去。在大规模生产时，该悬液被保持在低温下以低速去除残余溶剂，由此防止产物由于大量产物的延长操作时间而变质。

[0029] 在额外的分散步骤中，水溶液中聚乙烯醇的含量优选地为0.01-20％(w/v)，并且更优选地为0.05-10％(w/v)。聚乙烯醇具有的分子量为3,000到300,000，优选地5,000到100,000，并且具有75％到95％的水合率。留在微球表面的聚乙烯醇的量优选地为0.02-1％(w/v)，并且更优选地为0.05-0.5％(w/v)。

[0030] 术语“溶剂”，用在这里，是指能够溶解生物可降解聚合物和/或药物的物质。合适的溶剂可由本领域普通技术人员依据生物可降解聚合物的类型选择。冰醋酸是优选的。

[0031] 本发明包含在聚乙烯醇的水溶液中分散微球以提高微球的分散性的步骤。该分散步骤进行大约1分钟或更长的时间，以达到最佳效果。优选的分散时间是5分钟或更长。

[0032] 在本发明之前提交的专利申请(韩国专利申请10-2003-0023130)中，本发明人通过使用无毒溶剂均一地溶解生物可降解聚合物和药物，并喷雾干燥所得溶液，改善了药物封装效率和释放曲线，并提出喷雾干燥法有利于微球的大量生产。该喷雾干燥法具有优点，包括容易大量生产、低残余溶剂、高药物封装效率和理想的药物释放曲线；但具有缺点，包括由于微球中包含的聚合物的不亲水性，通过喷雾干燥获得的缓释微球在注射溶液中难以分散和悬浮，和要求用于去除残余溶剂的额外步骤以保证长期储存中微球的稳定性。因此，在本发明中，本发明人旨在解决这些缺点。

[0033] 使用双喷嘴喷雾干燥制备微球的传统方法在美国专利号5,622,657中公开。为提高聚合物微球的分散性——当通过喷雾干燥制备时所述微球易于彼此粘附或聚集，该引用的发明提供了使用两个或多个喷嘴、用防聚集剂包衣加载药物的微球的方法，其中含有生物活性物质的聚合物溶液和防止微球聚集的试剂的水溶液同时从不同的喷嘴中分别喷出。相似的方法在韩国专利号0177309中公开，该方法特征在于以与含有活性成分的生物可降解聚合物溶液的喷雾方向及干燥空气的流动方向相反的方向，喷雾其中溶解有水溶性分散剂的分散体，以便用该水溶性分散剂包衣部分或全部缓释微粒。该引用的发明旨在在使用喷雾干燥形成微球之后，立即喷雾一种用于防止微球聚集的水溶液来防止微球聚集，但存在下述缺点。由于微球在被喷雾干燥后立即用防聚集剂包衣，用于溶解制备微球所用聚合物的有毒溶剂大量留在微球中。此外，当微球被悬浮在用于给药的注射溶液中时，过量的分散剂被使用。而且，用在该引用的发明中的防聚集剂，如羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、甘氨酸、丙氨酸、明胶和胶原，没有提高注射溶液中的可悬浮性或可可注射性，导致不均一的剂量。

[0034] 另一方面，为了增强用于片制剂或药物颗粒的细粒的流动性并提高药物的溶解度，水溶性分散剂例如羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素和聚乙烯醇，可以约4到19wt％的量与待包含于形成的制剂中的药物一起喷雾干燥(D.Ermis，A.Yuksel，Preparation of spray-driedmicrospheres of indomethacin and examination of the effects of coating ondissolution rates，J.Microencapsulation，vol.16，No.3，3，315-324(1999))。在该文献中，水溶性分散剂被用于增强较差水溶性药物的溶解性，由此在数小时内溶解该药物；并提高药物颗粒的流动性，由此有助于加工诸如制片。聚乙烯醇已被登录为肠胃外给予动物时易于引发癌症的物质，并因此其残余量应该被控制(Carcinogenic Studies onWater-Soluble and Insoluble Macromolecules，Archives of Pathology，67，589-617，1959)。本发明人发现，当悬浮于聚合物溶液中的聚乙烯醇按上述文献所述被喷雾时，在身体中难于降解的聚乙烯醇的含量增加，并且初始药物释放速率显著增大。这样的高药物释放可能引起副作用，并可能导致缩短的药物释放时间，由此合适的治疗效果得不到保证。

[0035] 本发明人制备了这样的微球，其中残余溶剂被额外地除去，并且微球通过以下过程具有提高的可注射性，所述过程包括使用由本发明人在本发明之前开发的喷雾干燥法制备微球、在含有聚乙烯醇的水溶液中悬浮该微球和清洗并回收该微球。

[0036] 依据本发明制备包含具有生物活性的药物的生物可降解聚合物微球的方法包括：通过喷雾干燥制备微球，在含有聚乙烯醇的水溶液中悬浮由此获得的微球，和回收、清洗并干燥该微球，该方法允许残余溶剂的进一步去除并提高了微球在给药时的可悬浮性，由此产生准确的药物给予和有效的疾病治疗。

[0037] 对本发明更好的理解可通过以下实施例获得，所述实施例被提出以便进行说明，但不应被解释为限制本发明。

[0038] 发明的实施方式

[0039] 制备实施例1：微球的制备和使用各种分散剂的后处理

[0040] PLGA微球使用装备超声波喷嘴(Sono-Tek，120kHz)的喷雾干燥器(SODEVA，法国)制备。生物可降解聚合物RG503H(Boehringer-Ingelheim，德国)和药物醋酸亮丙瑞林(PolypeptideLaboratories，丹麦)被使用。50g的RG503H和2.5g的醋酸亮丙瑞林在500ml冰醋酸(Yakuri Pure Chemicals，日本)中被均一溶解。该溶液用活塞泵以3ml/min的流速被输送。输送的溶液通过安装在喷雾器上部的超声喷嘴被喷雾进喷雾干燥器中，并在200℃用干燥空气干燥。其后，从旋风分离器中回收的微球以一定体积被取出，精确地称量，以50mg/ml的浓度加入到含有蒸馏水和1％(w/v)分散剂的水溶液中，并使用磁力搅拌器在室温下在其中悬浮1小时。所用的分散剂包括聚乙烯醇(Sigma，P-8136)、聚乙烯吡咯烷酮(Sigma，PVP-360)、人血清白蛋白(Sigma，A-1654)、聚乙二醇(Yakuri Pure Chemicals，
28123)、Tween80(Sigma，P-0343)、泊洛沙姆(Sigma，P-1300)、羧甲基纤维素钠(Sigma，C-5678)、明胶(Sigma，G-6650)、甘氨酸(Sigma，G-7126)和甘露醇(Sigma，M-8429)。使悬液通过真空过滤器。由此收集的微球用蒸馏水清洗两次并冷冻干燥。

[0041] 测试实施例1：微球吸取速率和可注射性的评估

[0042] 制备实施例1中制备的微球被分散在水溶液中，并评估其进入注射器的吸取速率和可注射性。每种微球制剂被置于烧杯中，并与三倍的蒸馏水在50mg/ml的浓度下混合。当微球使用磁力搅拌器被均一地分散时，1ml分散物被精确地吸入配有21号针的1ml注射器中(n＝20)。注射器中1ml的微球悬液被转移到1.5ml埃本多夫管(Eppendorfftube)中并冷冻干燥。评估回收进埃本多夫管中的微球的干重，并且结果显示于下文的表1中。

[0043] 表1

[0044] [表]

[0045] 根据分散剂类型的微球吸取速率

[0046]分散剂类型 吸取速率(％) RSD(％)
紧接喷雾干燥后的微球 11.4 17.9
蒸馏水 22.7 13.4
聚乙烯醇 91.5 4.2
聚乙烯吡咯烷酮 51.6 24.4
人血清白蛋白 70.1 36.4
聚乙二醇 66.8 19.0
Tween80 68.8 30.3
泊洛沙姆 24.2 56.8
羧甲基纤维素钠 60.9 16.9
明胶 75.7 11.0
甘氨酸 44.7 39.0
甘露醇 46.5 25.5

[0047] 注：RSD(相对标准偏差＝[回收的微球重量的标准偏差/平均值]×100)表示回收质量的偏差。

[0048] 如表1所示，发现，紧接喷雾干燥后的微球——其不进行分散过程，和在不含有分散剂的蒸馏水中进行分散过程的微球，当吸入注射器和从注射器中注射时，吸取速率和均一性降低。在文献研究中提到的几种分散剂中，聚乙烯醇显示出最高的吸取速率，接着是明胶、人血清白蛋白和Tween80。图1(图a)显示了当微球悬液被吸入注射器和从该注射器被注入管中时，没有进行分散步骤或使用甘露醇与聚乙烯醇作为分散剂进行分散步骤的微球的吸取速率和均一性。图1(图b)显示了当微球没有进行分散过程或使用聚乙烯醇作为分散剂进行分散过程时，每一管中相对注射器中平均吸取速率的偏差。如图1所示，当使用聚乙烯醇进行分散过程时，微球具有最高的吸取速率和最好的均一性。

[0049] 制备实施例2：提高微球分散性的分散时间的效果

[0050] PLGA微球使用装备超声波喷嘴(Sono-Tek，120kHz)的喷雾干燥器(SODEVA，法国)制备。生物可降解聚合物RG503H和药物醋酸亮丙瑞林被使用。40g的RG503H和4g的醋酸亮丙瑞林在400ml的冰醋酸中被均一溶解。该溶液通过超声波喷嘴以3ml/min的流速喷雾进喷雾干燥器，并在200℃用干燥空气干燥。其后，从旋风分离器中回收的微球以预先确定的量被取出，以50mg/ml的浓度加入到含有1％(w/v)聚乙烯醇的水溶液中，并使用磁力搅拌器在25℃下在其中悬浮1分钟、3分钟、5分钟、10分钟、1小时、3小时和6小时。使悬液通过真空过滤器。由此收集的微球用蒸馏水清洗两次并冷冻干燥。

[0051] 测试实施例2：微球吸取速率和可注射性的评估

[0052] 制备实施例2中制备的微球被分散在水溶液中，并评估其吸入注射器的吸取速率和可注射性。测试根据测试实施例1中相同的方法进行，并且结果在下文表2中给出。

[0053] 表2

[0054] [表]

[0055] 根据分散时间的微球吸取速率

[0056]1分钟3分钟 5分钟 10分钟 1小时 3小时6小时
吸取速率 71.4 80.0 86.1 89.6 89.4 90.2 90.3
(％)
RSD(％) 13.6 11.6 7.8 5.5 5.9 4.9 4.8

[0057] 如表2所示，在微球悬浮于聚乙烯醇溶液中后立即观察到高吸取速率。随着分散时间延长，当吸入注射器和从注射器中注射时，微球显示出提高的吸取速率和均一性。然而，在某一悬浮时间后，吸取速率和均一性保持在恒定的水平。

[0058] 测试实施例3：残余聚乙烯醇含量的测定

[0059] 在制备实施例2中制备的微球被评估残余的聚乙烯醇含量。该测试通过修改Journal of Controlled Release，82(2002)，105-114中所述的方法进行，如下。被准确称量的2mg制剂被置于玻璃小瓶中，与400μl的0.5N NaOH混合，并允许其在60℃烘箱中反应2-3小时到完全溶解(n＝3)。微球完全溶解在其中的溶液用180μl的1N HCl中和，用600μl的0.65M硼酸和100μl的I2/KI(0.05M/0.15M)溶液补充，并允许其反应20分钟。
随后，吸光度在690nm(UV)测量。结果显示于下文表3。

[0060] 表3

[0061] [表]

[0062] 依据分散时间的残余聚乙烯醇的量

[0063]1分钟 3分钟 5分钟 10分钟1小时 3小时6小时
残余量 0.02 0.04 0.05 0.07 0.12 0.22 0.38
(w/w)

[0064] 如表3所示，聚乙烯醇的残余量随着在聚乙烯醇溶液中悬浮时间的延长而增大。

[0065] 当表2和3所示结果放在一起时，微球的分散性和吸取速率在微球被悬浮并分散在聚乙烯醇的水溶液中之后立即提高，但是需要约5分钟或更长的分散时间达到最优效果。在这种情况下，保留在微球表面上的聚乙烯醇的量大于0.05wt％。这是确定微球吸入注射器的吸取速率的关键因素。

[0066] 比较制备实施例1：通过与聚乙烯醇共喷雾制备微球

[0067] PLGA微球使用装备超声波喷嘴(Sono-Tek，120kHz)的喷雾干燥器(SODEVA，法国)制备。生物可降解聚合物RG503H和药物醋酸亮丙瑞林被使用。为制备对照微球制剂，1.8g的RG503H和0.2g的醋酸亮丙瑞林在90ml的冰醋酸中被均一溶解。该溶液用活塞泵以1.5ml/min的流速被输送。输送的溶液通过安装在喷雾器上部的超声喷嘴被喷雾进喷雾干燥器，并在200℃用干燥空气干燥。其后，从旋风分离器中回收的微球以预先确定的量被取出，以50mg/ml的浓度加入到含有1％(w/v)聚乙烯醇作为分散剂的水溶液中，并使用磁力搅拌器在室温下在其中悬浮1小时。使悬液通过真空过滤器。由此收集的微球用蒸馏水清洗两次并冷冻干燥。

[0068] 比较微球制剂通过同时喷雾干燥微球和聚乙烯醇制备，以便比较共喷雾干燥的聚乙烯醇的分散效果与对照制剂中的分散效果。1.8g的RG503H和0.2g的醋酸亮丙瑞林在90ml的冰醋酸中被均一溶解。该溶液用活塞泵以1.5ml/min的流速被输送。输送的溶液通过安装在喷雾器上部的超声喷嘴被喷雾进喷雾干燥器，并在200℃用干燥空气干燥，由此产生比较制剂。

[0069] 按上文所述制备的对照和比较微球制剂被单独分散在水溶液中，并评价其吸入注射器的吸取速率和可注射性。该测试根据测试实施例1中相同的方法进行，并且管中微球的最终干重被测量。结果显示于下文的表4。每种微球制剂中残余聚乙烯醇的量根据测试实施例3中相同的方法确定。

[0070] 进行了体外释放测试，如下。10mg每种微球制剂被置于1.5ml试管中，与1ml磷酸盐缓冲液(PBS)混合，并在37℃下在培养箱中温育1小时，使用旋转摇床(SLRM-2M，Seoulin Bioscience)以5rpm的速度震荡。每个反应溶液被离心，并且上清液使用荧光检测计(Varian，Cary Eclipse；Ex：280nm，Em：350nm)评估从微球中释放的肽药物的量。

[0071] 表4

[0072] [表]

[0073] 对照和比较微球制剂的分散性、残余聚乙烯醇量和初始药物释放

[0074]制剂 残余聚乙烯醇(％) 初始药物释放(％) 吸取速率(％) RSD(％)
对照 0.13 3.1 75.32 5.62
比较 0.52 15.5 68.18 13.13

[0075] 如表4所示，与使用聚乙烯醇进行分散的对照微球制剂相比，未进行悬浮过程的比较微球制剂具有高聚乙烯醇浓度，但是当吸入注射器和从中注射时，显示出降低的吸取速率和均一性，并显示出高的初始药物释放速率。

[0076] 测试实施例4：评估根据使用聚乙烯醇的分散时间的残余溶剂去除速率[0077] 微球根据制备实施例2相同的方法制备，并从旋风分离器中回收，并以50mg/ml的浓度被悬浮在1％聚乙烯醇的水溶液中。当该水溶液被保持在25℃时，在给定的时间点测量残余醋酸的去除速率。微球中残余醋酸的浓度按如下方法确定。微球被溶解在二氯甲烷(Junsei，34355-0350)中，用0.07％的磷酸(Sigma，P-6560)水溶液补充，并与之剧烈混合。该混合物被离心，以分离磷酸水溶液层。该层被回收并使用HPLC评估醋酸的量。HPLC使用C18柱(5μm，4.6×250mm，120 )进行。5-50％线性梯度的甲醇(J.T.Baker，AH230-4)和0.07％磷酸盐缓冲液(pH3.0)的混合物被用作具有1.2ml/min流速的移动相。醋酸在
210nm(UV)处检测，并且结果在下文表5给出。紧接微球制备后的残余醋酸含量为0.8wt％。

[0078] 表5

[0079] [表]

[0080] 根据分散时间的残余溶剂去除速率

[0081]时间(分钟)醋酸去除速率(％)
5 20.0
10 34.2
20 44.0
40 54.5
60 61.3
120 73.6
180 87.9

[0082] 如表5所示，残余溶剂去除速率随着微球在聚乙烯醇水溶液中悬浮时间的增长而逐渐增加，以去除残余溶剂。最终的残余溶剂被保持在小于0.1wt％。

[0083] 制备实施例3：通过喷雾干燥含有BSA的W/O类型乳液制备加载BSA的微球[0084] 0.5g的牛血清白蛋白(BSA)(Sigma，A-7638)被溶解在蒸馏水中，并与通过在95ml二氯甲烷中溶解9.5g的RG502H制备的溶液均一混合，由此产生W/O类型乳液。当该乳液使用搅拌器被保持在乳液状态时，其以3ml/min的流速被提供到喷雾干燥器(Buchi-191)中。压缩空气以450NL/h的流速被提供到双流体喷嘴，以使在80℃用干燥空气干燥喷雾雾化的液滴。回收的微球以50mg/ml的浓度、在使用磁力搅拌器搅拌下，在1％聚乙烯醇水溶液中被悬浮3小时，用蒸馏水清洗，并冷冻干燥。由此制备的微球具有5.2μm的平均颗粒尺寸，并且残留在微球表面上的聚乙烯醇的量为0.93％(w/w)。

[0085] 制备实施例4：通过喷雾干燥含有BSA的S/O类型乳液制备加载BSA的微球[0086] 1g的BSA在臼中被精细研磨，并与通过在90ml二氯甲烷中溶解9g的RG502H而制备的溶液均一混合，由此产生S/O类型的乳液。当该乳液使用搅拌器被保持在乳液状态时，其以3ml/min的流速被提供到喷雾干燥器(Buchi-191)。压缩空气以450NL/h的流速被提供到双流体喷嘴，以在80℃用干燥空气干燥喷雾雾化的液滴。回收的微球以50mg/ml的浓度在使用磁力搅拌器搅拌下，在1％聚乙烯醇水溶液中被悬浮3小时，用蒸馏水清洗，并冷冻干燥。由此制备的微球具有5.8μm的平均颗粒尺寸，并且残留在微球表面上的聚乙烯醇的量为0.85％(w/w)。

[0087] 制备实施例5：加载亮丙瑞林的微球的制备

[0088] 1g醋酸亮丙瑞林和9g的RG502H被溶解在90ml冰醋酸中。该溶液以2ml/min的流速被提供到喷雾干燥器(Buchi-191)中。压缩空气以500NL/h的流速被提供到双流体喷嘴，以在120℃用干燥空气干燥喷雾雾化的液滴。回收的微球以50mg/ml的浓度在使用磁力搅拌器搅拌下，在1％聚乙烯醇水溶液中被悬浮3小时，用蒸馏水清洗，并冷冻干燥。由此制备的微球具有5.1μm的平均颗粒尺寸，并且残留在微球表面上的聚乙烯醇的量为0.98％(w/w)。

[0089] 制备实施例6：加载亮丙瑞林的微球的制备

[0090] 0.4g醋酸亮丙瑞林和9.6g的R202H被溶解在96ml冰醋酸中。该溶液以3ml/min的流速被提供到喷雾干燥器(SODECA，法国)中，使用超声喷嘴(Sono-Tek，120kHz)喷入干燥室中，并在200℃用干燥空气干燥。回收的微球以50mg/ml的浓度在使用磁力搅拌器搅拌下，在1％聚乙烯醇水溶液中被悬浮3小时，用蒸馏水清洗，并冷冻干燥。由此制备的微球具有23.4μm的平均颗粒尺寸，并且残留在微球表面上的聚乙烯醇的量为0.16％(w/w)。

[0091] 制备实施例7：加载亮丙瑞林的微球的制备

[0092] 0.5g醋酸亮丙瑞林和9.5g的R202H被溶解在95ml冰醋酸中。该溶液以3ml/min的流速被提供到喷雾干燥器(SODECA，法国)中，使用超声喷嘴(Sono-Tek，60kHz)喷入干燥室中，并在200℃用干燥空气干燥。回收的微球以50mg/ml的浓度在使用磁力搅拌器搅拌下，在1％聚乙烯醇水溶液中被悬浮3小时，用蒸馏水清洗，并冷冻干燥。由此制备的微球具有32.6μm的平均颗粒尺寸，并且残留在微球表面上的聚乙烯醇的量为0.11％(w/w)。

[0093] 制备实施例8：加载亮丙瑞林的微球的制备

[0094] 1.4g醋酸亮丙瑞林、0.86g的RG504H和7.74g的R202H被溶解在86ml冰醋酸中。该溶液以3ml/min的流速被提供到喷雾干燥器(SODECA，法国)中，使用超声喷嘴(Sono-Tek，120kHz)喷入干燥室中，并在200℃用干燥空气干燥。回收的微球以50mg/ml的浓度在使用磁力搅拌器搅拌下，在1％聚乙烯醇水溶液中被悬浮90分钟，用蒸馏水清洗，并冷冻干燥。

[0095] 制备实施例9：加载奥曲肽的微球的制备

[0096] 0.7g醋酸奥曲肽和9.3g的RG502H被溶解在186ml冰醋酸中。该溶液以3ml/min的流速被提供到喷雾干燥器(SODECA，法国)中，使用超声喷嘴(Sono-Tek，120kHz)喷入干燥室中，并在200℃用干燥空气干燥。回收的微球以50mg/ml的浓度在使用磁力搅拌器搅拌下，在1％聚乙烯醇水溶液中被悬浮1小时，用蒸馏水清洗，并冷冻干燥。

[0097] 测试实施例5

[0098] 制备实施例8中制备的加载亮丙瑞林的微球被悬浮在悬液(0.5％(w/w)羧甲基纤维素钠、5％(w/w)甘露醇、0.1％Tween80)中，并以9mg/kg(醋酸亮丙瑞林)的单一剂量被皮下注射进雄性SD大鼠(n＝5，195±20g)。在给药前，给药后30分钟、1小时、3小时、6小时和1、2、4及7天后，以及从第8天到第90天期间的每7天，从尾部静脉收集血液样品。大鼠用微球以100μg/kg(基于醋酸亮丙瑞林)的剂量，在给药后28、56和84天进行抗致病试验(challenge)，以便评价药物从微球的缓释，并且血液样品在给药前和给药后3和24小时收集。二次给药在初次给药后90天进行，并且血液样品如初次给药所述收集。收集的血液样品被置于1.5ml的埃本多夫管中，并在4℃和12,000rpm的条件下离心10分钟。获得的血清被储存在-20℃。血清睾酮水平使用放射性免疫试验(RIA)试剂盒(DSL-10-4000，Diagnostic SystemLaboratories，Inc.，Webster，Texas，USA)测量，并且结果在图2中给出。在给药后每28天进行的三次抗致病试验，和给药后90天进行的二次给药使得血清睾酮水平升高得以抑制。这些结果表明亮丙瑞林在90天的测试期中被连续释放。

[0099] 测试实施例6

[0100] 制备实施例9中制备的加载奥曲肽的微球被悬浮在悬液(0.5％(w/w)羧甲基纤维素钠、0.6％(w/w)甘露醇)中，并以5mg/kg(奥曲肽)的单一剂量被皮下注射进雄性SD大鼠(n＝6，195±20g)。血液样品在给药前，给药后6小时和1、4、7、13、12及31天后从尾部静脉收集。收集的血液样品被置于1.5ml的埃本多夫管中，并在4℃和12,000rpm的条件下离心10分钟。获得的血清被储存在-20℃。血清奥曲肽水平使用酶免疫测试(EIA)试剂盒(Bachem，S-1275，PeninsulaLaboratories Inc.，USA)测量，并且结果在图3中给出。如图3所示，奥曲肽药物被发现在大于2周的时间内被连续释放。

[0101] 工业应用

[0102] 如本文前述，依据本发明制备微球的方法允许制备缓释微球，而没有缓释微球传统制备方法的问题，这些问题包括由于残余溶剂引起的毒性和差的可注射性。当给予身体时，依据本发明制备的微球以持续的方式在预先确定的时间段内释放有效浓度的药物，防止快速的初始药物释放，并减小了药物所要求的给药频率。因此，本微球被用于疾病的治疗。