一种糖化酶及其编码基因与表达方法转让专利
申请号 : CN200810101695.7
文献号 : CN101532002B
文献日 : 2010-12-15
发明人 : 江宁 , 李子龙 , 贺鹏
申请人 : 中国科学院微生物研究所
摘要 :
本发明公开了一种糖化酶及其编码基因与表达方法。本发明的糖化酶是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有糖化酶活性的由a)衍生的蛋白质。本发明的糖化酶具有高度的热稳定性，且不催化葡萄糖生成寡糖，克服了其它来源的糖化酶不耐高温、催化逆反应的弊端，在实际生产中能节约成本，提高转化率，有重要的经济意义。本发明的糖化酶表达方法，能够高效表达糖化酶，糖化酶的产量可达112800U/L发酵液。
权利要求 :
1.一种糖化酶，是由序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.权利要求1所述糖化酶的编码基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所示的DNA分子。
4.扩增权利要求2或3所述基因全长或其任意片段的引物对。
5.根据权利要求4所述的引物对，其特征在于：所述引物对中的一条引物序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，所述引物对中的另一条引物序列如序列表中SEQ IDNO：4所示。
6.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体。
7.含有权利要求2或3所述编码基因的重组菌。
8.含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒。
9.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为在表达载体pET21a(+)的多克隆位点插入序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列得到的重组表达载体pTGA612。
10.根据权利要求7所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌是通过将权利要求6或9所述的重组表达载体导入大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或酵母得到的。
11.根据权利要求7或10所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)TGAR612 CGMCC No.2252。
12.一种表达糖化酶的方法，是发酵权利要求7、10或11所述重组菌得到糖化酶。
说明书 :
技术领域
本发明涉及一种糖化酶及其编码基因与表达方法。
背景技术
糖化酶(又名葡萄糖淀粉酶，EC3.2.1.3)从非还原性末端催化寡糖或者多糖，以β-D-葡萄糖的形式将葡萄糖从糖链上水解下来。糖化酶属于糖苷水解酶家族15(Biochem.J.1993，293：781-788)。
糖化酶是工业上极其重要的酶，应用非常广泛。主要用在淀粉的酶法转化生产高果糖浆(Starch.1989，41：57-64)，还应用于葡萄糖生产、面包生产、低热量啤酒生产以及整粒谷物生产酒精中(J.Food Biochem.1997，21：1-52.)。酶转化淀粉生产葡萄糖，需要两个步骤，第一步是利用耐热a-淀粉酶在95-105℃条件下液化，第二步是利用真菌糖化酶在pH4.5、60℃的条件下糖化(J.Appl.Biochem.1983，5：235-260.17.)。然而大多数糖化酶并不耐高温(Starch.1995，47：439-445)，而且在工业生产中，考虑到成本因素，一般会采用高浓度的淀粉生产高浓度的葡萄糖浆(高达30％)，在此条件下，真菌糖化酶会使葡萄糖缩合生成麦芽糖、异麦芽糖等寡糖，降低了转化率(Starch.1999，51：269-274.)。因此找到一种耐高温、耐高浓度葡萄糖、低副反应甚至无副反应的糖化酶是非常有必要的。腾冲热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)是中国科学院微生物研究所首先发现的一类嗜热厌氧革兰氏阴性真细菌，生活在我国云南省腾冲地区热泉中，最适生长温度为75℃(Int.J.Syst.Evol.MICrobiol.2001，51：1335-1341)，保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：AS1.2430T(AS 1.2430T＝JCM 11007T)。其全基因组已测序，Genbank保存号为AE008691。
糖化酶是工业上极其重要的酶，应用非常广泛。主要用在淀粉的酶法转化生产高果糖浆(Starch.1989，41：57-64)，还应用于葡萄糖生产、面包生产、低热量啤酒生产以及整粒谷物生产酒精中(J.Food Biochem.1997，21：1-52.)。酶转化淀粉生产葡萄糖，需要两个步骤，第一步是利用耐热a-淀粉酶在95-105℃条件下液化，第二步是利用真菌糖化酶在pH4.5、60℃的条件下糖化(J.Appl.Biochem.1983，5：235-260.17.)。然而大多数糖化酶并不耐高温(Starch.1995，47：439-445)，而且在工业生产中，考虑到成本因素，一般会采用高浓度的淀粉生产高浓度的葡萄糖浆(高达30％)，在此条件下，真菌糖化酶会使葡萄糖缩合生成麦芽糖、异麦芽糖等寡糖，降低了转化率(Starch.1999，51：269-274.)。因此找到一种耐高温、耐高浓度葡萄糖、低副反应甚至无副反应的糖化酶是非常有必要的。腾冲热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)是中国科学院微生物研究所首先发现的一类嗜热厌氧革兰氏阴性真细菌，生活在我国云南省腾冲地区热泉中，最适生长温度为75℃(Int.J.Syst.Evol.MICrobiol.2001，51：1335-1341)，保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：AS1.2430T(AS 1.2430T＝JCM 11007T)。其全基因组已测序，Genbank保存号为AE008691。
发明内容
本发明的目的是提供一种糖化酶。
本发明所提供的糖化酶，是由序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
为了使上述蛋白便于纯化，可在由序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
标签 残基 序列 Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH FLAG 8 DYKDDDDK Strep-tag II 8 WSHPQFEK c-myc 10 EQKLISEEDL
上述糖化酶的编码基因也属于本发明的保护范围。
上述糖化酶的编码基因，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所示的DNA分子。
扩增上述任一所述基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。
所述引物对具体可为扩增序列表中SEQ ID NO：1所示的DNA分子的一对引物对，其中的一条引物序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，另一条引物序列如序列表中SEQID NO：4所示。
含有上述任一所述基因的重组载体、重组菌或表达盒也属于本发明的保护范围。
所述重组载体具体可为在pET21a的多克隆位点插入序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列得到的重组表达载体pTGA612。
所述重组菌可以通过将所述重组载体导入原核微生物细胞或真核微生物细胞得到，其中，原核或真核微生物具体可为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母细胞。
所述重组菌具体可以通过将上述重组表达载体pTGA612导入大肠杆菌得到，其中一株重组菌为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)TGAR612，该菌株已于2007年11月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心的地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.2252。
本发明的另一个目的是提供一种表达糖化酶的方法。
本发明所提供的表达糖化酶的方法为发酵上述任一种重组菌得到糖化酶。
以发酵大肠埃希氏菌(Escherichia coli)TGAR612 CGMCC No.2252为例，发酵方法可以为如下：在无菌条件下，将重组菌(Escherichia coli)TGAR612接种于含有100ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，36-38℃振荡培养，培养10-18小时后，将重组菌(Escherichia coli)TGAR612转接入发酵罐中，当菌体浓度的OD600值达到0.5-1.2时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导糖化酶过量表达，IPTG在培养基中的终浓度一般以0.1-2mM为宜，当菌体浓度的OD600值达到3.2时，收集菌体，离心沉淀，纯化得到糖化酶蛋白。
本发明的糖化酶具有高度的热稳定性，且不催化葡萄糖生成寡糖，克服了其它来源的糖化酶不耐高温、催化逆反应的弊端，在实际生产中能节约成本，提高转化率，有重要的经济意义。本发明的糖化酶表达方法，能够高效表达糖化酶，糖化酶的产量可达112800U/L发酵液。
图1为重组表达载体pTGA612的构建示意图。
图2为糖化酶在不同温度下的相对酶活力。
图3为糖化酶在不同pH值下的相对酶活力。
图4为糖化酶的温度稳定性的检测结果。
图5为糖化酶基因在重组菌中表达后的纯化产物的电泳鉴定图。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。
本发明所提供的糖化酶，是由序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
为了使上述蛋白便于纯化，可在由序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
标签 残基 序列 Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH FLAG 8 DYKDDDDK Strep-tag II 8 WSHPQFEK c-myc 10 EQKLISEEDL
上述糖化酶的编码基因也属于本发明的保护范围。
上述糖化酶的编码基因，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所示的DNA分子。
扩增上述任一所述基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。
所述引物对具体可为扩增序列表中SEQ ID NO：1所示的DNA分子的一对引物对，其中的一条引物序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，另一条引物序列如序列表中SEQID NO：4所示。
含有上述任一所述基因的重组载体、重组菌或表达盒也属于本发明的保护范围。
所述重组载体具体可为在pET21a的多克隆位点插入序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列得到的重组表达载体pTGA612。
所述重组菌可以通过将所述重组载体导入原核微生物细胞或真核微生物细胞得到，其中，原核或真核微生物具体可为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母细胞。
所述重组菌具体可以通过将上述重组表达载体pTGA612导入大肠杆菌得到，其中一株重组菌为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)TGAR612，该菌株已于2007年11月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心的地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.2252。
本发明的另一个目的是提供一种表达糖化酶的方法。
本发明所提供的表达糖化酶的方法为发酵上述任一种重组菌得到糖化酶。
以发酵大肠埃希氏菌(Escherichia coli)TGAR612 CGMCC No.2252为例，发酵方法可以为如下：在无菌条件下，将重组菌(Escherichia coli)TGAR612接种于含有100ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，36-38℃振荡培养，培养10-18小时后，将重组菌(Escherichia coli)TGAR612转接入发酵罐中，当菌体浓度的OD600值达到0.5-1.2时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导糖化酶过量表达，IPTG在培养基中的终浓度一般以0.1-2mM为宜，当菌体浓度的OD600值达到3.2时，收集菌体，离心沉淀，纯化得到糖化酶蛋白。
本发明的糖化酶具有高度的热稳定性，且不催化葡萄糖生成寡糖，克服了其它来源的糖化酶不耐高温、催化逆反应的弊端，在实际生产中能节约成本，提高转化率，有重要的经济意义。本发明的糖化酶表达方法，能够高效表达糖化酶，糖化酶的产量可达112800U/L发酵液。
图1为重组表达载体pTGA612的构建示意图。
图2为糖化酶在不同温度下的相对酶活力。
图3为糖化酶在不同pH值下的相对酶活力。
图4为糖化酶的温度稳定性的检测结果。
图5为糖化酶基因在重组菌中表达后的纯化产物的电泳鉴定图。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。
附图说明
实施例1、糖化酶编码基因的获得及含有糖化酶编码基因的重组菌的构建
一、糖化酶编码基因的获得
分析腾冲热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)ASI.2430T的基因组DNA(Genbank号为AE008691)，结果表明，在腾冲热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)ASI.2430T的基因组中存在着一段基因序 列，该段基因序列编码的氨基酸序列与Clostridium.sp G0005糖化酶的氨基酸序列相似，相似性达70.9％，全基因组测序解释为hypothetical protein，因此推断由该段基因序列编码的氨基酸序列构成的蛋白为糖化酶(TGA)。
根据推测的糖化酶的基因序列，设计如下引物：引物1，5’GACTGCCATATGTGTTCTGATGTTTCATACGT 3’(序列表中SEQ ID NO：3)(含NdeI酶切位点)；引物2，5′CTGACTCGAGTCTCTCCCCTAATACATACC 3′(序列表中SEQ ID NO：4)(含XhoI酶切位点)。为实现糖化酶编码基因在大肠杆菌胞内的高效表达，通过上述引物扩增出糖化酶编码基因的主要功能区域，而不包括编码该糖化酶蛋白N端信号肽的基因序列。以腾冲热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)ASI.2430T基因组DNA为模板，用上述引物，进行PCR扩增，对PCR产物进行测序，测得的序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，此序列即为糖化酶编码基因序列，由2058个碱基组成，编码糖化酶成熟肽(不含信号肽部分)，2056-2058位核苷酸为终止密码子。由序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列编码的氨基酸序列如序列表中SEQID NO：2所示。
二、构建含有糖化酶编码基因的重组菌
一、糖化酶编码基因的获得
分析腾冲热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)ASI.2430T的基因组DNA(Genbank号为AE008691)，结果表明，在腾冲热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)ASI.2430T的基因组中存在着一段基因序 列，该段基因序列编码的氨基酸序列与Clostridium.sp G0005糖化酶的氨基酸序列相似，相似性达70.9％，全基因组测序解释为hypothetical protein，因此推断由该段基因序列编码的氨基酸序列构成的蛋白为糖化酶(TGA)。
根据推测的糖化酶的基因序列，设计如下引物：引物1，5’GACTGCCATATGTGTTCTGATGTTTCATACGT 3’(序列表中SEQ ID NO：3)(含NdeI酶切位点)；引物2，5′CTGACTCGAGTCTCTCCCCTAATACATACC 3′(序列表中SEQ ID NO：4)(含XhoI酶切位点)。为实现糖化酶编码基因在大肠杆菌胞内的高效表达，通过上述引物扩增出糖化酶编码基因的主要功能区域，而不包括编码该糖化酶蛋白N端信号肽的基因序列。以腾冲热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)ASI.2430T基因组DNA为模板，用上述引物，进行PCR扩增，对PCR产物进行测序，测得的序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，此序列即为糖化酶编码基因序列，由2058个碱基组成，编码糖化酶成熟肽(不含信号肽部分)，2056-2058位核苷酸为终止密码子。由序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列编码的氨基酸序列如序列表中SEQID NO：2所示。
二、构建含有糖化酶编码基因的重组菌
具体实施方式
将步骤一获得的PCR产物，用限制性内切酶NdeI和XhoI进行双酶切，酶切产物用T4连接酶连接到同样酶切后的pET21a(+)表达载体上，获得含有糖化酶编码基因的重组表达载体pTGA612(图1)；将重组表达载体pTGA612转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，经抗性培养基筛选得阳性克隆，提取质粒并用NdeI和XhoI进行酶切鉴定，结果表明在pTGA612中，糖化酶编码基因(序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列)已插入pET21a(+)的NdeI和XhoI位点间。将获得的含有pTGA612的重组大肠杆菌菌株命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)TGAR612，该菌株已于2007年11月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心的地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.2252。
实施例2、发酵大肠埃希氏菌(Escherichia coli)TGAR612 CGMCC No.2252制备糖化酶及酶活测定和酶性质分析
一、发酵大肠埃希氏菌(Escherichia coli)TGAR612 CGMCC No.2252制备糖化酶
在无菌条件下，将重组菌(Escherichia coli)TGAR612 CGMCC No.2252接种于含有100ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养，培养12小时后，将重组菌(Escherichia coli)TGAR612的种子液按照1％的体积比(种子液和发酵罐中的培养基的体积比)转接入发酵罐中，当菌体浓度的OD600值达到0.5-1.2时，加入IPTG至其终浓度达0.5mM诱导糖化酶表达，当菌体浓度的OD600值达到3.2左右时，收集菌体。
取OD600值为3.2时的发酵液，将其中表达后的湿菌体悬浮于50mM的柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液(pH4.6)中，超声破碎菌体，离心去沉淀，得到上清，将上清在70℃温育1小时，再离心，将绝大部分杂蛋白去除，得到上清，然后将上清过Ni亲和柱，用咪唑洗脱，电泳单一条带纯的蛋白。
将得到的纯蛋白用SDS-PAGE电泳进行检测。检测结果表明所得蛋白为单一条带，分子量为77.5kDa，与本发明的糖化酶蛋白的分子量相符(图5，其中M表示marker，泳道8所示为纯化后得到的蛋白)。
二、糖化酶的活性测定
发酵液中表达产物活性的检测可以以可溶性淀粉为底物，加入上述纯化后的蛋白进行酶反应，测定反应生成的葡萄糖的量，如果有葡萄糖生成则表明发酵产物具有糖化酶活性。
具体的酶活测定方法如下：
取OD600值为3.2时的发酵液50ml，将其中表达后的湿菌体悬浮于12ml 50mM的柠檬酸—磷酸二氢钠缓冲液(pH4.6)中，超声破碎菌体，离心去沉淀，得到12.5ml上清液1，将12.5ml上清液1在70℃温育1小时，再离心，将绝大部分杂蛋白去除，得到约12ml上清液2。
取25μl pH为4.6、0.2M的柠檬酸—磷酸二氢钠缓冲液，向其中加入50μl 2％(质量百分含量)可溶性淀粉水溶液，再向其中加入5μl上述上清液2，最后加入去离子水定容至100μl；将上述反应体系振荡混匀，70℃反应6分钟，然后迅速将反应体系置于沸水中煮4分钟终止反应；离心，用SBA生物传感分析仪检测生成的葡萄糖的量。
其中，酶活单位(U)定义为：在70℃、pH4.6的条件下，1h水解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量，即为一个酶活力单位(GB8276-1987)。
实验设三次重复。该100μl反应体系中，三次分别测得的葡萄糖的量依次为：0.235mg、0.236mg、0.234mg，其平均值为0.235mg。换算得到的酶活力为：0.235×12000/5×60/6×1000/50＝112800U/L发酵液。
三、酶的性质分析
1、酶的最适温度及温度稳定性检测
最适温度的确定：用可溶性淀粉作为底物，在pH值4.6的条件下分别测定不同温度下的步骤二获得的上清液2中酶活力，确定其最适反应温度。其中，除反应温度外，其余具体的酶活测定方法同步骤二所述。实验设3次重复，结果如图2所示。结果表明：此酶在20-85℃的温度范围内都有比较高的活性，其最适反应温度为70℃。图2中的相对酶活是将70℃、pH4.6条件下反应6分钟的酶活计作100％。
温度稳定性的确定：将步骤二获得的上清液2分别在60℃、70℃、75℃、80℃、90℃不同温度下保温，每个温度下分别保温10分钟，0.5小时、1小时、2小时，4小时，7小时，12小时，然后放入冰水中冷却，于70℃和pH值4.6的条件下测定酶活力。其中，酶活测定方法同步骤二所述。实验设3次重复。以没有热处理的酶液活力记作100％，不同样品的酶活与之比较的百分数为相对酶活(图4)。
结果表明：本发明的糖化酶具有高度的热稳定性，在70℃保温7小时后不失活，在70℃保温12小时仍有20％活性。
2、酶的最适pH值的测定
最适pH值的确定：分别配制含可溶性淀粉的pH值分别为3.6、4.2、4.4、4.6、5.0，5.4，6.0的0.1M柠檬酸-磷酸缓冲液，70℃反应6分钟测定步骤二获得的上清液2的酶活力，确定该酶的最适pH值。其中，除反应pH值外，酶活测定方法同步骤二所述。由于反应时间和酶量相同，其它条件都一样，故以生成的葡萄糖浓度表示相对活力。
实验设3次重复，结果如图3所示。结果表明：该酶在酸性环境(pH3.5-6.0)中具有糖化酶活性，其最适pH为4.6(图3，其中纵坐标为葡萄糖的浓度，单位是mg葡萄糖/ml酶反应体系)。
3、金属离子对酶活性的影响
配制含有不同金属离子的底物缓冲液：在含有1％淀粉(质量百分含量)，pH4.6，0.1M的柠檬酸-磷酸缓冲液中，分别加入终浓度至1mM的Na+，Li+，K+，Mg2+，Ca2+，Cu2+，Zn2+，Ni2+，及EDTA；然后分别以含有不同金属离子的底物缓冲液为底物，进行酶活测定，酶活测定方法同步骤二所述；以不加金属离子的反应体系作为对照。实验设3次重复，结果表明该糖化酶活性不依赖于金属离子。
4、对不同底物具有不同的活性
分别向含1％底物(质量百分含量)，pH4.6，0.1M的柠檬酸-磷酸缓冲液体系 中加入5ul步骤二获得的上清液2，反应6分钟，SBA传感仪测量生成葡萄糖的含量计算酶活力；其中底物分别为麦芽低聚糖、糊精、麦芽三糖、可溶性淀粉、麦芽糖、支链淀粉、直链淀粉。实验设3次重复，结果表明，对不同来源的热糊化淀粉均有较强活性，对不同底物的活性表现为麦芽低聚糖＞糊精≈麦芽三糖＞可溶性淀粉＞麦芽糖＞支链淀粉＞直链淀粉。
5、检测糖化酶是否催化葡萄糖缩合形成寡糖
向pH值为4.6、含30％(质量百分含量)葡萄糖、0.1M的柠檬酸-磷酸缓冲液中，加入5ul步骤二获得的上清液2，65℃反应46小时，SBA传感仪检测葡萄糖的减少量。实验设3次重复，每次测得的葡萄糖的浓度为30％、30％、30％。结果表明未有葡萄糖减少，证明该酶在30％葡萄糖条件下不催化逆向反应。
序列表
实施例2、发酵大肠埃希氏菌(Escherichia coli)TGAR612 CGMCC No.2252制备糖化酶及酶活测定和酶性质分析
一、发酵大肠埃希氏菌(Escherichia coli)TGAR612 CGMCC No.2252制备糖化酶
在无菌条件下，将重组菌(Escherichia coli)TGAR612 CGMCC No.2252接种于含有100ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养，培养12小时后，将重组菌(Escherichia coli)TGAR612的种子液按照1％的体积比(种子液和发酵罐中的培养基的体积比)转接入发酵罐中，当菌体浓度的OD600值达到0.5-1.2时，加入IPTG至其终浓度达0.5mM诱导糖化酶表达，当菌体浓度的OD600值达到3.2左右时，收集菌体。
取OD600值为3.2时的发酵液，将其中表达后的湿菌体悬浮于50mM的柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液(pH4.6)中，超声破碎菌体，离心去沉淀，得到上清，将上清在70℃温育1小时，再离心，将绝大部分杂蛋白去除，得到上清，然后将上清过Ni亲和柱，用咪唑洗脱，电泳单一条带纯的蛋白。
将得到的纯蛋白用SDS-PAGE电泳进行检测。检测结果表明所得蛋白为单一条带，分子量为77.5kDa，与本发明的糖化酶蛋白的分子量相符(图5，其中M表示marker，泳道8所示为纯化后得到的蛋白)。
二、糖化酶的活性测定
发酵液中表达产物活性的检测可以以可溶性淀粉为底物，加入上述纯化后的蛋白进行酶反应，测定反应生成的葡萄糖的量，如果有葡萄糖生成则表明发酵产物具有糖化酶活性。
具体的酶活测定方法如下：
取OD600值为3.2时的发酵液50ml，将其中表达后的湿菌体悬浮于12ml 50mM的柠檬酸—磷酸二氢钠缓冲液(pH4.6)中，超声破碎菌体，离心去沉淀，得到12.5ml上清液1，将12.5ml上清液1在70℃温育1小时，再离心，将绝大部分杂蛋白去除，得到约12ml上清液2。
取25μl pH为4.6、0.2M的柠檬酸—磷酸二氢钠缓冲液，向其中加入50μl 2％(质量百分含量)可溶性淀粉水溶液，再向其中加入5μl上述上清液2，最后加入去离子水定容至100μl；将上述反应体系振荡混匀，70℃反应6分钟，然后迅速将反应体系置于沸水中煮4分钟终止反应；离心，用SBA生物传感分析仪检测生成的葡萄糖的量。
其中，酶活单位(U)定义为：在70℃、pH4.6的条件下，1h水解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量，即为一个酶活力单位(GB8276-1987)。
实验设三次重复。该100μl反应体系中，三次分别测得的葡萄糖的量依次为：0.235mg、0.236mg、0.234mg，其平均值为0.235mg。换算得到的酶活力为：0.235×12000/5×60/6×1000/50＝112800U/L发酵液。
三、酶的性质分析
1、酶的最适温度及温度稳定性检测
最适温度的确定：用可溶性淀粉作为底物，在pH值4.6的条件下分别测定不同温度下的步骤二获得的上清液2中酶活力，确定其最适反应温度。其中，除反应温度外，其余具体的酶活测定方法同步骤二所述。实验设3次重复，结果如图2所示。结果表明：此酶在20-85℃的温度范围内都有比较高的活性，其最适反应温度为70℃。图2中的相对酶活是将70℃、pH4.6条件下反应6分钟的酶活计作100％。
温度稳定性的确定：将步骤二获得的上清液2分别在60℃、70℃、75℃、80℃、90℃不同温度下保温，每个温度下分别保温10分钟，0.5小时、1小时、2小时，4小时，7小时，12小时，然后放入冰水中冷却，于70℃和pH值4.6的条件下测定酶活力。其中，酶活测定方法同步骤二所述。实验设3次重复。以没有热处理的酶液活力记作100％，不同样品的酶活与之比较的百分数为相对酶活(图4)。
结果表明：本发明的糖化酶具有高度的热稳定性，在70℃保温7小时后不失活，在70℃保温12小时仍有20％活性。
2、酶的最适pH值的测定
最适pH值的确定：分别配制含可溶性淀粉的pH值分别为3.6、4.2、4.4、4.6、5.0，5.4，6.0的0.1M柠檬酸-磷酸缓冲液，70℃反应6分钟测定步骤二获得的上清液2的酶活力，确定该酶的最适pH值。其中，除反应pH值外，酶活测定方法同步骤二所述。由于反应时间和酶量相同，其它条件都一样，故以生成的葡萄糖浓度表示相对活力。
实验设3次重复，结果如图3所示。结果表明：该酶在酸性环境(pH3.5-6.0)中具有糖化酶活性，其最适pH为4.6(图3，其中纵坐标为葡萄糖的浓度，单位是mg葡萄糖/ml酶反应体系)。
3、金属离子对酶活性的影响
配制含有不同金属离子的底物缓冲液：在含有1％淀粉(质量百分含量)，pH4.6，0.1M的柠檬酸-磷酸缓冲液中，分别加入终浓度至1mM的Na+，Li+，K+，Mg2+，Ca2+，Cu2+，Zn2+，Ni2+，及EDTA；然后分别以含有不同金属离子的底物缓冲液为底物，进行酶活测定，酶活测定方法同步骤二所述；以不加金属离子的反应体系作为对照。实验设3次重复，结果表明该糖化酶活性不依赖于金属离子。
4、对不同底物具有不同的活性
分别向含1％底物(质量百分含量)，pH4.6，0.1M的柠檬酸-磷酸缓冲液体系 中加入5ul步骤二获得的上清液2，反应6分钟，SBA传感仪测量生成葡萄糖的含量计算酶活力；其中底物分别为麦芽低聚糖、糊精、麦芽三糖、可溶性淀粉、麦芽糖、支链淀粉、直链淀粉。实验设3次重复，结果表明，对不同来源的热糊化淀粉均有较强活性，对不同底物的活性表现为麦芽低聚糖＞糊精≈麦芽三糖＞可溶性淀粉＞麦芽糖＞支链淀粉＞直链淀粉。
5、检测糖化酶是否催化葡萄糖缩合形成寡糖
向pH值为4.6、含30％(质量百分含量)葡萄糖、0.1M的柠檬酸-磷酸缓冲液中，加入5ul步骤二获得的上清液2，65℃反应46小时，SBA传感仪检测葡萄糖的减少量。实验设3次重复，每次测得的葡萄糖的浓度为30％、30％、30％。结果表明未有葡萄糖减少，证明该酶在30％葡萄糖条件下不催化逆向反应。
序列表