一种快速从同一样品中同时抽提纯化DNA/RNA的试剂盒以及方法

摘要

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种快速从同一样品中同时抽提纯化DNA/RNA的试剂盒及方法。本发明的试剂盒包括：裂解液、前处理液、RNA结合液、DNA洗液I、RNA洗液I、DNA/RNA洗液II、DNA洗脱液以及DNA结合柱、RNA结合柱和结合柱。本发明的方法包括裂解、前处理、过滤、特异结合DNA、清洗提纯DNA、洗脱DNA、特异结合RNA、清洗提纯RNA和洗脱RNA等步骤。本发明采用新型介质，包括：过滤介质和结合介质，全新独特溶液配方，结合使用特异抑制剂，使提纯的时间大大减少，而纯度，稳定性大大提高。

权利要求

1.一种快速从同一样品中同时抽提纯化DNA/RNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下组分：

1)样品裂解液，

所述裂解液的配方为：

3.5-5.5M GuSCN

2-20mM MgCl2

10-50mM MES-NaOH，pH 6.3

10-30mM柠檬酸钠

1-10mM EDTApH8.0

0.005-0.3％TritonX-100

0.05-0.2％NP-40

0.01-0.8％N-月桂酰肌氨酸

1-8％丙醇

5-20ul/ml β-巯基乙醇；

2)结合柱前处理溶液，其配方为：

3.5-4.5M LiCl

0.005-0.02M HCl

0.05-0.3％TritonX-100；

3)DNA洗涤液I，其配方为：

4.5-5.5M GuHCl

5-20mM MES，pH5.5

0.5-3mM MgCl2

0.02-0.06％Triton X-100

45-60％乙醇；

4)RNA结合溶液，其配方为；

250-750mM MES-NaOH pH5.0

65-80％乙醇；

5)RNA洗液I，其配方为：

50-200mM MES-NaOH，pH5～6，

3.5-4.5M GuSCN

0.4-1％TritonX-100

35-45％乙醇；

6)DNA/RNA洗液II，对于植物材料所述洗液II的配方为：

70-85％乙醇

0.5-1.5％丙酮

0.005-0.05％DEPC对于其它材料所述洗液II的配方为：

70-85％乙醇和0.005-0.05％DEPC；

7)Rnase-free H2O；

8)DNA洗脱液，其配方为：

5-15mM Tris-HCl，pH8.0

1-2mM EDTA；

9)DNA结合柱，所述DNA结合柱由硅胶制成；

10)RNA结合柱，所述RNA结合柱由玻璃纤维材料制成；以及

11)过滤柱，所述过滤柱的过滤介质为氧化铝滤片。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA结合柱由孔径为0.5-0.9μM的硅胶制成。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述过滤柱的过滤介质为5-10μM孔径的氧化铝滤片。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述RNA结合柱由孔径为0.3-0.8μM的玻璃纤维材料制成。

5.一种快速从同一样品中同时抽提纯化DNA/RNA的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)裂解样品，将样品研磨，并加入样品裂解液进行裂解，所述裂解液的配方为：

3.5-5.5M GuSCN

2-20mM MgCl2

10-50mM MES-NaOH，pH 6.3

10-30mM柠檬酸钠

1-10mM EDTApH8.0

0.005-0.3％TritonX-100

0.05-0.2％NP-40

0.01-0.8％N-月桂酰肌氨酸

1-8％丙醇

5-20ul/ml β-巯基乙醇；

2)前处理，将200μL前处理液分别注入DNA结合柱和RNA结合柱中，然后离心去除溶液，所述DNA结合柱由硅胶制成；

所述RNA结合柱由玻璃纤维材料制成；

所述前处理溶液的配方为：

3.5-4.5M LiCl

0.005-0.02M HCl

0.05-0.3％TritonX-100；

3)过滤，将裂解样品用过滤柱过滤，收集滤液，所述过滤柱的过滤介质为氧化铝滤片；

4)特异结合DNA，将步骤3)中得到的滤液上样到DNA结合柱上，并离心收集滤液备用；

5)清洗提纯DNA，加500μLDNA洗液I于DNA结合柱中，并离心去除溶液，然后再加750μLDNA/RNA洗液II于DNA结合柱中，并离心去除溶液，所述DNA洗涤液I的配方为：

4.5-5.5M GuHCl

5-20mM MES，pH5.5

0.5-3mM MgCl2

0.02-0.06％Triton X-100

45-60％乙醇；

所述DNA/RNA洗液II，对于植物材料所述洗液II的配方为：

70-85％乙醇

0.5-1.5％丙酮

0.005-0.05％DEPC对于其它材料所述洗液II的配方为：

70-85％乙醇和0.005-0.05％DEPC；

6)洗脱DNA，向经步骤5)处理的DNA结合柱中加入53μLDNA洗脱液，静止，并离心收集溶液，得到高纯度的DNA，所述DNA洗脱液的配方为：

5-15mM Tris-HCl，pH8.0

1-2mM EDTA；

7)特异结合RNA，向上述步骤4)收集的滤液中加入等体积的RNA结合溶液并混匀，然后上样到RNA结合柱上，并离心去除溶液，所述RNA结合液的配方为：

250-750mM MES-NaOH pH5.0

65-80％乙醇；

8)清洗提纯RNA，加500μLRNA洗液I于RNA结合柱中，并离心去除溶液，然后再加750μLRNA/DNA洗液II于RNA结合柱中，并离心去除溶液，RNA洗液I的配方为：

50-200mM MES-NaOH，pH5～6，

3.5-4.5M GuSCN

0.4-1％TritonX-100

35-45％乙醇；

9)洗脱RNA，向经步骤8)处理的RNA结合柱中加入无RNA酶的H2O，静止，并离心收集溶液，得到高纯度的RNA。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述DNA结合柱由孔径为0.5-0.9μM的硅胶制成。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述过滤柱的过滤介质为5-10μM孔径的氧化铝滤片。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述RNA结合柱由孔径为0.3-0.8μM的玻璃纤维材料制成。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种快速从同一样品中同时抽提纯化DNA/RNA的试剂盒及方法。

背景技术

DNA和RNA是遗传的基本物质，既是遗传信息的载体，也是蛋白合成的模板，分离高纯度的DNA和RNA是现代分子生物学研究及相关领域，包括；农业、林业、医学、法医鉴定及临床医学诊断、分子治疗等的必要技术手段，也是不可逾越的试验过程。DNA和RNA具有易降解，难纯化的特点。它易被无处不在DNAse和RNase.降解，也很容易在抽提过程中被蛋白和DNA和RNA彼此相互污染；传统的方法，DNA和RNA的分离纯化绝大部分是单独进行，即：同一样品只抽提RNA或DNA，如：碱裂解法，PEG沉淀法、AGPC法或酸性酚法、氯化铯密度梯度离心法、Miniprep法等。它们都是抽提其中一种：RNA或DNA。现在常用的Trizol法，曾提到可同时得到DNA，但纯度极差，大多方法都必须用到毒性极强的酚和氯仿等，对环境和试验人员易造成危害。现代分子医学和分子生物学研究都必须同时检测DNA和RNA，本发明摒弃了以往的单独提取法，创造了一种全新的DNA和RNA同时抽提纯化方法，从同一样品中同时分离纯化DNA和RNA，对某些珍贵，不易得到的样品尤为重要，因为它可以大大的节约样品，同时也可缩短实验时间，这一方法适合从各种材料中提纯可用于下游各种实验的高纯度DNA和RNA，如：PCR、基因芯片、克隆酶切、Northernblot、cDNA的转录、Northern blot、RNAi等。

发明内容

因此，为了解决上述问题，本发明的发明人提出并完成了本发明。
本发明采用新型介质，包括：过滤介质和结合介质，全新独特溶液配方，结合使用特异抑制剂，使提纯的时间大大减少，而纯度，稳定性大大提高。其原理如下：
DNA和RNA快速纯化利用强变性剂(GuSCN等)和适当的缓冲系统破碎细胞，抑制各种Rnase、D N ase，释放出DNA和RNA，利用特异DNA/RNA吸附介质和吸附溶液，分别结合DNA/RNA，经洗脱同时得到纯化的DNA和RNA。这一发明将为生物科学及相关领域的研究与应用，提供DNA/RNA同时快速分离纯化，无公害实验方法；也为大规模临床诊断样品的DNA/RNA分离纯化，包括病毒DNA/RNA的分离纯化，提供简单、有效、快捷的选择。
本发明的目的为提供一种快速从同一样品中同时抽提纯化DNA/RNA的试剂盒。
本发明的另一目的为提供一种快速从同一样品中同时抽提纯化DNA/RNA的方法。
根据本发明的快速从同一样品中同时抽提纯化DNA/RNA的试剂盒包括：
1)样品裂解液，
所述裂解液的配方为：
3.5-5.5M GuSCN
2-20mM MgCl2
10-50mM MES-NaOH，pH 6.3
10-30mM柠檬酸钠
1-10mM EDTA pH8.0
0.005-0.3％TritonX-100
0.05-0.2％NP-40
0.01-0.8％N-月桂酰肌氨酸
1-8％丙醇
5-20ul/ml β-巯基乙醇；
2)DNA结合柱前处理溶液，其配方为：
35-4.5M LiCl
0.005-0.02M HCl
0.05-0.3％TritonX-100；
3)DNA洗涤液I，其配方为：
4.5-5.5M GuHCl
5-20mM MES，pH5.5
0.5-3mM MgCl2
0.02-0.06％Triton X-100
45-60％乙醇；
4)RNA结合溶液，其配方为；
250-750mM MES-NaOH pH5.0
65-80％乙醇；
5)RNA洗液I，其配方为：
50-200mM MES-NaOH，pH5～6，
3.5-4.5M GuSCN
0.4-1％TritonX-100
35-45％乙醇；
6)DNA/RNA洗液II，
对于植物材料所述洗液II的配方为：
70-85％乙醇
0.5-1.5％丙酮
0.005-0.05％DEPC
对于其它材料所述洗液II的配方为：
70-85％乙醇和0.005-0.05％DEPC；
7)Rnase-free H2O；
8)DNA洗脱液，其配方为：
5-15mM Tris-HCl，pH8.0
1-2mM EDTA
9)DNA结合柱；
10)RNA结合柱；以及
11)过滤柱。
根据本发明的试剂盒，所述DNA结合柱由孔径为0.5-0.9μM的硅胶制成。
根据本发明的试剂盒，所述过滤柱的过滤介质为5-10μM孔径的氧化铝滤片。
根据本发明的试剂盒，所述RNA结合柱由孔径为0.3-0.8μM的玻璃纤维材料制成。
根据本发明的快速从同一样品中同时抽提纯化DNA/RNA的方法包括以下步骤：
1)裂解样品，将样品研磨，并加入样品裂解液进行裂解，
所述裂解液的配方为：
3.5-5.5M GuSCN
2-20mM MgCl2
10-50mM MES-NaOH，pH 6.3
10-30mM柠檬酸钠
1-10mM EDTA pH8.0
0.005-0.3％TritonX-100
0.05-0.2％NP-40
0.01-0.8％N-月桂酰肌氨酸
1-8％丙醇
5-20ul/ml β-巯基乙醇；
2)前处理，将200μL前处理液分别注入DNA结合柱和RNA结合柱中，然后离心去除溶液，
所述前处理溶液的配方为：
3.5-4.5M LiCl
0.005-0.02M HCl
0.05-0.3％TritonX-100；
3)过滤，将裂解样品用过滤柱过滤，收集滤液；
4)特异结合DNA，将步骤3)中得到的滤液上样到DNA结合柱上，并离心收集滤液备用；
5)清洗提纯DNA，加500μLDNA洗液I于DNA结合柱中，并离心去除溶液，然后再加750μLDNA/RNA洗液II于DNA结合柱中，并离心去除溶液，
所述DNA洗涤液I的配方为：
4.5-5.5M GuHCl
5-20mM MES，pH5.5
0.5-3mM MgCl2
0.02-0.06％Triton X-100
45-60％乙醇；
所述DNA/RNA洗液II，
对于植物材料所述洗液II的配方为：
70-85％乙醇
0.5-1.5％丙酮
0.005-0.05％DEPC
对于其它材料所述洗液II的配方为：
70-85％乙醇和0.005-0.05％DEPC
6)洗脱DNA，向经步骤5)处理的DNA结合柱中加入25-70μLDNA洗脱液，静止，并离心收集溶液，得到高纯度的DNA，
所述DNA洗脱液的配方为：
5-15mM Tris-HCl，pH8.0
1-2mM EDTA
7)特异结合RNA，向上述步骤4)收集的滤液中加入等体积的RNA结合溶液并混匀，然后上样到RNA结合柱上，并离心去除溶液，
所述RNA结合液的配方为：
250-750mM MES-NaOH pH5.0
65-80％乙醇；
8)清洗提纯RNA，加500μLRNA洗液I于RNA结合柱中，并离心去除溶液，然后再加750μLRNA/DNA洗液II于RNA结合柱中，并离心去除溶液，
RNA洗液I的配方为：
50-200mM MES-NaOH，pH5～6，
3.5-4.5M GuSCN
0.4-1％TritonX-100
35-45％乙醇；
9)洗脱RNA，向经步骤8)处理的RNA结合柱中加入Rnase-free的H2O，静止，并离心收集溶液，得到高纯度的RNA。
根据本发明的方法，所述DNA结合柱由孔径为0.5-0.9μM的硅胶制成。
根据本发明的方法，所述过滤柱的过滤介质为5-10μM孔径的氧化铝滤片。
根据本发明的方法，所述RNA结合柱由孔径为0.3-0.8μM的玻璃纤维材料制成。
综上，本发明具有以下优点：
1、摒弃以往RNA和DNA单独提取，浪费样品和时间的常规经典方法，用同一样品，同时提取RNA和DNA。
2、采用温和变性剂裂解法，不同于以往商用“Trizol”法、氯化铯密度梯度离心法和酸性酚法所用的酚抽提法，使用对环境造成污染的药品。
3、不离心沉淀收集收集样品，一步直接裂解，两步分别结合，特异清洗纯化。
4、采用特殊的全新溶液配方前处理二氧化硅纤维膜，特异结合DNA或RNA，使蛋白、DNA和RNA不相互污染，其他杂质更易清除。
5、大大缩短抽分离提纯时间，15分钟即可完成。
6、此法为DNA和RNA同时抽提的自动化和大规模化奠定了技术基础。

具体实施方式

实施例一使用本发明的试剂盒快速抽提纯化烟草叶的总RNA/DNA
一、配制溶液
配制以下溶液：
1)样品裂解液，
4M GuSCN
2.5mM MgCl2
25mM MES-NaOH，pH 6.3
20mM柠檬酸钠
2mM EDTA pH8.0
0.1％TritonX-100
0.15％NP-40
0.5％N-月桂酰肌氨酸
5％丙醇
10ul/ml β-巯基乙醇；
2)DNA结合柱前处理溶液：
4M LiCl
0.01M HCl
0.1％TritonX-100；
3)DNA洗涤液I：
4.5M GuHCl
10mM MES，pH5.5
1mM MgCl2
0.05％Triton X-100
55％乙醇；
4)RNA结合溶液：
500mM MES-NaOH pH5.0
70％乙醇；
5)RNA洗液I：
100mM MES-NaOH，pH5～6，
4M GuSCN
0.7％TritonX-100
40％乙醇；
6)DNA/RNA洗液II，
对于植物材料所述洗液II的配方为：
78％乙醇
1％丙酮
0.01％DEPC，
对于其它材料所述洗液II的配方为：
78％乙醇和0.01％DEPC；
7)Rnase-free H2O；
8)DNA洗脱液：
10mM Tris-HCl，pH8.0
1mM EDTA。
二、提取烟草的总RNA和DNA
1、裂解样品
取样品(约为50mg)放入液氮轮动磨碎，加入裂解液350μl，剧烈震荡，温育60℃，静置5分钟。
2、同时前处理DNA和RNA结合柱：将200μL DNA前处理溶液加入柱中，11000rpm离心10秒，弃除溶液。
3、过滤，将裂解样品用大孔径过滤柱过滤，收集滤液；
4、特异结合DNA，将步骤3中得到的滤液上样到DNA结合柱上，并11,000rpm(8200×g)离心20秒收集滤液备用；
5、清洗提纯DNA
加500μl DNA洗液I于DNA结合柱，11,000rpm(8200×g)离心20秒，弃除溶液。再加750μlRNA/DNA洗液II，11,000rpm(8200×g)离心10秒，弃除溶液，再离心1分钟。
6、洗脱高纯度DNA
将已结合DNA的干燥柱，加入53μl DNA洗脱液，静置1分钟，11,000rpm(8200×g)离心1分钟，收集溶液，得高纯度DNA约为50μL(0.4μg/μL)。
7、特异结合RNA，将步骤4收集的滤液加入等体积的RNA结合溶液，混匀、将所有样品(滤液)上样到RNA结合柱上，11,000rpm(8200×g)离心20秒。
8、清洗提纯RNA
加500μl RNA洗溶液I于RNA结合柱，11,000rpm(8200×g)离心20秒，弃除溶液。再加750μl RNA/DNA洗涤溶液II，11,000rpm(8200×g)离心10秒，弃除溶液，再离心1分钟。
9、洗脱高纯度RNA
将已结合RNA的干燥柱，加入RNA洗脱液，静置1分钟，11,000rpm(8200×g)离心1分钟，收集溶液，得高纯度RNA约为50μl(0.4μg/μl)。
实施例二提取酵母细胞的总RNA和DNA
以与实施例一相同的方法，提取酵母细胞的总RNA和DNA。
实施例三使用本发明的试剂盒快速抽提纯化烟草叶的总RNA/DNA
一、配制溶液
配制以下溶液：
1)样品裂解液，
3.5M GuSCN
2mM MgCl2
10mM MES-NaOH，pH 6.3
10mM柠檬酸钠
1mM EDTA pH8.0
0.005％TritonX-100
0.05％NP-40
0.01％N-月桂酰肌氨酸
1％丙醇
5ul/ml β-巯基乙醇；
2)DNA结合柱前处理溶液：
3.5M LiCl
0.005M HCl
0.05％TritonX-100；
3)DNA洗涤液I：
4.5M GuHCl
5mM MES，pH5.5
0.5mM MgCl2
0.02％Triton X-100
45％乙醇；
4)RNA结合溶液：
50mM MES-NaOH pH5.0
65％乙醇；
5)RNA洗液I：
50mM MES-NaOH，pH5～6，
3.5M GuSCN
0.4％TritonX-100
35％乙醇；
6)DNA/RNA洗液II，
对于植物材料所述洗液II的配方为：
70％乙醇
0.5％丙酮
0.005％DEPC，
对于其它材料所述洗液II的配方为：
70％乙醇和0.005％DEPC；
7)Rnase-free H2O；
8)DNA洗脱液：
5mM Tris-HCl，pH8.0
1mM EDTA。
二、提取烟草的总RNA和DNA
1、裂解样品
取样品(约为50mg)放入液氮轮动磨碎，加入裂解液350μl，剧烈震荡，温育60℃，静置5分钟。
2、同时前处理DNA和RNA结合柱：将200μL DNA前处理溶液加入柱中，11000rpm离心10秒，弃除溶液。
3、过滤，将裂解样品用大孔径过滤柱过滤，收集滤液；
4、特异结合DNA，将步骤3中得到的滤液上样到DNA结合柱上，并11,000rpm(8200×g)离心20秒收集滤液备用；
5、清洗提纯DNA
加500μl DNA洗液I于DNA结合柱，11,000rpm(8200×g)离心20秒，弃除溶液。再加750μlRNA/DNA洗液II，11,000rpm(8200×g)离心10秒，弃除溶液，再离心1分钟。
6、洗脱高纯度DNA
将已结合DNA的干燥柱，加入53μl DNA洗脱液，静置1分钟，11,000rpm(8200×g)离心1分钟，收集溶液，得高纯度DNA约为50μL(0.4μg/μL)。
7、特异结合RNA，将步骤4收集的滤液加入等体积的RNA结合溶液，混匀、将所有样品(滤液)上样到RNA结合柱上，11,000rpm(8200×g)离心20秒。
8、清洗提纯RNA
加500μl RNA洗溶液I于RNA结合柱，11,000rpm(8200×g)离心20秒，弃除溶液。再加750μl RNA/DNA洗涤溶液II，11,000rpm(8200×g)离心10秒，弃除溶液，再离心1分钟。
9、洗脱高纯度RNA
将已结合RNA的干燥柱，加入RNA洗脱液，静置1分钟，11,000rpm(8200×g)离心1分钟，收集溶液，得高纯度RNA约为50μl(0.4μg/μl)。
实施例四使用本发明的试剂盒快速抽提纯化烟草叶的总RNA/DNA
一、配制溶液
配制以下溶液：
1)样品裂解液，
5.5M GuSCN
20mM MgCl2
50mM MES-NaOH，pH 6.3
30mM柠檬酸钠
10mM EDTA pH8.0
0.3％TritonX-100
0.2％NP-40
0.8％N-月桂酰肌氨酸
8％丙醇
20ul/ml β-巯基乙醇；
2)DNA结合柱前处理溶液：
4.5M LiCl
0.02M HCl
0.3％TritonX-100；
3)DNA洗涤液I：
5.5M GuHCl
20mM MES，pH5.5
3mM MgCl2
0.06％Triton X-100
60％乙醇；
4)RNA结合溶液：
750mM MES-NaOH pH5.0
80％乙醇；
5)RNA洗液I：
200mM MES-NaOH，pH5～6，
4.5M GuSCN
1％TritonX-100
45％乙醇；
6)DNA/RNA洗液II，
对于植物材料所述洗液II的配方为：
85％乙醇
1.5％丙酮
0.05％DEPC，
对于其它材料所述洗液II的配方为：
85％乙醇和0.05％DEPC；
7)Rnase-free H2O；
8)DNA洗脱液：
15mM Tris-HCl，pH8.0
2mM EDTA。
二、提取烟草的总RNA和DNA
1、裂解样品
取样品(约为50mg)放入液氮轮动磨碎，加入裂解液350μl，剧烈震荡，温育60℃，静置5分钟。
2、同时前处理DNA和RNA结合柱：将200μL DNA前处理溶液加入柱中，11000rpm离心10秒，弃除溶液。
3、过滤，将裂解样品用大孔径过滤柱过滤，收集滤液；
4、特异结合DNA，将步骤3中得到的滤液上样到DNA结合柱上，并11,000rpm(8200×g)离心20秒收集滤液备用；
5、清洗提纯DNA
加500μl DNA洗液I于DNA结合柱，11,000rpm(8200×g)离心20秒，弃除溶液。再加750μlRNA/DNA洗液II，11,000rpm(8200×g)离心10秒，弃除溶液，再离心1分钟。
6、洗脱高纯度DNA
将已结合DNA的干燥柱，加入53μl DNA洗脱液，静置1分钟，11，000rpm(8200×g)离心1分钟，收集溶液，得高纯度DNA约为50μL(0.4μg/μL)。
7、特异结合RNA，将步骤4收集的滤液加入等体积的RNA结合溶液，混匀、将所有样品(滤液)上样到RNA结合柱上，11,000rpm(8200×g)离心20秒。
8、清洗提纯RNA
加500μl RNA洗溶液I于RNA结合柱，11,000rpm(8200×g)离心20秒，弃除溶液。再加750μl RNA/DNA洗涤溶液II，11,000rpm(8200×g)离心10秒，弃除溶液，再离心1分钟。
9、洗脱高纯度RNA
将已结合RNA的干燥柱，加入RNA洗脱液，静置1分钟，11,000rpm(8200×g)离心1分钟，收集溶液，得高纯度RNA约为50μl(0.4μg/μl)。