一种根据产酸量流加糖发酵生产透明质酸的方法

摘要

本发明涉及一种生产透明质酸的方法，特别涉及一种根据产酸量流加糖发酵生产透明质酸的方法，其特征在于：使用常规方法制备斜面菌种和种子液，然后进行发酵，在发酵过程中，利用糖消耗量和酸的产生量之间的比例关系，加入成比例的糖和碱，以维持发酵液合适的酸碱度(pH)以及适宜的糖浓度，使之既不产生底物抑制，也不构成限制。该流加糖的方法，提高了糖的转化率，使透明质酸产率明显提高。

权利要求

1.一种根据产酸量流加糖发酵生产透明质酸的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：①斜面菌种制备：配制斜面培养基，灭菌后，将产透明质酸菌种接种至斜面培养基上培养，得到斜面菌种；

②种子液制备：配制种子培养基，灭菌后，将步骤①制得的斜面菌种转入种子培养基中培养，得到种子液；

③发酵培养：配制发酵培养基，灭菌后，将步骤②制得的种子液接入发酵培养基中进行发酵生产透明质酸，在发酵过程中，同步分别加入比例为0.3～5摩尔碱/摩尔糖的碱和糖，以维持发酵液pH在6.5～7.5；

所述的发酵培养基中含有葡萄糖或蔗糖，其浓度为0.01～80克/升；

所述的碱和糖溶解后以碱液和糖液的形式同步分别加入，其中糖液的浓度为1～900克/升；

所述的糖是葡萄糖或蔗糖；

所述的碱是氢氧化钠或氢氧化钾。

说明书

一种根据产酸量流加糖发酵生产透明质酸的方法

技术领域

[0001] 本发明属于发酵工程技术领域，涉及一种生产透明质酸的方法，具体地说涉及一种根据产酸量流加糖发酵生产透明质酸的方法。

背景技术

[0002] 透明质酸(HA)是由葡糖醛酸和N-乙酰氨基葡糖为双糖单位组成的高分子直链黏多糖，广泛存在于脊椎动物的软组织如皮肤、关节滑液、眼玻璃体中。由于透明质酸具有黏度高、保湿性好等特点，已广泛应用于医药、化妆品等领域。目前透明质酸的生产主要有提取法和发酵法。由于发酵法生产透明质酸有不受原料限制、产物易纯化等优点，已成为生产透明质酸的主流。

[0003] 透明质酸发酵是底物抑制型发酵，因此高初始底物浓度会产生底物抑制，影响菌体生长。为解决这个问题，有学者采用在发酵过程中流加料液的方法，即在开始时只加入适量的底物，然后以某种方式再继续补加底物，以维持底物浓度在适宜的范围内，使之既不产生底物抑制，也不致于造成底物缺乏。

[0004] 迄今为止，研究流加糖发酵生产透明质酸的文献主要有下面的几篇。专利JP09-056394中报道在接种前将20％～40％的糖加入培养基中，1小时后再加入20％～40％的糖，再过5～6小时，将剩余的糖全部补入，这样可获得透明质酸的高产。专利JP62-215397介绍了一种高产透明质酸的方法，在产生菌的培养过程中，把糖分多次加入培养液中，使糖浓度保持在0.1～3％(w/v)。专利KR8903708中介绍接种后培养5小时，然后慢慢补入70％葡萄糖，使糖浓度保持0.5％，继续培养24小时，透明质酸的产率为3.4克/升。以上文献中提及的流加糖方式，有些操作简单，但底物浓度波动大，有些虽然底物浓度波动小，但需复杂计算。

[0005] 另外，专利CN200410046394.0公开了一种通过加入底物糖和碱的混合流加液来控制发酵液的酸碱度(pH)，生产乳链菌肽的方法。目前，关于根据产酸量流加糖发酵生产透明质酸的方法尚无报道。

[0006] 本发明提供了一种根据产酸量流加糖发酵生产透明质酸的方法。在透明质酸发酵过程中，微生物利用糖产生大量有机酸，如乙酸、乳酸和透明质酸等，需要加入碱来维持发酵液pH在中性。糖消耗量与产酸量成一定比例，而产酸量与加碱量成正比，因此在加碱液时同步流加成比例的糖液，可使底物糖浓度能较稳定的控制在合适的范围，从而使透明质酸的发酵产率得到明显提高。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供一种简单的流加糖液控制方法，控制发酵液的pH和糖浓度稳定在一适宜的范围内，从而使透明质酸产率明显提高。

[0008] 本发明提供的根据产酸量流加糖发酵生产透明质酸的方法，包括使用常规方法制备斜面菌种和种子液，然后进行发酵，在发酵过程中，利用糖消耗量和酸的产生量之间的比例关系，加入成比例的糖和碱(糖和碱必须分开加入，不能混合加入)，以维持合适的pH，及维持体系中的糖浓度在一适宜的范围内，使之既不产生底物抑制，也不构成限制。

[0009] 该方法的具体步骤如下：

[0010] ①斜面菌种制备：配制斜面培养基，灭菌后，将产透明质酸菌种接种至斜面培养基上培养，得到斜面菌种；

[0011] ②种子液制备：配制种子培养基，灭菌后，将步骤①制得的斜面菌种转入种子培养基中培养，得到种子液；

[0012] ③发酵培养：配制发酵培养基，灭菌后，将步骤②制得的种子液接入发酵培养基中进行发酵生产透明质酸，在发酵过程中，同步分别加入比例为0.3～5摩尔碱/摩尔糖的碱和糖，以维持发酵液pH在6.5～7.5。

[0013] 其中，发酵培养基中含有葡萄糖或蔗糖，其浓度(该浓度为起始浓度)为0.01～80克/升。

[0014] 所述的碱和糖溶解后以碱液和糖液的形式同时分开加入，其中糖液的浓度为1～900克/升。

[0015] 所述的糖是葡萄糖或蔗糖。所述的碱是氢氧化钠或氢氧化钾。

[0016] 本发明发现，如果以上述比例的碱和糖的混合液加入，透明质酸的产率并无明显提高，只有两者分开加入才会提高透明质酸的产率。本发明将碱和糖溶解后分别加入发酵液中，使单位时间内加入的碱与糖保持特定比例(0.3～5摩尔碱/摩尔糖)。此方法在向发酵体系中流加碱控制pH的同时，加入糖，且使加入的糖正好补充了消耗的糖，从而间接的控制了发酵液中的糖浓度，使发酵液中的糖浓度维持在一定范围。因此，本发明提供的根据产酸量流加糖生产透明质酸的方法，能较准确的控制底物浓度，操作简单，且可明显提高透明质酸的产率。

具体实施方式

[0017] 以下实施例是为了进一步说明本发明，但绝不是对本发明的限制。

[0018] 实施例1

[0019] 1)斜面制备：将产透明质酸菌种接种至斜面培养基上，斜面培养基配方：蛋白胨10g，酵母粉10g，Na2HPO4·12H2O 2g，MgSO4·7H2O 0.5g，葡萄糖10g，加水溶解并定容至1L。
配制固体培养基时，需加2％的琼脂。在培养箱中培养，32～39℃培养24小时。

[0020] 2)种子液制备：将培养好的菌种转入种子培养基中，种子培养基配方同斜面培养基，32～39℃，200rpm培养24小时。

[0021] 3)发酵培养：将种子液接入发酵罐中进行发酵，发酵培养基配方：蛋白胨10g，酵母粉10g，Na2HPO4·12H2O 2g，MgSO4·7H2O 0.5g，葡萄糖5g，加水溶解并定容至1L。培养条件：通气量20vvm，32～39℃，250rpm，pH控制在6～8之间，最好6.5～7.5。同步分别加入葡萄糖溶液与碱液进行pH的控制。葡萄糖溶液浓度为700克/升，氢氧化钠溶液浓度为260克/升，同步加入的氢氧化钠与糖的比例为1.7摩尔氢氧化钠/摩尔葡萄糖。当pH低于7.0时，开始自动流加氢氧化钠溶液至7.0，流加氢氧化钠溶液时同步流加葡萄糖溶液。
发酵过程中残糖浓度维持在4～6克/升，发酵结束时透明质酸产率为8.5克/升。

[0022] 实施例2