一种99Tcm-EDTA-MTI配合物的制备方法和应用转让专利
申请号 : CN200910083367.3
文献号 : CN101538284B
文献日 : 2011-09-07
发明人 : 张俊波 , 林潇 , 任佳蕾 , 王学斌 , 唐志刚 , 张现忠 , 陆洁
申请人 : 北京师范大学 , 北京师宏药物研制中心
摘要 :
本发明公开了一种99Tcm-EDTA-MTI配合物的制备方法和应用，通过包括a.配体EDTA-MTI的合成以及b.99Tcm-EDTA-MTI配合物的制备两个步骤，得到99Tcm-EDTA-MTI配合物，该配合物的放射化学纯度高、稳定性好、制备简便且价格低廉，在肿瘤中有较高的摄取值和良好的滞留，肿瘤/血、肿瘤/肌肉等靶/非靶比值好的优点，是一种有推广应用价值的新型肿瘤乏氧显像剂。
权利要求 :
99 m
1.一种 Tc-EDTA-MTI配合物的制备方法，其制备步骤如下：a.配体EDTA-MTI的合成：
在反应瓶中分别加入一定量的EDTA、乙酸酐，以无水吡啶作为溶剂，温控65℃，搅拌反应26h后抽滤，用无水乙醚洗涤固体后，用DMF-Et2O溶液重结晶，得到白色固体；将适量的白色固体、甲硝唑加入反应瓶中，以无水吡啶作为溶剂，温控70℃，搅拌反应24h后蒸干；在剩余物中加入无水乙醚，抽滤后用无水乙醇进行重结晶，得到浅黄色固体；
具体合成路线为：
99 m
b. Tc-EDTA-MTI配合物的制备：将1mL含有10mg EDTA-MTI配体的水溶液和0.2mL含0.4mg SnCl2·2H2O的0.2mol/L的HCl溶液依次加入到反应容器中，调节溶液pH值为6，然后加入1mL放射性浓度为7 99 m - 99 m
3.7×10Bq/mL的 TcO4 淋洗液，100℃水浴加热15分钟后，得到 Tc-EDTA-MTI配合物。
99 m
2.权利要求1中的 Tc-EDTA-MTI配合物在用于制备肿瘤乏氧显像剂中的应用。
说明书 :
99 m
一种 Tc-EDTA-MTI配合物的制备方法和应用
所属技术领域
[0001] 本发明涉及到99Tcm直接标记的放射性药物化学和临床核医学技术领域，特别是涉99 m
及到一种 Tc-EDTA-MTI配合物的制备方法和应用。
及到一种 Tc-EDTA-MTI配合物的制备方法和应用。
背景技术
[0002] 在放射性药物化学和临床核医学技术领域的实践中，通过大量临床实验表明，许多疾病，比如肿瘤，心、血管疾病都有一个共同的显著的生物学特征，就是组织缺氧。因此，了解组织的氧水平对这些疾病的诊断和治疗有很重要的意义。乏氧显像剂能够选择性的滞留于乏氧的组织或是细胞中，通过核医学显像就能够直接提供器官中有功能障碍的依据。目前，乏氧显像剂大致可以划分为硝基咪唑类和非硝基咪唑类。硝基咪唑类与乏氧组织的结合机理一般认为是配体的硝基在细胞内酶的作用下产生自由基阴离子，该中间体在乏氧细胞中会进一步还原，并滞留在细胞中，而在正常细胞中，该中间体会被很快氧化并排出。
99 m
Tc 标记的乏氧组织显像剂是国际上放射性药物化学研究的一个重要内容。至今，研究的
99 m
比较多的 Tc 标记的硝基咪唑类肿瘤乏氧显像剂有：
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Tc 标记的乏氧组织显像剂是国际上放射性药物化学研究的一个重要内容。至今，研究的
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比较多的 Tc 标记的硝基咪唑类肿瘤乏氧显像剂有：
[0003] 99Tcm-N2IPA(Taiwei Chu，Rujun Li，Shaowen Hu et al.Preparation andbiodistribution of ftechnetium-99m-labeled 1-(2-nitroimidazole-1-yl)-propanhydroxyiminoamide(N2IPA)as a tumor hypoxia marker[J].Nucl Med Biol2004，31：199-203)；
[0004] 99Tcm-DTPA-甲硝唑(陈跃，莫廷树，匡安仁等。乏氧组织显像剂99Tcm-DTPA-甲硝唑的制备和荷瘤动物实验研究.中华核医学杂志，2000，20(2)：78-81)；
[0005] 除 以 上 两 类 肿 瘤 乏 氧 显 像 剂 外，还 有 99Tcm-BMS181321，99Tcm-RP435，99 m 99 m 99 m 99 m 99 m
Tc-BMS194796，Tc-MAG3-硝 基 咪 唑，Tc-N4IPA，TcN(NIET)2，Tc-EC-甲 硝 唑，
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Tc-MNZCAA，Tc-甲硝哒唑黄原酸盐，Tc-MN-RPMA，Tc-(CO)3-甲硝唑IDA等肿瘤乏氧显像剂，这些显像剂各有其优势，但普遍都存在有一些不足之处：或肿瘤摄取值偏低或肝摄取值偏高，这和理想的乏氧显像剂还存在有一定的差距，因此，进一步研制新型的方便临床应用的肿瘤乏氧显像剂具有重要的现实意义。甲硝唑(简称为MTI)为硝基咪唑类化合物，易浓聚于乏氧组织中。如何将便宜易得的双功能连接剂EDTA与MTI偶联生成含MTI双酯，
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经放射性 Tc 标记制备得到一种 Tc-EDTA-MTI配合物用于肿瘤乏氧显像，是当前本技术领域需要解决的重要课题之一。
Tc-BMS194796，Tc-MAG3-硝 基 咪 唑，Tc-N4IPA，TcN(NIET)2，Tc-EC-甲 硝 唑，
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Tc-MNZCAA，Tc-甲硝哒唑黄原酸盐，Tc-MN-RPMA，Tc-(CO)3-甲硝唑IDA等肿瘤乏氧显像剂，这些显像剂各有其优势，但普遍都存在有一些不足之处：或肿瘤摄取值偏低或肝摄取值偏高，这和理想的乏氧显像剂还存在有一定的差距，因此，进一步研制新型的方便临床应用的肿瘤乏氧显像剂具有重要的现实意义。甲硝唑(简称为MTI)为硝基咪唑类化合物，易浓聚于乏氧组织中。如何将便宜易得的双功能连接剂EDTA与MTI偶联生成含MTI双酯，
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经放射性 Tc 标记制备得到一种 Tc-EDTA-MTI配合物用于肿瘤乏氧显像，是当前本技术领域需要解决的重要课题之一。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供一种99Tcm-EDTA-MTI配合物的制备方法，该制备方法放射化学纯度高、稳定性好，价廉易得，广泛应用于肿瘤乏氧显像领域。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：一种99Tcm-EDTA-MTI配合物的制备方法，其制备步骤如下：
[0008] a.配体EDTA-MTI的合成：
[0009] 在反应瓶中分别加入一定量的EDTA、乙酸酐，以无水吡啶作为溶剂，温控65℃，搅拌反应26h后抽滤。用无水乙醚洗涤固体后，用DMF-Et2O溶液重结晶，得到白色固体。将适量的白色固体、甲硝唑加入反应瓶中，以无水吡啶作为溶剂，温控70℃，搅拌反应24h后蒸干。在剩余物中加入无水乙醚，抽滤后用无水乙醇进行重结晶，得到浅黄色固体。
[0010] 具体合成路线为：
[0011]
[0012] b.99Tcm-EDTA-MTI配合物的制备：
[0013] 将1mL含有10mg EDTA-MTI配体的水溶液和0.2mL SnCl2·2H2O的HCl溶液(0.2mol/LHCl中SnCl2·2H2O的质量浓度为2.0g/L)依次加入到反应容器中，调节溶液pH99 m - 7
值为6，然后加入1mL TcO4 淋洗液(3.7×10Bq/mL)，100℃水浴加热15分钟，即得到本发
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明所述的 Tc-EDTA-MTI。
值为6，然后加入1mL TcO4 淋洗液(3.7×10Bq/mL)，100℃水浴加热15分钟，即得到本发
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明所述的 Tc-EDTA-MTI。
[0014] 上述的化学合成试剂均是市售商品，来源广泛易得。
[0015] 通过上述方法合成的99Tcm-EDTA-MTI是一种新型肿瘤乏氧显像剂，其原理是：含有硝基咪唑靶向基团的配合物有亲乏氧组织的性质，利用甲硝唑为靶向基团，通过与双99 m
功能连接剂EDTA反应生成含MTI双酯，利用EDTA-MTI分子中的-COOH与 Tc 络合生成
99 m 99 m
Tc-EDTA-MTI配合物。荷瘤小鼠体内生物分布实验结果表明：Tc-EDTA-MTI在肿瘤中有较高的摄取和较好的滞留，肿瘤/血，肿瘤/肌肉等靶/非靶比值好，可以成为一种新型的肿瘤乏氧显像剂。
功能连接剂EDTA反应生成含MTI双酯，利用EDTA-MTI分子中的-COOH与 Tc 络合生成
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Tc-EDTA-MTI配合物。荷瘤小鼠体内生物分布实验结果表明：Tc-EDTA-MTI在肿瘤中有较高的摄取和较好的滞留，肿瘤/血，肿瘤/肌肉等靶/非靶比值好，可以成为一种新型的肿瘤乏氧显像剂。
[0016] 将99Tcm-EDTA-MTI、99Tcm-DTPA-甲硝唑和99Tcm-N2IPA在荷瘤小鼠体内生物分布数据比较，结果见表1。
[0017] 表199Tcm-N2IPA、99Tcm-DTPA-甲硝唑、99Tcm-EDTA-MTI在荷瘤小鼠体内生物分布数据比较(％ID/g，4h p.i.)
[0018]99 m
[0019] 以上结果表明，Tc-EDTA-MTI在肿瘤中的摄取值最高，明显优于其余两种配合99 m
物，肿瘤/肌肉和肿瘤/血比值也很好，Tc-EDTA-MTI作为新型肿瘤乏氧显像剂具有更优良的生物分布性能，可以推广应用。
物，肿瘤/肌肉和肿瘤/血比值也很好，Tc-EDTA-MTI作为新型肿瘤乏氧显像剂具有更优良的生物分布性能，可以推广应用。
[0020] 实验表明，99Tcm-EDTA-MTI的性能如下：
[0021] 1.99Tcm-EDTA-MTI配合物的层析鉴定：
[0022] 薄层层析色谱(TLC)鉴定：用聚酰胺薄膜作为支持体，用乙腈作为展开剂；用滤纸作为支持体，用丙酮作为展开剂，测定的层析结果见表2。
[0023] 表2各组分的层析结果(Rf结果)
[0024]99TcmO4- 99TcmO2.nH2O 99Tcm-EDTA-MTI
聚酰胺-乙腈 0.3～0.5 0.1 0.7～1.0
滤纸-丙酮 1.0 0.1 0.1
聚酰胺-乙腈 0.3～0.5 0.1 0.7～1.0
滤纸-丙酮 1.0 0.1 0.1
[0025] 由上述层析鉴定所测得的标记物的放射化学纯度大于90％。
[0026] 高效液相色谱(HPLC)鉴定：Shimadzu SCL-10AVP型高压液相色谱仪，Kromasil100-5C18反相柱(25cm×4.6mm)，Packard液闪分析仪。A相为纯水，B相为甲醇，梯度为
0.01-30min B相为5-100％，进样量5μl，流量为1ml/min，测定的各组分的保留时间(Rt)
99 m - 99 m
分别为：TcO4 ：5.0min，Tc-EDTA-MTI：3.5min。所得的色谱结果表明均有放射性主峰，
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Tc-EDTA-MTI配合物的放射化学纯度大于90％。
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0.01-30min B相为5-100％，进样量5μl，流量为1ml/min，测定的各组分的保留时间(Rt)
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分别为：TcO4 ：5.0min，Tc-EDTA-MTI：3.5min。所得的色谱结果表明均有放射性主峰，
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Tc-EDTA-MTI配合物的放射化学纯度大于90％。
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[0027] 2. Tc-EDTA-MTI配合物的脂水分配系数的测定
[0028] 取1.0mLpH7.4的(0.025mol/L)磷酸盐缓冲液于10mL离心试管中，在离心试99 m
管中加入1.0mL正辛醇和0.01mL Tc-EDTA-MTI配合物溶液，盖上塞子，充分摇匀，离心
5min(4000r/min)。然后分别从有机相和水相中取出0.1mL，测定二相的放射性计数，并计算其脂水分配系数P(P＝有机相的放射性活度/水相的放射性活度)，测得logP＝-2.30，说
99 m
明 Tc-EDTA-MTI是一亲水性物质。
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管中加入1.0mL正辛醇和0.01mL Tc-EDTA-MTI配合物溶液，盖上塞子，充分摇匀，离心
5min(4000r/min)。然后分别从有机相和水相中取出0.1mL，测定二相的放射性计数，并计算其脂水分配系数P(P＝有机相的放射性活度/水相的放射性活度)，测得logP＝-2.30，说
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明 Tc-EDTA-MTI是一亲水性物质。
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[0029] 3. Tc-EDTA-MTI配合物的体外稳定性测定99 m
[0030] 将标记好的 Tc-EDTA-MTI在室温下放置不同时间(1、2、3、4、5、6小时)后测定99 m
其放射化学纯度，实验结果表明 Tc-EDTA-MTI在放置6小时后放射化学纯度大于90％，说
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明 Tc-EDTA-MTI在室温下体外稳定性好，适于临床应用的需要。
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其放射化学纯度，实验结果表明 Tc-EDTA-MTI在放置6小时后放射化学纯度大于90％，说
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明 Tc-EDTA-MTI在室温下体外稳定性好，适于临床应用的需要。
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[0031] 4. Tc-EDTA-MTI配合物电荷性质测定
[0032] 通过电泳实验方法进行。溶液介质选用组分为PBS(pH＝7.4)缓冲溶液。将新华一号纸裁成长15cm宽0.8cm的长方形，在纸条中央画点样线，并标明正负极。用毛细管将待测样品点在点样线上，点样后将电泳条的两端按照标好的正负极浸入两个对应电极的缓冲液槽中，纸条悬空且点样线位于中间。盖好密封盖，通电，电压调节在150V。待电泳条完全润湿后开始计时，通电3-4小时后测量电泳条上的放射性分布，结果表明90％以上的放99 m
射性计数集中在正极，说明 Tc-EDTA-MTI为带负电的物质。
99 m
射性计数集中在正极，说明 Tc-EDTA-MTI为带负电的物质。
99 m
[0033] 5. Tc-EDTA-MTI配合物在荷瘤小鼠模型中的生物分布实验：
[0034] 从荷S-180肉瘤模型的昆明小鼠(雌性，体重约18-20g)的尾静脉注射99 m 5
0.10mL Tc-EDTA-MTI溶液(约7.4×10Bq)，注射后分别与0.5h、2h、4h断头处死。取其心、肝、肺、肾、脑、肌肉、骨、血、肿瘤等有关组织和器官，擦净后分别称重，并在FT-603阱型γ闪烁探头上测其放射性计数，每个时项的荷瘤小鼠数为3只。计算各组织的每克百分注射剂量(％ID/g)。结果见表3。
0.10mL Tc-EDTA-MTI溶液(约7.4×10Bq)，注射后分别与0.5h、2h、4h断头处死。取其心、肝、肺、肾、脑、肌肉、骨、血、肿瘤等有关组织和器官，擦净后分别称重，并在FT-603阱型γ闪烁探头上测其放射性计数，每个时项的荷瘤小鼠数为3只。计算各组织的每克百分注射剂量(％ID/g)。结果见表3。
[0035] 表3：99Tcm-EDTA-MTI在荷S180肉瘤小鼠体内生物分布(n＝3)％ID/g
[0036]
[0037] 6..99Tcm-EDTA-MTI配合物荷瘤小鼠SPECT显像实验
[0038] 取荷S180小鼠3只，分别注射99Tcm-EDTA-MTI0.1mL(0.3mCi)，俯卧固定其四肢注射后4h进行SPECT显像(显像SPECT仪器为HAWKEYE VG8，采用128×128的矩阵进行扫99 m
描，一帧，扫描时间为300s)。SPECT显像结果表明 Tc-EDTA-MTI在肿瘤灶中有明显浓集。
描，一帧，扫描时间为300s)。SPECT显像结果表明 Tc-EDTA-MTI在肿瘤灶中有明显浓集。
[0039] 7.99Tcm-EDTA-MTI配合物的动物异常毒性实验
[0040] 根据中国药典2005年版二部附录异常毒性检查项下要求对99Tcm-EDTA-MTI标记99 m
液进行了动物异常毒性实验。将制备好的 Tc-EDTA-MTI(总体积3.5mL，总活度为1mCi)标记液，取0.5mL通过尾静脉缓慢注射到体重为20g的昆明小白鼠体内，共5只，按药典规定观察48小时，未见异常反应，并且无一死亡。按给药量换算(每公斤体重)相当于人体
99 m
(以50公斤为例)最大可能用量的357倍，说明 Tc-EDTA-MTI毒性低，可以保证临床的安全使用。
具体实施方式：
液进行了动物异常毒性实验。将制备好的 Tc-EDTA-MTI(总体积3.5mL，总活度为1mCi)标记液，取0.5mL通过尾静脉缓慢注射到体重为20g的昆明小白鼠体内，共5只，按药典规定观察48小时，未见异常反应，并且无一死亡。按给药量换算(每公斤体重)相当于人体
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(以50公斤为例)最大可能用量的357倍，说明 Tc-EDTA-MTI毒性低，可以保证临床的安全使用。
具体实施方式：
[0041] 下面通过实施例详述本发明：
[0042] 一种99Tcm-EDTA-MTI配合物：
[0043] a.配体EDTA-MTI的合成：
[0044] 第一步：在100mL圆底烧瓶中加入3.00gH4EDTA、5.6mLAc2O和5mL无水吡啶，温控65℃，搅拌反应26h后抽滤。用无水乙醚洗涤固体，后用比例为7∶3的DMF-Et2O溶-1液进行重结晶，可以得到白色固体2.10g，产率为：80％。其红外光谱数据为：v(IR)/cm ：
2852(CH2)，1808，1752(C＝O)，1077(C-O-C)。其熔点为：m.p.190～194℃。
2852(CH2)，1808，1752(C＝O)，1077(C-O-C)。其熔点为：m.p.190～194℃。
[0045] 第二步：在100mL圆底烧瓶中加入上一步得到的白色固体0.30g，甲硝唑0.40g和10mL无水吡啶，温控70℃反应24h后减压蒸干。往剩余物中加入无水乙醚后抽滤。用无水乙-1
醇进行重结晶得到浅黄色固体0.31g，产率为：44％。其红外光谱数据(IR)/cm ：3400(OH)，+ 1
1746(C＝O)，1365，1531(NO2)，1189，825(C-O-C)。ESI-MS：599.0(M+H)。核磁谱图：(H NMR，D2O)：δ7.82(s，2H，C＝C-H)，δ4.49(t，4H，-CH2-)，δ4.35(t，4H，-CH2-)，δ3.72(s，
醇进行重结晶得到浅黄色固体0.31g，产率为：44％。其红外光谱数据(IR)/cm ：3400(OH)，+ 1
1746(C＝O)，1365，1531(NO2)，1189，825(C-O-C)。ESI-MS：599.0(M+H)。核磁谱图：(H NMR，D2O)：δ7.82(s，2H，C＝C-H)，δ4.49(t，4H，-CH2-)，δ4.35(t，4H，-CH2-)，δ3.72(s，