表征遗传毒性的重组菌及其构建方法与应用

摘要

本发明公开了一种表征遗传毒性的重组菌及其构建方法与应用。该重组菌是染色体的recA基因中含有报道基因的不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADP1；所述报道基因与recA基因具有共同的启动子。所述recA基因中还可含有筛选标记基因，所述筛选标记基因位于所述报道基因的3’末端；所述筛选标记基因带有启动子。该重组菌暴露于遗传毒性的物质或具有DNA损伤能力的辐射后，报道基因表达产生报道产物，报道产物的量与遗传毒性呈剂量效应关系，可被用于评价样品的遗传毒性和辐射的DNA损伤强度。

权利要求

1.一种重组菌，是染色体的recA基因中含有报道基因的不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADP1；所述报道基因与recA基因具有共同的启动子；且所述报道基因的转录受recA基因启动子的调控；

所述recA基因中还含有筛选标记基因，所述筛选标记基因位于所述报道基因的3’末端；所述筛选标记基因带有启动子；

所述报道基因为发光基因，所述发光基因为luxCDABE，所述筛选标记基因为卡那霉素抗性基因；

所述含有发光基因和筛选标记基因的recA基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌的保藏编号为CGMCC No.2915。

3.权利要求1或2所述的重组菌在遗传毒性物质检测中的应用。

4.一种检测遗传毒性物质的方法，是将权利要求1或2所述的重组菌与待测溶液混合，培养所述重组菌，通过检测报道基因表达产物的量来判断待测溶液是否含有遗传毒性物质。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述待测溶液中还加入S9肝粒体酶。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述培养温度为37℃。

说明书

表征遗传毒性的重组菌及其构建方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及表征遗传毒性的重组菌及其构建方法与应用。

背景技术

[0002] 随着近代工业的发展，环境污染日趋严重，人类向环境中排放大量的有毒有害物质，危害人类健康，因此对有毒物质的检测至关重要。其中，对遗传毒物的重视和遗传毒性的检测，是近十年来备受关注的领域。通常对遗传毒物的检测有两种手段——物理化学方法和生物方法。理化方法基于对样品成分的仪器分析，如GC-MS或HPLC。通过理化手段可以获得样品的成分数据，经过毒性数据换算从而得到样品中该物质的毒性。但理化分析方法程序多，成本高，不适于现场快速和高通量的应用，而且所得到毒性数据未考虑该物质在环境中的生物有效性，更重要的是，结果忽略了毒性物质间的拮抗、加合和协同作用(Sorensen，S.J.，M.Burmolle，andL.H.Hansen，Making bio-sense of toxicity：new developments in whole-cellbiosensors.Current Opinion in Biotechnology，
2006.17(1)：p.11-16)。因此，生物手段在遗传毒性检测中具有重要的意义。其中生物传感细胞是其中发展较快的一类检测方法。

[0003] 遗传毒性检测的生物传感细胞是一类基因工程菌，其DNA包含启动基因和报道基因两个关键片段。报道基因不具有启动子。启动基因只在造成DNA损伤的毒性物质存在下被诱导表达，使得其下游的报道基因表达产生可被测量的产物，并随启动子表达强度升高而信号增强。

[0004] 在对大肠杆菌DNA损伤修复研究中，研究者发现了在损伤因素诱导下发生的SOS修复系统(孟紫强，环境毒理学.第一版.2000，北京：中国环境科学出版社.)。SOS系统由recA和lexA两个基因调控。LexA蛋白质在SOS系统中阻遏lexA、recA，umuDC、uvrA、uvrB、uvrC等基因的表达，当细胞暴露于遗传毒物时，RecA蛋白质被活化为蛋白酶，与阻遏蛋白LexA结合，使后者裂解。一旦LexA蛋白被裂解，所有参与SOS反应的基因都将充分表达，使细胞的修复得以发生。基于SOS系统，研究者通过分子生物学手段，构建了多种被SOS系统的启动子诱导表达的全细胞生物传感器。

[0005] 目前成熟的检测遗传毒性的生物传感器方法有umu/SOS显色实验法，SOSchromotest，Mutatox等，这些方法多已进行商业生产。其中umu方法和SOSchromotest方法有相应的ISO标准规范其使用方法。umu显色实验通过SOS系统的umuCD操纵子启动lacZ基因，SOS chromotest通过SOS过程中的sulA基因启动lacZ基因，从而实现通过监测报道基因的报道产物来检测遗传毒物的目的。SOS系统给出的检测结果与传统的检测致突变的Ames实验结果相关性很高，在数百种受试物中，SOS chromotest与Ames实验给出82％的相似结果(Quillardet，P.and M.Hofnung，The SOS chromotest：a review.Mutat Res，1993.297(3)：p.235-79.)。但umu与SOS方法的时间和成本上远优于Ames实验，已在大气、水体和土壤遗传毒性检测中广泛应用(潘峰，王万峰，时蕾，Umu测试法及其在环境科学中的应用.安徽农业科学，2007.35(8)：p.2208-2210.)。

[0006] 虽然以发光基因为报道基因的遗传毒性检测的基因工程菌在文献中有所报道，但由于构建手段的局限，宿主菌均采用大肠杆菌或鼠伤寒沙门菌。同时，实现生物传感的关键基因——启动基因和报道基因，都位于质粒载体中，以质粒的形式复制。因此需要特殊的培养条件，维持质粒。而且质粒的拷贝数不固定，会造成生物传感细胞表达不稳定。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供一种表征遗传毒性的重组菌及其构建方法与应用。

[0008] 本发明所提供的表征遗传毒性的重组菌，命名为Acinetobacter sp.ADP_recA_km_lux是染色体的recA基因中含有报道基因的不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADP1；所述报道基因与recA基因具有共同的启动子。

[0009] 所述报道基因与recA基因具有共同的启动子，其转录受recA基因启动子调控，recA基因的表达使得报道基因表达。

[0010] 本发明的重组菌的所述recA基因中还可含有筛选标记基因，所述筛选标记基因位于所述报道基因的3’末端；所述筛选标记基因带有启动子。

[0011] Acinetobacter sp.ADP_recA_km_lux中所述报道基因与recA基因具有共同的启动子，其转录受recA基因启动子调控，recA基因的表达使得报道基因表达。这样可使Acinetobacter sp.ADP_recA_km_lux暴露在遗传毒性的物质或具有DNA损伤能力的辐射下时，启动SOS修复系统的同时启动报道基因，通过报道产物的量的增加表征遗传毒性物质的存在。

[0012] Acinetobacter sp.ADP_recA_km_lux中所述筛选标记基因具有独立的启动子，该启动子为组成型表达，因此筛选标记基因表达不受遗传毒性物质影响，有利于重组菌的筛选。

[0013] 所述报道基因具体可为发光基因。

[0014] 所述发光基因具体可为luxCDABE，所述筛选标记基因具体可为卡那霉素抗性基因。所述含有发光基因和筛选标记基因的recA基因的核苷酸序列具体可为序列表中的序列1。

[0015] Acinetobacter sp.ADP_recA_km_lux已于2009年2月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.2925。

[0016] Acinetobacter sp.ADP_recA_km_lux CGMCC No.2915可以按照如下方法构建：

[0017] 1)构建如下的DNA分子，含有recA基因5’部分、发光基因luxCDABE、卡那霉素抗性基因和recA基因3’部分；自5’至3’末端依次为recA基因5’部分、发光基因、筛选标记基因和recA基因3’部分；所述recA基因5’部分的核苷酸序列为序列表中的序列1自5’末端第987-1362位，所述recA基因3’部分的核苷酸序列为序列表中的序列1自5’末端第8924-9584位；所述发光基因与recA基因具有共同的启动子；所述卡那霉素抗性基因的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第7222-8917位；

[0018] 2)将步骤1中构建的DNA分子导入不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADP1中，通过同源重组获得所述的重组菌。

[0019] 构建步骤1中的DNA分子可以用本领域公知的各种方法。如根据Acinetobactersp.ADP1染色体DNA序列，取recA基因上下游序列设计引物PCR分别扩增recA基因5’部分和recA基因3’部分，重叠PCR得到Acinetobacter sp.ADP1的recA基因，通过引物在recA基因的中引入限制性内切酶的酶切位点：再通过酶切位点在recA基因中插入发光基因luxCDABE和卡那霉素抗性基因。步骤1中构建的DNA分子导入不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADP1中可通过将该DNA分子插入各种商业化的载体中构建重组载体，将重组载体导入不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADP1。

[0020] 本发明的重组菌可用来检测遗传毒性物质。

[0021] 本发明的另一个目的是提供一种检测遗传毒性物质的方法。

[0022] 本发明所提供的检测遗传毒性物质的方法，是将所述的重组菌与待测溶液混合，培养所述重组菌，通过检测报道基因表达产物的量来判断待测溶液是否含有遗传毒性物质。

[0023] 其中，所述待测溶液中还可加入S9肝粒体酶。所述培养温度可为37℃。

[0024] 本发明的表征遗传毒性的重组菌，是在Acinetobacter sp.ADP1菌染色体的recA基因中插入发光基因片段luxCDABE和卡那霉素抗性基因。该重组菌暴露于遗传毒性的物质或具有DNA损伤能力的辐射后，会产生生物发光，发光强度与遗传毒性呈剂量效应关系，可被用于评价样品的遗传毒性和辐射的DNA损伤强度。

附图说明

[0025] 图1为Acinetobacter sp.ADP1-recA-km-lux染色体上构建的recA基因5’部分、发光基因luxCDABE、卡那霉素抗性基因和recA基因3’部分示意图。

[0026] 图2为暗箱中拍摄Acinetobacter sp.ADP1-recA-km-lux暴露于不同浓度丝裂霉素C后的发光响应照片。

[0027] 图3为Acinetobacter sp.ADP1-recA-km-lux对丝裂霉素C遗传毒性的剂量效应曲线。

[0028] 图4为Acinetobacter sp.ADP1-recA-km-lux对芘遗传毒性的剂量效应曲线。

[0029] 图5为地下水样品的遗传毒性。

具体实施方式

[0030] 下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。

[0031] 实施例1.不动杆菌Acinetobacter sp.ADP_recA_km_lux的构建

[0032] 1)在不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADP1的recA基因中构建BamHI和EcoRI限制性内切酶酶切位点

[0033] Acinetobacter sp.ADP1染色体DNA已全部测序，可由NCBI Genebank数据库获得。

[0034] 设计如下引物通过PCR反应获得Acinetobacter ADP1完整的recA基因的5’部分和3’部分：

[0035] P1：5’-TCATTAGCAATAAGAGGTTGGATCG-3’

[0036] P2：5’-TCGCACCAGAGCGTACAAGCGGATCCGGAATTCCC-3’

[0037] P3：5’-GGGAATTCCGGATCCGCTTGTACGCTCTGGTGCGA-3’

[0038] P4：5’-GGCTTCGCAATTGTACTCTGTG-3’

[0039] 其中，P1，P2为一对引物，用以扩增recA基因的5’部分；P3，P4为一对引物，用以扩增recA基因的3’部分。

[0040] 在引物P2和P3上分别设计EcoRI和BamHI的酶识别位点。

[0041] 以Acinetobacter ADP1细胞(Huang，W.E.，et al.，Chromosomally locatedgene fusions constructed in Acinetobacter sp.ADP1 for the detection ofsalicylate.Environmental Microbiology，2005.7(9)：p.1339-1348.(清华大学)为模板，PCR的反应条件如下：

[0042]第1个循环 94℃5分钟
第2-36个循环 94℃1分钟，
55℃1分钟，
72℃1.5分钟
第37个循环 72℃延伸10分钟

[0043] PCR产物进行1％的琼脂糖电泳后，使用Qiagen公司的QIAquick gel extractionkit进行切胶纯化。分别获得recA基因的5’部分和3’部分。

[0044] 2)recA基因的5’部分和3’部分连接。

[0045] 以步骤1)中所获得的recA基因的5’部分和3’部分为模板，同时以P1和P4为引物，进行重叠PCR反应，得到完整的recA基因。PCR反应条件如下：

[0046]第1个循环 95℃5分钟
第2-36个循环 95℃1分钟，
60℃1分钟，
72℃2.5分钟
第37个循环 72℃延伸10分钟

[0047] PCR产物进行1％的琼脂糖电泳后，使用Qiagen公司的QIAquick gel extractionkit进行切胶纯化。获得完整的recA基因。

[0048] 3)recA基因与pGEMT载体连接，进行克隆

[0049] 用T4DNA连接酶(New England Biolab)将步骤2)中经纯化的recA基因与商业载体pGEMT连接，获得重组表达载体pGEMT-recA，载体pGEMT-recA转化入大肠杆菌JM109感受态细胞(由Promega公司购得)，在含有氨苄西林，表面涂布IPTG和X-Gal的LB平板上进行蓝白筛选，得到重组菌。使用Qiaquick Prep Kit(Qiagen)提取重组菌质粒。

[0050] 4)在BamHI位点插入卡那霉素抗性基因

[0051] BamHI(New England Biolab)分别酶切步骤3)获得的质粒和pRMJ1质粒(Jones，R.M.and P.A.Williams，Mutational analysis of the critical bases involvedin activation of the AreR-regulated sigma(54)-dependent promoter inAcinetobacter sp strain ADP1.Applied and Environmental Microbiology，2003.69(9)：p.5627-5635.)(清华 大学)，分别 回收5676bp和1696bp 的片段，T4DNA 连接酶 (New England Biolab)将5676bp和1696bp的片段连接，获得含有卡那霉素抗性基因的重组表达载体pGEMT-recA-km，将其转化入大肠杆菌JM109感受态细胞(由Promega公司购得)，通过含有卡那霉素的LB培养基筛选重组体。

[0052] 5)在EcoRI位点插入发光基因

[0053] EcoRI内切酶(New England Biolab)分别酶切步骤4)所获得的含有卡那霉素抗性基因的重组表达载体和质粒pSalAR_lux(Huang，W.E.，et al.，Chromosomally located gene fusions constructed in Acinetobacter sp.ADP1for the detection of salicylate.Environmental Microbiology，2005.7(9)：p.1339-1348.(清华大学)，分别回收7372bp和5852bp的片段，T4DNA连接酶(New England Biolab)将7372bp和5852bp的片段连接，获得含有发光基因luxCDABE的重组表达载体pGEMT-recA-km-lux。
pGEMT-recA-km-lux转化入大肠杆菌JM109感受态细胞，在含有50mg/L卡那霉素和IPTG的LB培养基上筛选发光的菌落。

[0054] 6)与ADP1染色体同源重组

[0055] 为实现在ADP1染色体的recA基因上插入luxCDABE与卡那霉素抗性基因，需要对ADP1与步骤5)所获得的质粒进行同源重组。

[0056] Acinetobacter ADP1感受态细胞的制备：在LB培养基中接种AcinetobacterADP1细胞；28℃过夜培养的ADP1细胞按照体积比为1∶25接种至新鲜LB培养基，30℃下震荡培养3小时。

[0057] 同源重组：通过离心将感受态细胞浓缩十倍，加入1-10μL步骤5)所获得的质粒，在30℃下培养3小时。细胞涂布在含有卡那霉素的LB培养基上进行筛选，生长出的单克隆即为Acinetobacter sp.ADP_recA_km_lux。Acinetobacter sp.ADP1-recA-km-lux染色体上构建的recA基因、发光基因与卡那霉素抗性基因的位置关系示意图如图1。图1中实线表示Acinetobacter sp.ADP1-recA-km-lux染色体DNA。recA1和recA2为Acinetobacter sp.ADP1完整recA的5‘部分和3’部分。在其中插入了发光基因片段luxCDABE和卡那霉r素抗性片段km。图1中EcoRI与BamHI表示EcoRI与BamHI限制性内切酶识别位点。插r
入了发光基因luxCDABE和卡那霉素抗性基因km 的recA基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。

[0058] 实施例2.Acinetobacter sp.ADP_recA_km_lux对遗传毒性物质丝裂霉素C的响应

[0059] 1)细胞培养与准备

[0060] Acinetobacter sp.ADP_recA_km_lux单菌落接种至含有10mg/L卡那霉素的LB培养基(LBK)，30℃培养过夜。新鲜LBK培养基将细胞稀释10-25倍，获得细胞悬浮液，待用。

[0061] 2)样品准备

[0062] 分别配制浓度为0.0001、0.001、0.01、0.1和1ug/ml丝裂霉素C的水溶液。

[0063] 3)样品测试

[0064] 取200μL步骤1)中稀释的细胞悬浮液，加入黑色底透的96孔酶标版孔内。每孔分别加入不同浓度的2μL丝裂霉素C水溶液(0.03、0.3和3μM)，清水作为阴性对照。使用可以测量96孔板内化学发光和吸光度的多功能酶标仪(SpectraMax M2读板机，Molecular Devices Corporation)。在37℃测量每个微孔的化学发光(lum)，并读取该孔在600nm波长处的吸光度(OD600)。每隔30分钟或60分钟进行一次测量。测量期间96孔板在37℃下振荡培养。

[0065] 4)数据处理

[0066] 按如下公式计算相对发光值：RLU＝Lum/OD600

[0067] Acinetobacter sp.ADP_recA_km_lux对遗传毒性物质丝裂霉素C的响应如图2和图3所示，图2为暗箱中拍摄的丝裂霉素C诱导重组菌产生的化学发光。每一列包括三个平行样，由左至右丝裂霉素C最终浓度分别为0、0.03、0.3和3μM，随丝裂霉素C浓度升高，重组菌的化学发光增强。图3为暴露三小时后丝裂霉素C对重组菌相对发光的剂量效应曲线。丝裂霉素C的剂量与细胞相对发光强度具有较好的剂量效应关系。

[0068] 实施例3Acinetobacter sp.ADP_recA_km_lux对多环芳烃遗传毒性的检测[0069] 1)细胞培养与准备

[0070] Acinetobacter sp.ADP_recA_km_lux单菌落接种至含有10mg/L卡那霉素的LB培养基(LBK)，30℃培养过夜。新鲜LBK培养基将细胞稀释10-25倍，获得细胞悬浮液，待用。

[0071] 2)样品准备

[0072] 将芘溶解于DMSO溶剂，配置浓度为0.000001、0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1和1mM的芘溶液。

[0073] 3)样品测试

[0074] 取2μL芘溶液溶于18μL高纯水，并加入2μL S9肝粒体酶(Sigma公司，S2442)和3μL高纯水。随后与180μL步骤1)中稀释的细胞悬浮液在96孔板中混合。使用可以测量96孔板内化学发光和吸光度的多功能酶标仪(SpectraMax M2读板机，Molecular Devices Corporation)。在37℃测量每个微孔的化学发光(lum)，并读取该孔在600nm波长处的吸光度(OD600)。每隔30分钟或60分钟进行一次测量。测量期间96孔板在37℃下振荡培养。

[0075] 4)数据处理

[0076] 按如下公式计算相对发光值：RLU＝Lum/OD600

[0077] Acinetobacter sp.ADP_recA_km_lux对多环芳烃遗传毒性的剂量效应如图4所示，当芘浓度为4×10-6至4×10-3mM间时，随芘浓度提高，细胞的相对发光强度增强。

[0078] 实施例4 Acinetobacter sp.ADP_recA_km_lux对环境样品遗传毒性的检测[0079] 1)细胞培养与准备

[0080] Acinetobacter sp.ADP_recA_km_lux单菌落接种至含有10mg/L卡那霉素的LB培养基(LBK)，30℃培养过夜。新鲜LBK培养基将细胞稀释10-25倍，获得细胞悬浮液，待用。

[0081] 2)样品准备

[0082] 采集污染场表层与深层地下水(经测定其主要污染物为苯酚及其代谢中间产物)。

[0083] 3)样品测试

[0084] 分别取2μL表层与深层地下水溶于18μL高纯水，并加入2μL S9肝粒体酶(Sigma公司，S2442)和3μL高纯水。随后与180μL步骤1)中稀释的细胞悬浮液在96孔板中混合。使用可以测量96孔板内化学发光和吸光度的多功能酶标仪(SpectraMax M2读板机，Molecular Devices Corporation)。在37℃测量每个微孔的化学发光(lum)，并读取该孔在600nm波长处的吸光度(OD600)。每隔30分钟或60分钟进行一次测量。测量期间96孔板在37℃下振荡培养。

[0085] 4)数据处理

[0086] 按如下公式计算相对发光值：RLU＝Lum/OD600

[0087] Acinetobacter sp.ADP_recA_km_lux对环境样品遗传毒性的剂量效应如图5所示，表层与深层地下水均受到不同程度的污染，具有遗传毒性，且表层地下水样品的遗传毒性大于深层地下水样品。

[0088] Acinetobacter sp.ADP_recA_km_lux已于2009年2月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.2925。

[0089] 序列表

[0090] <110>清华大学

[0091] <120>表征遗传毒性的重组菌及其构建方法与应用

[0092] <160>1

[0093] <210>1

[0094] <211>10221

[0095] <212>DNA

[0096] <213>人工序列

[0097] <220>

[0098] <230>

[0099] <400>1

[0100] tcattagcaa taagaggttg gatcgcactg gtatggattt gatcaaattt ttaaaaagtt 60[0101] tcaatacagt caatacatat ttacttgtta cttcactatc attaatgagc ttggtcattt 120[0102] atttctatgt tataagccct aagtaaagcc actcacgtgg ctttttaatt ttttgagtca 180[0103] gattaattta actttttata cttacatttc ttaattcact cctcttttta agcaccaaaa 240[0104] aatgaatgat attggctaaa atcagcatca taataagagt tgaaacctag caaagagtcc 300[0105] ctatattaat agctatattg catcttctat cttgatacta tcaaaataga ttctgtttgc 360[0106] actttttcaa tttataagga ttttgatgtc tagacagcaa catgaagaac atagtattga 420[0107] ttctatgcga gttgataaat ggctatgggc tgctcgtttc tttaaaacac gttctatagc 480[0108] taaagcagcc atcgaaggcg gaaaagttca ccacaatagt gaacgtgtta aagtttccaa 540[0109] agaaattcgg gtaggaatgg aattgaccat tcagcaaggc tttgaaagaa aaactgttgt 600[0110] tgtaaaagca ttatctaata tgcggggacc tgcacctata gcacaacagc tctatgatga 660[0111] aactgaagtt agtattgcaa aaagagagtt gattgcttcg caaagaaaat tgcataattt 720[0112] agcccgacca gatcatcgtc cttctaaaaa agatcgacga cagattcatc ggtttaaaca 780[0113] 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