人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒

摘要

本发明涉及人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，其特征在于：包括分别包装的：标准阳性模板(a)、阴性参控品(b)、阳性参控品(c)、荧光定量反应液(d)、PCR上游引物(e)、PCR下游引物(f)和荧光探针(g)；还包括分别包装的RNA提取试剂和逆转录试剂。本发明具有以下优点：定量准确，可以准确定量检测病毒核酸；灵敏度及特异性高；检测速度快，仅需1小时，加上核酸的提取和逆转录，共仅需3-4小时；步骤简单；可同时进行高通量的样本检测。适用于人类偏肺病毒的临床或实验室定量及定性检测，人类偏肺病毒感染的早期诊断，监视和预测人类偏肺病毒流行性，以及对疗效进行监测和评估。

权利要求

1.人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，其特征在于：包括分别包装的标准阳性模板(a)、阴性参控品(b)、阳性参控品(c)、荧光定量反应液(d)、PCR上游引物(e)、PCR下游引物(f)和荧光探针(g)，还包括分别包装的RNA提取试剂(h)和逆转录试剂(i)；

所述的标准阳性模板(a)是含有插入人类偏肺病毒F基因1620个核苷酸特异序列的

10

pMD18-T载体质粒，浓度为1×10 拷贝/μl，容积为125μl至500μl，保存条件为-20℃；

插入的人类偏肺病毒F基因1620个核苷酸序列为：

atgtcttgga aagtgatgat tatcatttcg ttactcataa cacctcagca tggactaaaa 60gaaagttatt tagaagaatc atgtagtact ataactgaag gatatctcag tgttttaaga 120acaggttggt acaccaatgt ctttacatta gaagttggtg atgttgaaaa ccttacatgt 180actgatggac ctagcttaat caaaacagaa cttgacctaa ccaaaagtgc tctaagagaa 240ctcaaaacag tttctgctga tcagttagcg ggagaagaac aaattgaaaa tcccagacaa 300tcaaggtttg tcctaggtgc aatagctctc ggtgttgcca cagcagcagc agtcacagca 360ggcattgcaa tagccaaaac cataaggctt gagagtgaag tgaatgcaat caaaggtgct 420ctcaaaacaa ccagcgaggc agtatccaca ctaggaaatg gagtgcgagt cctagccacc 480gcagtaagag agctgaaaga atttgtgagc aaaaacctga ctagtgcaat taacaagaac 540aaatgtgaca ttgctgatct gaagatggct gtcagcttca gtcaattcaa cagaaggttc 600ctaaatgttg tgcggcagtt ttcagacaat gcagggataa caccagcaat atcattggac 660ctaatgactg atgctgagct ggccagagct gtatcataca tgccaacatc agcaggacag 720ataaaactaa tgttagagaa ccgtgcaatg gtgaggagaa aaggatttgg aatcttgata 780ggggtctacg gaagctccgt gatttacatg gtccagctgc cgatctttgg tgtcatagat 840acaccttgtt ggataatcaa agcagctccc tcttgttcag aaaaagatgg aaattatgct 900tgcctcctaa gagaagatca aggatggtat tgtaaaaatg caggatccac tgtttactac 960ccaaatgaaa aagactgcga aacaagaggt gatcatgttt tttgtgacac agcagcaggg 1020atcaatgttg ctgagcaatc aagagaatgc aacatcaaca tatctacaac caactaccca 1080tgcaaagtca gcacaggaag acaccctatc agcatggttg cactatcacc tctcggtgct 1140ttggtagctt gctacaaagg ggttagctgt tcgattggca gtaatcgggt tggaataatc 1200aaacaactac ctaaaggctg ctcatacata actaaccagg acgcagacac tgtaacaatt 1260gacaacactg tgtatcaact aagcaaagtt gagggtgaac agcatgtaat aaaagggaga 1320ccagtttcaa gcagtttcga tccaatcaag tttcctgagg atcagttcaa tgttgcgctt 1380gatcaagtct ttgaaagcat tgaaaacagt caagcactag tggaccagtc aaacaaaatt 1440ctgaacagtg cagaaaaagg aaacactggc ttcattattg taataatttt gattgctgtt 1500cttgggttaa ccatgatttc agtgagcatc atcatcataa tcaaaaaaac aaggaaaccc 1560acaggggcac ctccagagct gaatggtgtt accaacggcg gttttatacc gcatagttag 1620所述的阴性参控品(b)是从未感染人类偏肺病毒标准株的Vero-E6细胞株提取病毒RNA并逆转录获得的cDNA容积为100μl至400μl，保存条件为-20℃；

所述的阳性参控品(c)是人类偏肺病毒标准株感染Vero-E6细胞株后，提取病毒RNA并逆转录获得的cDNA，容积为100μl至400μl，保存条件为-20℃；

Tm

所述的荧光定量反应液(d)是Premix Ex Taq 试剂，容积为625μl至2500μl，保存条件为-20℃；

所述的PCR上游引物(e)是根据人类偏肺病毒F基因设计的；PCR上游引物(e)的浓度为10μM、容积为25μl至100μl；保存条件为-20℃；

PCR上游引物(e)序列为：5’-CGTTTCTAACATGCCGACATCTG-3’；

所述的PCR下游引物(f)是根据人类偏肺病毒F基因设计的；PCR下游引物(f)的浓度为10μM、容积为25μl至100μl；保存条件为-20℃；

PCR下游引物(f)序列为：5’-GCTCCCGTAGACCCCTATCAG-3’；

所述的荧光探针(g)是根据人类偏肺病毒F基因设计的；

荧光探针(g)序列为：5’-CCCTTTCTTCGCACCATCGCACGG-3’

荧光探针(g)的5’端标记的荧光报告基因是FAM，3’端标记的荧光受体基因为Eclipse淬灭基团；荧光探针的容积为50μl至200μl；保存条件为-20℃；

所述的RNA提取试剂(h)是QIAamp Viral RNA Mini KitRNA提取试剂，保存条件为室温；

TM

所述的逆转录试剂(i)是PrimeScript RT Reagent Kit逆转录试剂，保存条件为-20℃。

说明书

人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒

技术领域

[0001] 本发明属生物技术领域，涉及一种检测试剂盒，具体涉及人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒。

背景技术

[0002] 荧光定量PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。目前在科学研究和临床诊断中广泛使用。其中Taqman荧光定量技术的原理为：以Taqman荧光探针为基础；Taqman荧光探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，从而实现定量。

[0003] Taqman荧光定量技术的绝对定量方法，是依据标准曲线直接测定未知样本目标靶基因的量。标准曲线的制作为将hMPV F基因克隆后10倍稀释所进行的循环数定为CT点【Maril Martell，et al.J Clin Microbiol，1999：37(2)：327-332】。PCR条件相同时，模板量越高，CT值越低，CT值与模板量的对数值呈线性关系，依据CT值用已知浓度的DNA或制作曲线进行检测。C代表Cycle，T代表threshold，CT值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表CT值。因此，只要获得未知样本的CT值，即可从标准曲线上获得该样本的起始拷贝数。

[0004] 人类偏肺病毒(Human Metapneumovirus，hMPV)为荷兰学者于2001年首次在儿童呼吸道感染标本中分离得到的一种新的呼吸道病原体。该病毒可导致人的上下呼吸道感染，其临床特征类似于RSV(呼吸道合胞病毒)，主要症状包括咳嗽、咽痛、呼吸困难、缺氧、喘息等。自人类偏肺病毒发现以来，亚洲、北美洲、欧洲、南美洲、非洲、大洋洲均有其感染的流行病学报告，呈现全球流行趋势。在中国重庆和北京也有关于hMPV感染的报道。血清学研究表明hMPV已经在人群流行50年以上，大多数人在5岁时均已感染过hMPV。4～10.8％的呼吸道感染住院患儿同hMPV有关。hMPV还是引起老人和免疫缺陷患者严重呼吸道感染疾病的常见病原体，并可同其他一些病原体合并感染，如RSV，SARS-CoV(严重急性呼吸综合征冠状病毒)。由此可见，hMPV是一种常见的呼吸道病原体，建立准确的检测手段对于其早期诊断和治疗具有重要意义。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，它能用于感染人类偏肺病毒的检测，操作简便、快速准确，而且重复性好、通用性好、经济实用。

[0006] 本发明所述的人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，其特征在于：包括分别包装的：标准阳性模板(a)、阴性参控品(b)、阳性参控品(c)、荧光定量反应液(d)、PCR上游引物(e)、PCR下游引物(f)和荧光探针(g)。

[0007] 所述的人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，其还包括分别包装的RNA提取试剂和逆转录试剂，用于待测样本的前期处理。

[0008] 所述的人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，其所述的标准阳性模板(a)是含有10
插入人类偏肺病毒F基因1620个核苷酸特异序列的pMD18-T载体质粒，浓度为1×10 拷贝/μl，容积为125μl至500μl，保存条件为-20℃；

[0009] 插入的人类偏肺病毒F基因1620个核苷酸，其序列为：

[0010] atgtcttgga aagtgatgat tatcatttcg ttactcataa cacctcagca tggactaaaa 60[0011] gaaagttatt tagaagaatc atgtagtact ataactgaag gatatctcag tgttttaaga 120[0012] acaggttggt acaccaatgt ctttacatta gaagttggtg atgttgaaaa ccttacatgt 180[0013] actgatggac ctagcttaat caaaacagaa cttgacctaa ccaaaagtgc tctaagagaa 240[0014] ctcaaaacag tttctgctga tcagttagcg ggagaagaac aaattgaaaa tcccagacaa 300[0015] tcaaggtttg tcctaggtgc aatagctctc ggtgttgcca cagcagcagc agtcacagca 360[0016] ggcattgcaa tagccaaaac cataaggctt gagagtgaag tgaatgcaat caaaggtgct 420[0017] ctcaaaacaa ccagcgaggc agtatccaca ctaggaaatg gagtgcgagt cctagccacc 480[0018] gcagtaagag agctgaaaga atttgtgagc aaaaacctga ctagtgcaat taacaagaac 540[0019] aaatgtgaca ttgctgatct gaagatggct gtcagcttca gtcaattcaa cagaaggttc 600[0020] ctaaatgttg tgcggcagtt ttcagacaat gcagggataa caccagcaat atcattggac 660[0021] ctaatgactg atgctgagct ggccagagct gtatcataca tgccaacatc agcaggacag 720[0022] ataaaactaa tgttagagaa ccgtgcaatg gtgaggagaa aaggatttgg aatcttgata 780[0023] ggggtctacg gaagctccgt gatttacatg gtccagctgc cgatctttgg tgtcatagat 840[0024] acaccttgtt ggataatcaa agcagctccc tcttgttcag aaaaagatgg aaattatgct 900[0025] tgcctcctaa gagaagatca aggatggtat tgtaaaaatg caggatccac tgtttactac 960[0026] ccaaatgaaa aagactgcga aacaagaggt gatcatgttt tttgtgacac agcagcaggg 1020[0027] atcaatgttg ctgagcaatc aagagaatgc aacatcaaca tatctacaac caactaccca 1080[0028] tgcaaagtca gcacaggaag acaccctatc agcatggttg cactatcacc tctcggtgct 1140[0029] ttggtagctt gctacaaagg ggttagctgt tcgattggca gtaatcgggt tggaataatc 1200[0030] aaacaactac ctaaaggctg ctcatacata actaaccagg acgcagacac tgtaacaatt 1260[0031] gacaacactg tgtatcaact aagcaaagtt gagggtgaac agcatgtaat aaaagggaga 1320[0032] ccagtttcaa gcagtttcga tccaatcaag tttcctgagg atcagttcaa tgttgcgctt 1380[0033] gatcaagtct ttgaaagcat tgaaaacagt caagcactag tggaccagtc aaacaaaatt 1440[0034] ctgaacagtg cagaaaaagg aaacactggc ttcattattg taataatttt gattgctgtt 1500[0035] cttgggttaa ccatgatttc agtgagcatc atcatcataa tcaaaaaaac aaggaaaccc 1560[0036] acaggggcac ctccagagct gaatggtgtt accaacggcg gttttatacc gcatagttag1620。

[0037] 所述的人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，其所述的阴性参控品(b)是从未感染人类偏肺病毒标准株的Vero-E6细胞株(非洲绿猴肾细胞株)提取病毒RNA并逆转录获得的cDNA【cDNA(compl ementary DNA)是指在体外经反转录合成的、与RNA(通常指mRNA)互补的单链DNA】，容积为100μl至400μl，保存条件为-20℃。

[0038] 所述的人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，其所述的阳性参控品(c)是人类偏肺病毒标准株感染Vero-E6细胞株后，提取病毒RNA并逆转录获得的cDNA，容积为100μl至400μl，保存条件为-20℃。

[0039] 所述的人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，其所述的荧光定量反应液(d)是TmPremix Ex Taq 试剂(购自日本TaKaRa公司)，容积为625μl至2500μl，保存条件为-20℃。

[0040] 所述的人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，其所述的PCR上游引物(e)是根据人类偏肺病毒F基因设计的；上游引物的浓度为10μM、容积为25μl至100μl；保存条件为-20℃；

[0041] PCR上游引物序列为：5’-CGTTTCTAACATGCCGACATCTG-3’。

[0042] 所述的人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，其所述的PCR下游引物(f)是根据人类偏肺病毒F基因设计的；下游引物的浓度为10μM、容积为25μl至100μl；保存条件为-20℃；

[0043] PCR下游引物序列为：5’-GCTCCCGTAGACCCCTATCAG-3’。

[0044] 所述的人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，其所述的荧光探针(g)是根据人类偏肺病毒F基因设计的；

[0045] 荧光探针序列为：5’-CCCTTTCTTCGCACCATCGCACGG-3’

[0046] 荧光探针的5’端标记的荧光报告基因是FAM，3’端标记的荧光受体基因为Eclipse淬灭基团；荧光探针的容积为50μl至200μl；保存条件为-20℃。

[0047] 所述的人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，其所述的RNA提取试剂(h)是QIAamp Viral RNA Mini KitRNA提取试剂(购自德国QIAGEN公司)，保存条件为室温；所TM述的逆转录试剂(i)是PrimeScript RT Reagent Kit逆转录试剂(购自日本TaKaRa公司)，保存条件为-20℃。

[0048] 本发明具有以下优点：定量准确，可以准确定量检测病毒核酸；灵敏度及特异性高；检测速度快，仅需1小时，加上核酸的提取和逆转录，共仅需3-4小时；步骤简单；可同时进行高通量的样本检测。本发明适用于人类偏肺病毒的临床或实验室定量及定性检测，人类偏肺病毒感染的早期诊断，监视和预测人类偏肺病毒流行性，以及对疗效进行监测和评估。

附图说明

[0049] 图1是CT值与拷贝数的对数的标准曲线示意图。

具体实施方式

[0050] 实施例一：本发明所述的人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，包括分别包装的：标准阳性模板(a)、阴性参控品(b)、阳性参控品(c)、荧光定量反应液(d)、PCR上游引物(e)、PCR下游引物(f)和荧光探针(g)；

[0051] 本例的标准阳性模板(a)是含有插入人类偏肺病毒F基因1620个核苷酸特异序10
列的pMD18-T载体质粒，浓度为1×10 拷贝/μl，容积为125μl；将人类偏肺病毒F基因1620个碱基克隆到该载体中，转化大肠杆菌DH5 a增殖后，用碱列解法(具体实验条件和方法见J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南，第二版)提取质粒DNA，再用DNA纯化试剂盒(购自Clonetec公司)纯化，然后，用分光光度计A260定量并稀
10
释至1×10 拷贝/μl，保存条件为-20℃；pMD18-T载体购自日本TaKaRa公司，由该公司经pUC18载体改建而成，是一种高效克隆PCR产物的专用载体，具有同pUC18载体完全相同的功能，且能大大提高PCR产物的连接、克隆效率。

[0052] 本例的阴性参控品(b)是从未感染人类偏肺病毒标准株的Vero-E6细胞株(非洲绿猴肾细胞株凝取病毒RNA并逆转录获得的cDNA【cDNA(complementaryDNA)是指在体外经反转录合成的、与RNA(通常指mRNA)互补的单链DNA】，容积为100μl，保存条件为-20℃。

[0053] 本例的阳性参控品(c)是人类偏肺病毒标准株感染Vero-E6细胞株后，提取病毒RNA并逆转录获得的cDNA，容积为100μl，保存条件为-20℃。

[0054] 本例的荧光定量反应液(d)是Premix Ex TaqTm试剂(购自日本TaKaRa公司)，容积为625μl，保存条件为-20℃。

[0055] 本例的PCR上游引物(e)是根据人类偏肺病毒F基因设计的；上游引物的浓度为10μM、容积为25μl；保存条CC为-20℃；

[0056] PCR上游引物序列为：5’-CGTTTCTAACATGCCGACATCTG-3’。

[0057] 本例的PCR下游引物(f)是根据人类偏肺病毒F基因设计的；下游引物的浓度为10μM、容积为25μl；保存条件为-20℃；

[0058] PCR下游引物序列为：5’-GCTCCCGTAGACCCCTATCAG-3’。

[0059] 本例的荧光探针(g)是根据人类偏肺病毒F基因设计的；

[0060] 荧光探针序列为：5’-CCCTTTCTTCGCACCATCGCACGG-3’

[0061] 荧光探针的5’端标记的荧光报告基因是FAM，3’端标记的荧光受体基因为Eclipse淬灭基团；荧光探针的容积为50μl；保存条件为-20℃。

[0062] 实施例二：本发明所述的人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，包括分别包装的：标准阳性模板(a)、阴性参控品(b)、阳性参控品(c)、荧光定量反应液(d)、PCR上游引物(e)、PCR下游引物(f)和荧光探针(g)；还包括分别包装的用于待测样本的前期处理的RNA提取试剂和逆转录试剂。

[0063] 本例的标准阳性模板(a)是含有插入人类偏肺病毒F基因1620个核苷酸特异序10
列的pMD18-T载体质粒，浓度为1×10 拷贝/μl，容积为500μl；将人类偏肺病毒F基因
1620个碱基克隆到该载体中，转化大肠杆菌DH5 a增殖后，用碱列解法提取质粒DNA，再用
10
DNA纯化试剂盒(购自Clonetec公司)纯化，然后，用分光光度计A260定量并稀释至1×10拷贝/μl，保存条件为-20℃。

[0064] 本例的阴性参控品(b)是从未感染人类偏肺病毒标准株的Vero-E6细胞株(非洲绿猴肾细胞株)提取病毒RNA并逆转录获得的cDNA，容积为400μl，保存条件为-20℃。

[0065] 本例的阳性参控品(c)是人类偏肺病毒标准株感染Vero-E6细胞株后，提取病毒RNA并逆转录获得的cDNA，容积为400μl，保存条件为-20℃。

[0066] 本例的荧光定量反应液(d)是Premix Ex TaqTm试剂(购自日本TaKaRa公司)，容积为2500μl，保存条件为-20℃。

[0067] 本例的PCR上游引物(e)是根据人类偏肺病毒F基因设计的；上游引物的浓度为10μM、容积为100μl；保存条件为-20℃；

[0068] PCR上游引物序列为：5’-CGTTTCTAACATGCCGACATCTG-3’。

[0069] 本例的PCR下游引物(f)是根据人类偏肺病毒F基因设计的；下游引物的浓度为10μM、容积为至100μl；保存条件为-20℃；

[0070] PCR下游引物序列为：5’-GCTCCCGTAGACCCCTATCAG-3’。

[0071] 本例的荧光探针(g)是根据人类偏肺病毒F基因设计的；

[0072] 荧光探针序列为：5’-CCCTTTCTTCGCACCATCGCACGG-3’

[0073] 荧光探针的5’端标记的荧光报告基因是FAM，3’端标记的荧光受体基因为Eclipse淬灭基团；荧光探针的容积为200μl；保存条件为-20℃。

[0074] 本例的RNA提取试剂盒：是QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒(购自德国QIAGEN公司)，保存条件为室温。

[0075] 本例的逆转录试剂盒：是PrimeScriptTM RT Reagent Kit试剂盒(购自日本TaKaRa公司)，保存条件为-20℃。

[0076] 实施例三：本发明所述的人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒，包括分别包装的：标准阳性模板(a)、阴性参控品(b)、阳性参控品(c)、荧光定量反应液(d)、PCR上游引物(e)、PCR下游引物(f)和荧光探针(g)；还包括分别包装的用于待测样本的前期处理的RNA提取试剂和逆转录试剂。

[0077] 本例的标准阳性模板(a)是含有插入人类偏肺病毒F基因1620个核苷酸特异序10
列的pMD18-T载体质粒，浓度为1×10 拷贝/μl，容积为250μl；将人类偏肺病毒F基因
1620个碱基克隆到该载体中，转化大肠杆菌DH5a增殖后，用碱列解法提取质粒DNA，再用
10
DNA纯化试剂盒(购自Clonetec公司)纯化，然后，用分光光度计A260定量并稀释至1×10拷贝/μl，保存条件为-20℃。

[0078] 本例的阴性参控品(b)是从未感染人类偏肺病毒标准株的Vero-E6细胞株(非洲绿猴肾细胞株)提取病毒RNA并逆转录获得的cDNA，容积为200μl，保存条件为-20℃。

[0079] 本例的阳性参控品(c)是人类偏肺病毒标准株感染Vero-E6细胞株后，提取病毒RNA并逆转录获得的cDNA，容积为200μl，保存条件为-20℃。

[0080] 本例的荧光定量反应液(d)是Premix Ex TaqTm试剂(购自日本TaKaRa公司)，容积为1250μl，保存条件为-20℃。

[0081] 本例的PCR上游引物(e)是根据人类偏肺病毒F基因设计的；上游引物的浓度为10μM、容积为50μl；保存条件为-20℃；

[0082] PCR上游引物序列为：5’-CGTTTCTAACATGCCGACATCTG-3’。

[0083] 本例的PCR下游引物(f)是根据人类偏肺病毒F基因设计的；下游引物的浓度为10μM、容积为至50μl；保存条件为-20℃；

[0084] PCR下游引物序列为：5’-GCTCCCGTAGACCCCTATCAG-3’。

[0085] 本例的荧光探针(g)是根据人类偏肺病毒F基因设计的；

[0086] 荧光探针序列为：5’-CCCTTTCTTCGCACCATCGCACGG-3’

[0087] 荧光探针的5’端标记的荧光报告基因是FAM，3’端标记的荧光受体基因为Eclipse淬灭基团；荧光探针的容积为100μl；保存条件为-20℃。

[0088] 本例的RNA提取试剂盒：是QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒(购自德国QIAGEN公司)，保存条件为室温。

[0089] 本例的逆转录试剂盒：是PrimeScriptTM RT Reagent Kit试剂盒(购自日本TaKaRa公司)，保存条件为-20℃。

[0090] 实施例四：应用人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒检测临床呼吸道标本(也可用鼻咽分泌物标本、或痰标本)，使用该试剂盒进行检测包括以下步骤：

[0091] 第一步，使用RNA提取试剂(h)，提取待测样本的RNA，保存于-80℃备用；待测样本是人呼吸道标本；

[0092] 第二步，将第一步获得的待测样本的RNA，使用逆转录试剂(i)逆转录为cDNA，于-20℃保存备用；

[0093] 第三步，用蒸馏水溶解标准阳性模版(a)，并将其系列稀释为1×109拷贝/μl、8 7 6 5 4
1×10 拷贝/μl、1×10 拷贝/μl、1×10 拷贝/μl、1×10 拷贝/μl、1×10 拷贝/μl、
3 2 1
1×10 拷贝/μl、1×10 拷贝/μl、1×10 拷贝/μl，共9管系列稀释品，于-20℃保存备用；

[0094] 第四步，PCR扩增，取荧光定量反应液(d)12.5μl、取PCR上游引物(e)0.5μl、取PCR下游引物(f)0.5μl、取荧光探针(g)1μl、取蒸馏水8.5μl和模板2μl，共25μl组成多个PCR反应体系；

[0095] 所述的模板为第二步获得的cDNA、第三步获得的系列稀释品、阴性参控品(b)、或者为阳性参控品(c)；

[0096] PCR扩增时，各反应体系中，至少需要包含5个第三步获得的系列稀释品、阴性参控品(b)、阳性参控品(c)和至少1个第二步获得的待测样本的cDNA；其中系列稀释品用于制作标准曲线，阴性参控品作为PCR反应的阴性对照，阳性参控品作为PCR反应的阳性对照，以检测PCR反应系统是否正常；

[0097] 第五步，使用荧光定量检测仪对第四步获得的反应体系进行PCR循环检测，设置PCR的反应条件为：先95℃变性10秒；再95℃、10秒→60℃、30秒→95℃、10秒→60℃、30秒…设置40个循环；目的是检测循环的CT值(即：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)；

[0098] 第六步，通过比较待测样本和系列稀释标准阳性模板的标准曲线，对待测样本的起始拷贝数进行定量(见附图1)，该步骤由美国BIO-RAD公司的CFX-96荧光定量PCR检测仪自动完成，定量结果由该检测仪自动计算得出；

[0099] 第七步，在PCR反应系统正常的情况下，即PCR反应结束后荧光定量检测仪在阴性参控品管中未检测到荧光信号，而在阳性参控品管中检测到≥500个拷贝的人类偏肺病毒，通过对照标准曲线获得待测样本的人类偏肺病毒拷贝数，拷贝数≥500的判定为人类偏肺病毒感染，其余为阴性。

[0100] 每个呼吸道样本设置3个重复，以保证实验的精确性和稳定性；

[0101] 实施例五：应用人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒检测体外感染实验的细胞(也可用上清液标本)，使用该试剂盒进行检测包括以下步骤：

[0102] 第一步，使用RNA提取试剂(h)，提取待测样本的RNA，保存于-80℃备用；待测样本是体外感染实验的细胞；

[0103] 第二步，将第一步获得的待测样本的RNA，使用逆转录试剂(i)逆转录为cDNA，于-20℃保存备用；

[0104] 第三步，用蒸馏水溶解标准阳性模版(a)，并将其系列稀释为1×109拷贝/μl、8 7 6 5 4
1×10 拷贝/μl、1×10 拷贝/μl、1×10 拷贝/μl、1×10 拷贝/μl、1×10 拷贝/μl、
3 2 1
1×10 拷贝/μl、1×10 拷贝/μl、1×10 拷贝/μl，共9管系列稀释品，于-20℃保存备用；

[0105] 第四步，PCR扩增，取荧光定量反应液(d)12.5μl、取PCR上游引物(e)0.5μl、取PCR下游引物(f)0.5μl、取荧光探针(g)1μl、取蒸馏水8.5μl和模板2μl，共25μl组成多个PCR反应体系；

[0106] 所述的模板为第二步获得的cDNA、第三步获得的系列稀释品、阴性参控品(b)、或者为阳性参控品(c)；

[0107] PCR扩增时，各反应体系中，至少需要包含5个第三步获得的系列稀释品、阴性参控品(b)、阳性参控品(c)和至少1个第二步获得的待测样本的cDNA；其中系列稀释品用于制作标准曲线，阴性参控品作为PCR反应的阴性对照，阳性参控品作为PCR反应的阳性对照，以检测PCR反应系统是否正常；

[0108] 第五步，使用荧光定量检测仪对第四步获得的反应体系进行PCR循环检测，设置PCR的反应条件为：先95℃变性10秒；再95℃、10秒→60℃、30秒→95℃、10秒→60℃、30秒…设置40个循环；目的是检测循环的CT值(即：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)；

[0109] 第六步，通过比较待测样本和系列稀释标准阳性模板的标准曲线，对待测样本的起始拷贝数进行定量(见附图1)，该步骤由美国BIO-RAD公司的CFX-96荧光定量PCR检测仪自动完成，定量结果由该检测仪自动计算得出；

[0110] 第七步，在PCR反应系统正常的情况下，即PCR反应结束后荧光定量检测仪在阴性参控品管中未检测到荧光信号，而在阳性参控品管中检测到≥500个拷贝的人类偏肺病毒，通过对照标准曲线获得待测样本的人类偏肺病毒拷贝数，拷贝数≥500的判定为人类偏肺病毒感染，其余为阴性。

[0111] 序列表

[0112] SEQUENCE LISTING

[0113] <110>重庆医科大学附属儿童医院

[0114] <120>人类偏肺病毒的荧光定量检测试剂盒

[0115] <160>4

[0116] <210>1

[0117] <211>1620

[0118] <212>DNA

[0119] <213>偏肺病毒属(Metapneumovirus genus.)

[0120] <220>

[0121] <221>Human Metapneumovirus

[0122] <400>1

[0123] atgtcttgga aagtgatgat tatcatttcg ttactcataa cacctcagca tggactaaaa 60[0124] gaaagttatt tagaagaatc atgtagtact ataactgaag gatatctcag tgttttaaga 120[0125] acaggttggt acaccaatgt ctttacatta gaagttggtg atgttgaaaa ccttacatgt 180[0126] actgatggac ctagcttaat caaaacagaa cttgacctaa ccaaaagtgc tctaagagaa 240[0127] ctcaaaacag tttctgctga tcagttagcg ggagaagaac aaattgaaaa tcccagacaa 300[0128] tcaaggtttg tcctaggtgc aatagctctc ggtgttgcca cagcagcagc agtcacagca 360[0129] ggcattgcaa tagccaaaac cataaggctt gagagtgaag tgaatgcaat caaaggtgct 420[0130] ctcaaaacaa ccagcgaggc agtatccaca ctaggaaatg gagtgcgagt cctagccacc 480[0131] gcagtaagag agctgaaaga atttgtgagc aaaaacctga ctagtgcaat taacaagaac 540[0132] aaatgtgaca ttgctgatct gaagatggct gtcagcttca gtcaattcaa cagaaggttc 600[0133] ctaaatgttg tgcggcagtt ttcagacaat gcagggataa caccagcaat atcattggac 660[0134] ctaatgactg atgctgagct ggccagagct gtatcataca tgccaacatc agcaggacag 720[0135] ataaaactaa tgttagagaa ccgtgcaatg gtgaggagaa aaggatttgg aatcttgata 780[0136] ggggtctacg gaagctccgt gatttacatg gtccagctgc cgatctttgg tgtcatagat 840[0137] acaccttgtt ggataatcaa agcagctccc tcttgttcag aaaaagatgg aaattatgct 900[0138] tgcctcctaa gagaagatca aggatggtat tgtaaaaatg caggatccac tgtttactac 960[0139] ccaaatgaaa aagactgcga aacaagaggt gatcatgttt tttgtgacac agcagcaggg 1020[0140] atcaatgttg ctgagcaatc aagagaatgc aacatcaaca tatctacaac caactaccca 1080[0141] tgcaaagtca gcacaggaag acaccctatc agcatggttg cactatcacc tctcggtgct 1140[0142] ttggtagctt gctacaaagg ggttagctgt tcgattggca gtaatcgggt tggaataatc 1200[0143] aaacaactac ctaaaggctg ctcatacata actaaccagg acgcagacac tgtaacaatt 1260[0144] gacaacactg tgtatcaact aagcaaagtt gagggtgaac agcatgtaat aaaagggaga 1320[0145] ccagtttcaa gcagtttcga tccaatcaag tttcctgagg atcagttcaa tgttgcgctt 1380[0146] gatcaagtct ttgaaagcat tgaaaacagt caagcactag tggaccagtc aaacaaaatt 1440[0147] ctgaacagtg cagaaaaagg aaacactggc ttcattattg taataatttt gattgctgtt 1500[0148] cttgggttaa ccatgatttc agtgagcatc atcatcataa tcaaaaaaac aaggaaaccc 1560[0149] acaggggcac ctccagagct gaatggtgtt accaacggcg gttttatacc gcatagttag 1620[0150] <210>2

[0151] <211>23

[0152] <212>DNA

[0153] <213>人工序列

[0154] <220>

[0155] <221>PCR上游引物

[0156] <400>2

[0157] cctttctaac atgcccacat ctc 23

[0158] <210>3

[0159] <211>21

[0160] <212>DNA

[0161] <213>人工序列

[0162] <220>

[0163] <221>PCR下游引物

[0164] <400>3

[0165] gctcccgtag acccctatca g 21

[0166] <210>4

[0167] <211>24

[0168] <212>DNA

[0169] <213>人工序列

[0170] <220>

[0171] <221>荧光探针

[0172] <400>4

[0173] ccctttcttc gcaccatccc acgg 24