控制水稻纤维素合成的基因BC1L4作为水稻遗传改良的应用

摘要

本发明公开了一个水稻纤维素合成基因BC1L4的克隆及应用。具体涉及利用水稻T-DNA插入突变体库分离克隆水稻纤维素合成基因BC1L4，通过互补实验和纤维素含量测定等实验证明BC1L4基因具有控制水稻纤维素合成和结实率的功能。BC1L4基因属于COBRA基因家族，该家族成员在植物纤维素的合成中起重要作用。本发明克隆的基因具有调节水稻秸秆纤维素含量和产量的能力。本发明在利用基因工程技术有目的地改善提高水稻的产量、改善植物的材质、提高秸秆资源的利用率等方面具有重要的应用价值。

权利要求

1.一种控制水稻纤维素合成的基因BC1L4在水稻遗传改良中的应用，其特征在于，所述的基因BC1L4的核苷酸序列如序列表SEQ NO：1所示。

说明书

控制水稻纤维素合成的基因BC1L4作为水稻遗传改良的应

用

技术领域

[0001] 本发明属于植物植物基因工程领域。具体涉及一个控制水稻纤维素合成和产量的基因BC1L4的克隆、功能验证和应用。本发明利用T-DNA标签技术，利用正向遗传学的方法，从水稻T-DNA插入突变体库中得到了一个控制水稻纤维素合成和结实率的基因BC1L4，并通过转基因互补实验验证了BC1L4基因的功能。本发明还涉及利用该基因或其功能类似物改变细胞壁组分如纤维素、木质素、半纤维素及成分，从而促进秸杆资源的有效利用。

背景技术

[0002] 水稻是世界上最重要的粮食作物之一，它养育了全球近半数的人口，如何提高水稻的产量是关系到国计民生的重要问题。除生产稻谷外，水稻的秸杆还可以作为一种可再生的生物能源加以利用。随着石油资源的日趋衰竭，世界能源危机正威胁着人类社会的进步。发展可再生能源，尤其是利用生物质能，引起了全球的广泛关注。纤维素是水稻秸杆的主要成分之一，它是世界上最丰富的天然有机物，蕴藏着植物界碳含量的50％以上，植物光合作用的大部分能量以纤维素的形式储存下来。人类一旦掌握了释放出存储在纤维素中能量的技术，能源危机便可迎刃而解。利用纤维素资源生产生物乙醇被认为是解决能源危机的最为理想的办法。纤维素通过酶法或者化学转化，可降解成葡萄糖、木糖等物质，进一步通过工业发酵，形成生物乙醇替代石油，这是人类利用植物源能源的最初设想。但是由于纤维素结构复杂，纤维素大分子的降解一直是生产环节中的难点，目前围绕着提高纤维素的转化率开展了多方面研究，如重整天然纤维素的结构，降低结晶度，脱木质素等等，一旦解决了纤维素转化的难题，人类在利用植物源能源方面将取得突破性进展(张卫明等，生物质能的利用和能源植物的开发。2007，南京师大学报，30：68-74)。

[0003] 天然纤维素以微纤丝的形式存在。纤维素微纤丝由一种不分支的β-1，4-D-葡萄糖链组成，每条链含有几千到上万个葡萄糖分子。每条纤维素微纤丝约3纳米厚，由36条平行的葡萄糖链包装而成。葡萄糖链之间通过氢键结合，形成致密的结晶结构(Taylor等，Cellulose biosynthesis and deposition in higher plants.2008，New phytologist，178：239-252)。由于纤维素微纤丝结构致密，使得纤维素难以降解。近年来，人们通过对不同细胞壁合成突变体的研究，发现一些纤维素合成突变体具有非结晶态的纤维素组成，这种非结晶态的纤维素很容易被降解。所以通过对纤维素合成相关基因进行适当的基因工程改造，可以人为地改造天然纤维素的结构，降低纤维素结晶度，从而效利用纤维素生物能源。

[0004] 利用突变体资源，人们已经克隆了几个纤维素合成相关的基因。例如，CESA1基因是最早克隆的纤维素合成酶基因，它的突变能引起细胞壁纤维素含量的减少，并引起大量非结晶态纤维素的积累(Arioli等，Molecular analysis of cellulose biosynthesis in Arabidopsis.1998，Science，279：717-720)；KORRIGAN基因编码一种β-1，4葡萄糖酶，它突变后导致植物纤维素含量的减少及结晶度的降低(Nicol等，A plasmamembrane-bound putative endo-1，4-beta-D-glucanase is required for normal wall assembly and cell elongation inArabidopsis.1998，EMBO J，17：5563-5576)；KOBITO1基因突变后能导致纤维素合成受阻及纤维素沉积方向的杂乱(Pagant等，KOBITO1 encodes a novel plasma membrane protein necessary for normal synthesis ofcellulose during cell expansion in Arabidopsis.2002，Plant Cell，14：2001-2013)；拟南芥中的COBRA基因突变能引起植株纤维素含量的下降及其排列方向的杂乱(Schindelman等，COBRA encodes aputativeGPI-anchored protein，which is polarly localized and necessary for oriented cell expansion in Arabidopsis.2001，Genes Dev，15：1115-1127)。这些基因突变体的一个共同特征就是纤维素含量和结晶度的下降，利用这一特点人们可以通过基因工程手段改变天然纤维素的结构，使其易于降解，生产生物能源。

[0005] COBRA编码一种糖磷脂酰肌醇锚定蛋白，属于一个植物特有的蛋白质超家族。COBRA家族在拟南芥中有12个成员，在水稻中有11个成员，在玉米中有9个成员(Roudier等，The COBRA family of putativeGPI-anchored proteins in Arabidopsis.A new fellowship in expansion.2002，Plant Physiol，130：538-548；Li 等，BRITTLE CULM1，which encodes a COBRA-like protein，affects the mechanical properties of rice plants.2003，Plant Cell，15：2020-2031；Brady 等，Combining Expression and Comparative Evolutionary Analysis.The COBRAGene Family.2007，Plant Physiol，143：172-187)。除COBRA外，该家族的多个成员参与植物细胞壁及纤维素生物合成，如AtCOBL4、OsBC1和ZmBK2，这些基因突变后分别引起拟南芥、水稻和玉米植株茎杆机械力的降低和纤维素含量的减少(Persson等，Identification of genes required for cellulose synthesis by regressionanalysis of public microarray data sets.2005，Proc Natl Acad Sci USA，102：8633-8638；Li 等，BRITTLE CULM1，which encodes a COBRA-like protein，affects the mechanical properties of rice plants.2003，Plant Cell，
15：2020-2031；Ching等，Brittle stalk 2 encodes a putative glycosylphosphatidylinositol-anchored protein that affectsmechanical strength of maize tissues by altering the composition and structure of secondary cell.2006，Planta，224：
1174-84)。

[0006] 本发明通过T-DNA标签技术首次从水稻突变体库中分离克隆BC1L4基因，该基因编码一个COBRA-like蛋白，突变体表型分析及互补分析表明BC1L4基因在控制水稻产量和纤维素合成过程中起重要作用。对该基因的研究有助于人们了解水稻生长发育的分子机制，利用现代基因工程方法，改造纤维素含量和结构，提高谷物的产量，培育优质高产的能源型新品种，对于减缓能源危机和食品危机具有双重意义。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供一个利用突变体克隆的调控水稻纤维素合成和产量的基因BC1L4的应用，通过遗传转化方法将所述的基因转化到水稻植物体内，以调控植物的纤维素结构或/和水稻产量。

[0008] 本发明通过以下技术方案实现：

[0009] 申请人克隆得到一个控制水稻纤维素合成基因BC1L4，该基因BC1L4是下列核苷酸序列之一：

[0010] 1)序列表SEQ NO：1中所示的DNA序列；或

[0011] 2)编码与1)编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列。

[0012] 本发明克隆的水稻BC1L4基因的T-DNA插入失活突变体表现为分蘖少、矮化、纤维素含量降低和结实率下降，正常功能的BC1L4基因转化该突变体后植株恢复植株纤维素含量，植株结实率正常(见实施例1-3)。此外，BC1L4基因与几个纤维素合成相关基因共表达，它们之间存在一种负反馈的调节模式，为基因工程操作纤维素合成提供了研究机理(见实施例4)。

[0013] 本发明还提供了一种利用BC1L4基因进行高效植物遗传转化的方法。具体地说，本发明提供了一种含有SEQ ID NO：1所示序列的基因或该基因的部分类似功能片段的载体，如图3A所示的互补载体pCg001(见实施例3所示)。本发明还有一种含有以上表达载体的宿主细胞。宿主细胞包括大肠杆菌、农杆菌和植物细胞。

[0014] 本发明克隆的BC1L4基因可用于与其它调控元件，如组成型启动子(如CaMV35S启动子)或器官特异性启动子融合构建基因表达载体，通过转基因技术、反义RNA或RNAi等技术人为调控水稻结实率及调节纤维素合成和降解，从而达到有效增强水稻产量和提高秸杆的利用率的目的。

[0015] 实现本发明的具体技术步骤如下：

[0016] 1.利用已有的水稻T-DNA插入突变体库(突变体库的创建方法已经公开发表论文，见Wu等，Development of enhancer trap lines for functional analysis of the rice genome，Plant J(2003)：418-427；Zhang等，Non-random distribution of T-DNA insertions at various levels of the genome hierarchy as revealed bvanalyzing13，804 T-DNA flanking sequences from an enhancer-trap mutant library，Plant J(2007)：947-959)筛选得到一个分蘖少、矮化、结实率低的突变体bc1l4，突变体的筛选鉴定方法见实施例1第1部分中详细描述。

[0017] 2.通过测定纤维素含量测定和纤维素染色，发现在bc1l4突变体中纤维素含量明显下降，表明该基因能够调控水稻纤维素的合成(见实施例2)。

[0018] 3. 采 用 Tail-PCR 方 法 (Zhang 等，Non-random distribution of T-DNA insertions at various levels of thegenome hierarchy as revealed by analyzing13，804 T-DNA flanking sequences from an enhancer-trap mutantlibrary，Plant J(2007)：947-959)分离bc1l4突变体的侧翼序列，通过序列分析显示T-DNA插入BC1L4基因(LOC_Os05g32110，www.tigr.org/tdb/e2k1/osa1/index.shtml)的编码序列中(实施例
1第2部分)。

[0019] 4.通过T-DNA插入与突变性状的共分离验证(按实施例1的第3部分T-DNA插入与突变表型的共分离检测执行)及功能互补实验(见实施例3)证明本发明获得的候选基因BC1L4的失活是引起bc1l4突变表型的原因。

[0020] 5.利用本室的CREP数据库(http://crep.ncpgr.cn/crep-cgi/home.p1)搜索BC1L4基因的表达模式，发现BC1L4基因与几个纤维素合成相关基因共表达；利用定量RT-PCR技术分析bc1l4突变体和野生型植株中几个纤维素合成相关基因的表达，发现BC1L4基因的突变能引起一系列纤维素合成基因表达量的上升(见实施例4)。

[0021] 更详细的技术发明细节将由下述实施例给出。

[0022] 本发明的优点：1.本发明利标签发克隆基因快速、高效。2.本发明提供了一个调控水稻纤维素合成、影响水稻产量的基因BC1L4及其编码蛋白。该基因对于水稻纤维素合成分子机理的研究具有重要的理论价值。3.将含有SEQ ID NO：1所示序列的基因或该基因的部分类似功能的DNA片段进行改造，导入植物体，可以人工提高水稻的产量及改变细胞壁纤维素的含量和结构，从而为有效利用纤维素资源提供了一条经济、快速、有效的途径，具有重要的实际应用价值。

附图说明

[0023] 下面结合附图对理解本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明作限定。

[0024] 图1.水稻bc1l4突变体的表型。(A)野生型植株(WT)与bc1l4突变体成熟期的表型，bc1l4突变体与野生型相比分蘖较少、矮化。(B)野生型植株(WT)与bc1l4突变体穗部的表型差异，bc1l4突变体穗变小、结实率降低。

[0025] 图2.野生型植株(WT)和bc1l4突变体的纤维素含量。(A)bc1l4突变体纤维素含量较对照明显降低，减少约24％。标准误取自5次生物学重复。(B-E)对野生型(B、D)与bc1l4突变体(C、E)的第二节间进行Calcofluor(fluorescent brightener 28；Sigma)纤维素染色，可见bc1l4突变体颜色较浅，即纤维素含量较少。

[0026] 图3.BC1L4基因与突变表型的共分离验证。(A)BC1L4基因的结构和T-DNA插入位点分析。起始密码(ATG)和终止密码(TGA)已经标出，方框表示BC1L4基因的外显子，方框之间的线条表示内含子，T-DNA插入在第四个外显内。LB和RB分别代表T-DNA的左边界和右边界。P1，P2表示跨T-DNA的两条基因组引物，P3表示位于T-DNA上的边界引物。(B)T1代共分离实验胶图。植株基因型的确定：BC1L4纯合T-DNA插入植株当P2和P3配对时可以扩增出目标产物，由于T-DNA插入片段太大，P1与P2配对无扩增产物；野生型植株由于无T-DNA插入，故P2和P3配对无扩增产物，但P1与P2配对扩增能得到目标产物；而BC1L4杂合T-DNA插入转基因植株用P1和P2配对以及P2和P3配对时都可以得到目的产物。W代表野生基因型的植株，H代表杂合基因型的植株。M代表纯合基因型的植株。植株表型：20个T1代单株中第4、5、6、14株为突变表型。由图可知突变植株的基因型均为BC1L4纯合T-DNA插入，而正常植株的基因型为野生或杂合型，这一结果表明突变表型与BC1L4基因内的T-DNA插入共分离。

[0027] 图4.功能互补实验。(A)互补载体pCg001结构示意图，该载体的构建说明见实施例3中的第1部分，即将基因BC1L4的启动子和全长基因通过HindIII酶切后克隆到载体pCAMBIA2300(购自CAMBIA公司，http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/overview.html)上形成的新质粒。pC2301空载体作为阴性对照。(B)功能互补实验中转空载体的植株仍为突变表型，而转BC1L4基因的植株恢复野生型表型，即BC1L4基因能互补bc1l4突变体的突变表型。左边是野生型，中间是空载体转化株，右边为恢复正常表型的互补载体转化株。

[0028] 图5.几个纤维素合成相关基因在野生型和bc1l4突变体中的表达差异。可见所有检测的纤维素合成相关基因的表达水平在bc1l4突变体中都呈现上升的趋势，这反映了纤维素合成过程中的一种反馈调节机制。

具体实施方式

[0029] 实施例1：BC1L4基因的分离克隆

[0030] 1.bc1l4突变体的获得

[0031] 所用的水稻T-DNA插入突变体库由本申请人所在作物遗传改良国家重点实验室利用载体pFX-E24.2-15R构建而成的(Wu等，Development of enhancer trap lines for functional analysis of the ricegenome.2003，Plant J，35：418-427；Zhang等，Non-random distribution of T-DNA insertions at various levels ofthe genome hierarchy as revealed by analyzing 13，804 T-DNA flanking sequences from an enhancer-trap mutantlibrary.2007，Plant J，49：947-959)。该突变体库已向全世界公开(http://rmd.ncpgr.cn/)，可以通过常规手续索取。2005年，从T0代突变体库(见http://rmd.ncpgr.cn/，Zhang等，RMD：a rice mutant database for functionalanalysis of the rice genome，Nucl Acids Res(2006)：D745-D748)挑选出2000份水稻转基因品种“中花11号(为中国农业科学院培育的常用水稻品种)”的种子，经浸种、催芽等常用步骤后播于秧田，20天后移栽至大田。每份材料种两行，每行10株，为一个家系。种植密度为5寸×8寸，种植地点为湖北省武汉市洪山区狮子山地区华中农业大学的试验田，按常规的水稻种植方法进行田间管理。经过大田筛选共获到60个分蘖性状突变的家系，主要包括分蘖多、分蘖少及分蘖角度等类型的突变体。其中，有一个家系的突变体表型为分蘖少、矮化、穗小、结实率降低(如图1)，申请人把这个突变体命名为bc1l4。

[0032] 2.分离bc1l4突变体T-DNA插入位点的侧翼序列

[0033] 利用Tail-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR)技术(Liu等，Thermal symmetric interlaced PCR：automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1 and YAC clones for chromosomalwalking.1995，Genomics，25：674-681；Zhang等，Non-random distribution of T-DNA insertions at variouslevels of the genome hierarchy as revealed by analyzing 13，804 T-DNA flanking sequences from an enhancer-trapmutant library.2007，Plant J，49：947-959)分离了这个家系的侧翼序列。根据侧翼序列与水稻基因组的匹配情况确定插入位点，结果发现该侧翼序列位于水稻的第5染色体上，插入位点对应于水稻基因组注释网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)上的一个基因(登录号：LOC_Os05g32110)，该基因为COBRA蛋白家族的一个成员，命名为BC1L4。BC1L4基因包括6个外显子和5个内含子，T-DNA插入第4个外显子中(见图3A)。

[0034] 利用Tail-PCR方法(文献参见本实施例)分离得到的bc1l4突变体T-DNA插入位点的侧翼序列如下：

[0035] cgggggggatttcgtacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgt

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[0057] caagg

[0058] 3.BC1L4基因的突变导致植株矮小、结实率低的表形

[0059] 为了证实分蘖少、矮化、结实少的突变表型是由于BC1L4基因内的T-DNA插入引起，本发明对20个T1代转基因植株(其中，第4、5、6、14株为突变表型)进行了T-DNA插入位点侧翼序列与突变表型的共分离检测。共分离检测的具体步骤为：(1)在BC1L4基因T-DNA插入位点两侧设计一对基因组引物P1(5’-CTGGGACTACCAACAAGACA-3’)和 P2(5’-AGTTAGGATGTTGAGCGACC-3’)，在 T-DNA 上 设 计 一 条 载 体 引 物P3(5’-AATCCAGATCCCCCGAATTA-3’)，如图3A。在T1代植株中，BC1L4纯合T-DNA插入植株只有当P2和P3配对时才可以扩增出目标产物，由于T-DNA插入片段太大，P1与P2配对扩增的产物无法得到；野生型植株由于没有T-DNA的插入，所以P2和P3配对扩增没有产物，但可以利用引物P1与P2配对扩增得到目标产物；而BC1L4杂合T-DNA插入转基因植株则P1和P2配对以及P2和P3配对时都可以扩增得到产物。(2)应用CTAB法(参照Liu等，A genome-wide analysis of wide compatibility in rice and the preciselocation of the S 5 locus in the molecular map.1997，TAG，95：809-814)从20株T1代单株中分别抽提总DNA作为模板，用(1)中引物进行PCR扩增。反应体系为20μL，具体包含：DNA模板1μL；10倍体积的Taq酶反应缓冲液2μl；2mM dNTP 1.5μL；25mM镁离子1.2μL；10μM引物0.2μL；0.3单位Taq酶，加双蒸水至20μL。反应参数设置如下：94℃5min；
94℃45sec，53℃45sec，72℃1.5min，28cycles；72℃5min，25℃1min。(3)将反应产物跑琼脂糖凝胶电泳，根据凝胶上的带型判定各个单株的基因型。实验结果显示，20株T1代单株中，4株突变体表型植株的基因型均为BC1L4纯合T-DNA插入，而其他13株表型正常的植株基因型为野生或杂合型(如图3B)。这表明bc1l4突变体的突变表型是由于BC1L4基因内的T-DNA插入造成，且该突变体为隐性突变体。

[0060] 实施例2：BC1L4基因控制水稻纤维素的合成

[0061] 由于COBRA家族的多个成员参与植物纤维素的合成，且一些纤维素合成酶的突变体也具有同bc1l4相似的表型(Tanaka等，Three distinct rice cellulose synthase catalytic subunit genes required for cellulosesynthesis in the secondary wall.2003，Plant Physiol，133：73-83)。为了确定BC1L4基因是否参与水稻纤维素的合成，本发明测定了bc1l4突变体与野生型植株茎杆的纤维素含量。结果如图2A所示，bc1l4突变体的茎杆纤维素含量较野生型明显降低，减少程度约为24％。另外，为了确定bc1l4突变体纤维素的减少是否位于特定的细胞，申请人对突变体与对照的第二节间横切片进行了calcofluor染色。Calcofluor(fluorescentbrightener 28；Sigma)染色能使纤维素在紫外光照射下发出绿色荧光，而荧光的强弱直接反映了纤维素含量的多少。结果如图2B-E所示：突变体(图2C、E)与野生型(图2B、D)有明显的颜色差异，突变体的颜色相对于野生型染色要较浅，这一结果进一步说明bc1l4突变体的纤维素含量都减少了。所以可以得出BC1L4基因参与水稻茎杆纤维素的合成，而纤维素合成的障碍可能就是导致bc1l4突变体分蘖少、矮化、结实率下降等突变表型的原因。

[0062] 纤维素含量测定的实验具体步骤如下：(1)将突变体与对照的茎杆第二节取下，液氮磨成细粉，在50mMPH7.2的磷酸缓冲液中洗3次，70％的乙醇70℃提取1小时，重复两次，真空烘干。每份材料各取5个生物学重复。(2)样品中加入500μL乙酸-硝酸试剂，混匀，沸水煮30分钟。离心，弃上清，加1ml水重悬。离心，弃上清，加1ml丙酮。离心，弃上清，干燥，加800μL67％的硫酸室温溶解1.5小时，取10μL稀释至1ml。(3)再取40μL加160μL水，冰冻，加400μL蒽酮(0.02克蒽酮溶于10ml浓硫酸，现配现用，用前冰箱中冷却
2小时以上)，沸水浴16分钟，冰上放2-3分钟，室温放置5-10分钟，测定A620处的吸光度。
(4)将0.02克waterman paper纸溶于800μL 67％的硫酸，加水到200ml，分别取20μl、
40μl、60μl加水至200μl，其余步骤同(3)，做标准曲线。根据标准曲线，得出突变体与对照样品中的纤维素含量。纤维素染色步骤如下：用0.005％的calcofluor(fluorescent brightener 28；购自Sigma公司)将野生型与突变体的切片(10um厚)染色2分钟，在荧光显微镜(DM4000B，Leica，Germany)下观察、拍照。

[0063] 实施例3：转化BC1L4基因导致突变体纤维素含量升高，

[0064] 1.BC1L4基因互补载体的构建

[0065] 互补载体pCg001的构建方法如下：以pCAMBIA2301载体为骨架载体(购自CAMBIA公司，http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/overview.html)。用HindIII酶切“日本晴”(一个公开报道的水稻品种)BAC克隆OSJNBa0073E05，得到一系列将酶切片段，其中包括目的片段：含整个BC1L4基因编码区及ATG前约1.9kb和终止密码后约1.2kb，如图4A。将酶切片段与HindIII酶切的去磷酸化的的载体质粒pCAMBIA2301连接(所使用的内切酶、碱性磷酸酶均购自宝生物工程(大连)有限公司，连接酶购自Promega公司，具体用法与用量参考该产品的说明书)。连接产物通过电转化的方法(电转化仪为eppendoff公司产品，本发明所用电压为1800V，具体操作参考该仪器的使用说明书)导入大肠杆菌DH10B(购自Promega公司)中，加800ul LB复苏45分钟，取250ul涂于含卡那霉素、X-gal及IPTG的LA平板，37℃温箱培养14-16小时(LA与LB配方参考J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)。挑白色单克隆，扩大培养并抽提质粒，通过PCR筛选阳性克隆、酶切验证及测序验证后得到目的克隆。把构建好的载体电转化到农杆菌EHA105(购自CAMBIA公司)菌株中。

[0066] 2.遗传转化

[0067] 采用农杆菌介导的遗传转化方法(参照Hiei等，Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediatedby Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.1994，Plant J，6：271-282)将互补载体pCg001导入bc1l4突变体的愈伤，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有G418(购自北京原平皓生物技术有限公司)抗性的愈伤、分化、生根及炼苗移栽大田得到转基因植株(农杆菌介导的遗传转化试剂及配方见申请人已经公开的专利，专利名称为：水稻木质素合成基因FC1及应用，申请号：200610018105.5；公开号：CN1995346)。按照相同的遗传转化方法将空载体pCAMBIA2301导入bc1l4突变体的愈伤，得到的转基因植株作为阴性对照。

[0068] 本实施例研究结果显示，将互补载体pCg001导入bc1l4突变体的愈伤，共获得互补转化苗96株，其中39株阴性，为突变表型，57株为阳性，55株恢复正常生长；获得空载体转化子30株，均为突变表型，如图4B。以上结果表明分蘖少、矮化、结实率低的突变表型确实是由于BC1L4基因突变而造成。为了检测互补后代的遗传稳定性，本实施例随机选取14份T0代互补转基因植株，利用Southern杂交(具体操作参考：Wu等，Development of enhancer trap lines for functional analysis of the rice genome.2003，Plant J，
35：418-427)分析了这些互补转基因植株的拷贝数。结果显示，其中有5份互补转基因植株为单拷贝，这5份单拷贝互补转基因植株有3份获得了T1代种子。大田种植单拷贝家系的T1代，其中恢复正常生长的植株为转基因阳性植株，而未恢复正常表型的植株均为转基因阴性植株。这些研究结果进一步表明bc1l4突变体的突变表型确实是由于BC1L4基因的突变而造成的。

[0069] 实施例4：BC1L4基因与其它纤维素合成相关基因的关系及其实际应用[0070] 本发明利用本申请人所在作物遗传改良国家重点实验室CREP数据库(http://crep.ncpgr.cn/crep-cgi/home.p1)，分析了BC1L4基因与水稻基因组中所有其他基因的表达相关性。如表1所示，BC1L4基因与9个基因具有很高的表达相关性(相关系数＞0.88)，其中的5个基因(CESA1，CESA8，CEL1，CESA3，和CSLF6)或其同源物已经被显示参与纤维素的合成(Burton等，The CesA genefamily of barley.Quantitative analysis of transcripts reveals two groups of co-expressed genes.2004，PlantPhysiol，134：
224-236；Zhou 等，OsGLU1，a putative membrane-bound endo-1，4-beta-D-glucanase from rice，affects plant internode elongation.2006，Plant Mol Biol，60：
137-151；Burton 等，The Genetics andTranscriptional Profiles of the Cellulose Synthase-Like HvCslF Gene Family in Barley.2008，Plant Physiol，146：1821-1833)。
BC1L4基因与这些纤维素相关基因的共表达进一步说明BC1L4基因是水稻纤维素的合成中必需的基因。

[0071] 表1BC1L4基因和水稻中其它基因的表达相关性分析(相关系数＞0.88的基因被显示)

[0072]

[0073]

[0074] 为了调查其他纤维素合成基因的表达在bc1l4突变体中是否被影响了，申请人利用常用的定量RT-PCR方法检测了8个基因的表达水平，其中包括5个与BC1L4共表达的基因(CESA1，CESA8，CEL1，CESA3，CSLF6)和三个在水稻中已经克隆的纤维素合成酶基因(CESA4，CESA 7，CESA9)。如图5所示，CESA1和CESA9的表达在bc1l4突变体中表达水平比野生型显著升高了。尽管其他CESA基因、CEL1和CSLF6的表达水平在统计学上没有显著的变化，但它们的平均表达水平在bc1l4突变体中也比野生型都有所提高。在bc1l4突变体中纤维素合成相关基因表达水平的上升反应了纤维素合成过程中可能存在一种负反馈机制，即通过提高其它纤维素合成相关基因的表达来弥补bc1l4突变体中的纤维素损失。

[0075] 定量RT-PCR实验具体步骤参照Huang等的实验方法进行(Huang等，Down-regulation of a SILENTINFORMATION REGULATOR2-related histone deacetylase gene，OsSRT1，induces DNA fragmentation andcell death in rice，Plant Physiol(2007)：1508-1519)。具体步骤如下：(1)RNA材料准备：取野生型与bc1l4突变体植株抽穗期第二节间的样品，每种样品各取3个生物学重复。(2)RNA样品的抽提及反转录见参考文献(Huang等，Down-Regulation of a SILENT INFORMATION REGULATOR2-Related HistoneDeacetylase Gene，OsSRT1，Induces DNA Fragmentation and Cell Death in Rice，Plant Physiol(2007)：1508-1519)。(3) 定 量 RT-PCR在 ABI7500 定 量 PCR system(Applied Biosystems，美国)上进行，采用2-ΔCT相对定量的方法进行表达量的TM比较。25μL反应体系包含：1μL反转录产物，12.5μL PremixEX Taq (Takara)，
0.5μl Rox Reference Dye II(Takara)及0.2μM引物。反应参数设置如下：95℃/10sec；
95℃/5sec，60℃/40sec，40cycles。所有定量RT-PCR引物参见表2。

[0076] 表2本发明中使用的定量RT-PCR引物

[0077]

[0078]

[0079] 通过植物基因工程技术可以将BC1L4基因在水稻中特定组织部位或特定时期异位表达，通过调控BC1L4基因的时空表达模式及表达量达到调控水稻产量和纤维素含量的目的。另外，还可以利用BC1L4基因借助基因工程方法对植物纤维素的结构进行改造，培育纤维素结晶度低、易于降解新型能源型植物，从而提高植物秸杆的利用效率。

[0080] 本发明所涉及到的农杆菌介导的遗传转化试剂及配方如下：

[0081] (1)试剂和溶液缩写

[0082] 6-BA(6-BenzylaminoPurine，6- 苄 基 腺 嘌 呤 )；KT(Kinetin，激 动 素 )；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，
4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；
DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6min(N6小量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmin(MS小量成分溶液)

[0083] (2)主要溶液配方

[0084] 1)N6max母液[10倍浓缩液(10X)]

[0085] 硝酸钾(KNO3) 28.3g

[0086] 磷酸二氢钾(KH2PO4) 4.0g

[0087] 硫酸铵((NH4)2SO4) 4.63g

[0088] 硫酸镁(MgSO4·7H2O) 1.85g

[0089] 氯化钙(CaCl2·2H2O) 1.66g

[0090] 逐一溶解，然后室温下定容至1000ml。

[0091] 2)N6min母液[100倍浓缩液(100X)]

[0092] 碘化钾(KI) 0.08g

[0093] 硼酸(H3BO3) 0.16g

[0094] 硫酸锰(MnSO4·4H2O) 0.44g

[0095] 硫酸锌(ZnSO4·7H2O) 0.15g

[0096] 室温下溶解并定容至1000ml。

[0097] 3)Fe2EDTA贮存液(100X)

[0098] 在一个大三角瓶中加入300mi蒸馏水和硫酸铁(FeSO4·7H2O)2.78g[0099] 在另一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水并加热至70℃，然后加入乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)3.73g

[0100] 在它们都溶解后混合在一起，70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用。

[0101] 4)维生素贮存液(100X)

[0102] 烟酸(Nicotinic acid) 0.1g

[0103] 维生素B1(Thiamine HCl) 0.1g

[0104] 维生素B6(Pyridoxine HCl) 0.1g

[0105] 甘氨酸(Glycine) 0.2g

[0106] 肌醇(Inositol) 10g

[0107] 加水定容至1000ml，4℃保存备用。

[0108] 5)MSmax母液(10X)

[0109] 硝酸铵(NH4NO3) 16.5g

[0110] 硝酸钾 19.0g

[0111] 磷酸二氢钾 1.7g

[0112] 硫酸镁 3.7g

[0113] 氯化钙 4.4g

[0114] 室温下溶解并定容至1000ml。

[0115] 6)MSmin母液(100X)

[0116] 碘化钾 0.083g

[0117] 硼酸 0.62g

[0118] 硫酸锰(MnSO4·4H2O) 2.23g

[0119] 硫酸锌(ZnSO4·7H2O) 0.86g

[0120] 钼酸钠(Na2MoO4·2H2O) 0.025g

[0121] 硫酸铜(CuSO4·5H2O) 0.0025g

[0122] 氯化钴(CoCl2·6H2O) 0.0025g

[0123] 室温下溶解并定容至1000ml。

[0124] 7)2，4-D贮存液(1mg/ml)

[0125] 2，4-D 100mg.

[0126] 1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

[0127] 8)6-BA贮存液(1mg/ml)

[0128] 6-BA 100mg.

[0129] 1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

[0130] 9)NAA贮存液(1mg/ml)

[0131] NAA 100mg.

[0132] 1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

[0133] 10)IAA贮存液(1mg/ml)

[0134] IAA 100mg.

[0135] 1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

[0136] 11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)

[0137] 葡萄糖 125g

[0138] 蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。

[0139] 12)AS贮存液

[0140] AS 0.392g

[0141] DMSO 10ml

[0142] 分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。

[0143] 13)1N氢氧化钾贮存液

[0144] 氢氧化钾 5.6g

[0145] 蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。

[0146] 14)KT贮存液(1mg/ml)

[0147] KT 100mg.

[0148] 1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

[0149] (3)培养基配方

[0150] 1)诱导培养基

[0151] N6max母液(10X) 100ml

[0152] N6mix母液(100X) 10ml

[0153] Fe2+EDTA贮存液(100X) 10ml

[0154] 维生素贮存液(100X) 10ml

[0155] 2，4-D贮存液 2.5ml

[0156] 脯氨酸(Proline) 0.3g

[0157] CH 0.6g

[0158] 蔗糖(Sucrose) 30g

[0159] Phytagel 3g

[0160] 加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

[0161] 2)继代培养基

[0162] N6max母液(10X) 100ml

[0163] N6mix母液(100X) 10ml

[0164] Fe2+EDTA贮存液(100X) 10ml

[0165] 维生素贮存液(100X) 10ml

[0166] 2，4-D贮存液 2.0ml

[0167] 脯氨酸 0.5g

[0168] CH 0.6g

[0169] 蔗糖 30g

[0170] Phytagel 3g

[0171] 加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

[0172] 3)预培养基

[0173] N6max母液(10X) 12.5ml

[0174] N6mix母液(100X) 1.25ml

[0175] Fe2+EDTA贮存液(100X) 2.5ml

[0176] 维生素贮存液(100X) 2.5ml

[0177] 2，4-D贮存液 0.75ml

[0178] CH 0.15g

[0179] 蔗糖 5g

[0180] 琼脂粉(Agarose) 1.75g

[0181] 加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。

[0182] 使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

[0183] 4)共培养基

[0184] N6max母液(10X) 12.5ml

[0185] N6mix母液(100X) 1.25ml

[0186] Fe2+EDTA贮存液(100X) 2.5ml

[0187] 维生素贮存液(100X) 2.5ml

[0188] 2，4-D贮存液 0.75ml

[0189] CH 0.2g

[0190] 蔗糖 5g

[0191] 琼脂粉 1.75g

[0192] 加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。

[0193] 使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

[0194] 5)悬浮培养基

[0195] N6max母液(10X) 5ml

[0196] N6mix母液(100X) 0.5ml

[0197] Fe2+EDTA贮存液(100X) 0.5ml

[0198] 维生素贮存液(100X) 1ml

[0199] 2，4-D贮存液 0.2ml

[0200] CH 0.08g

[0201] 蔗糖 2g

[0202] 加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。

[0203] 使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。

[0204] 6)选择培养基

[0205] N6max母液(10X) 25ml

[0206] N6mix母液(100X) 2.5ml

[0207] Fe2+EDTA贮存液(100X) 2.5ml

[0208] 维生素贮存液(100X) 2.5ml

[0209] 2，4-D贮存液 0.625ml

[0210] CH 0.15g

[0211] 蔗糖 7.5g

[0212] 琼脂粉 1.75g

[0213] 加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。

[0214] 使用前溶解培养基，加入250μl 50mg/ml的G-418(Sulfate)和400ppm头孢霉素，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

[0215] 7)预分化培养基

[0216] N6max母液(10X) 25ml

[0217] N6mix母液(100X) 2.5ml

[0218] Fe2+EDTA贮存液(100X) 2.5ml

[0219] 维生素贮存液(100X) 2.5ml

[0220] 6-BA贮存液 0.5ml

[0221] KT贮存液 0.5ml

[0222] NAA贮存液 50μl

[0223] IAA贮存液 50μl

[0224] CH 0.15g

[0225] 蔗糖 7.5g

[0226] 琼脂粉 1.75g

[0227] 加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。

[0228] 使用前溶解培养基，加入250μl 50mg/ml的G-418(Sulfate)和400ppm头孢霉素，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

[0229] 8)分化培养基

[0230] N6max母液(10X) 100ml

[0231] N6mix母液(100X) 10ml

[0232] Fe2+EDTA贮存液(100X) 10ml

[0233] 维生素贮存液(100X) 10ml

[0234] 6-BA贮存液 2ml

[0235] KT贮存液 2ml

[0236] NAA贮存液 0.2ml

[0237] IAA贮存液 0.2ml

[0238] CH 1g

[0239] 蔗糖 30g

[0240] Phytagel 3g

[0241] 加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

[0242] 煮沸并定容至1000ml，分装到100ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。

[0243] 9)生根培养基

[0244] MSmax母液(10X) 50ml

[0245] MSmix母液(100X) 5ml

[0246] Fe2+EDTA贮存液(100X) 5ml

[0247] 维生素贮存液(100X) 5ml

[0248] 蔗糖 20g

[0249] Phytagel 3g

[0250] 加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

[0251] 煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。

[0252] 10)LA培养基(LB培养基不含琼脂粉)

[0253] 蛋白胨 2.5g

[0254] 酵母粉 1.25g

[0255] 氯化钠 2.5g

[0256] 琼脂粉 3.2g

[0257] 蒸馏水溶解定容至250ml，装于500ml三角瓶，灭菌后室温保存备用。

[0258] (4)农杆菌介导的遗传转化步骤

[0259] 愈伤诱导

[0260] (1)将成熟的水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl2)15分钟；

[0261] (2)灭菌水洗种子4-5次；

[0262] (3)将种子放在诱导培养基上；

[0263] (4)置于黑暗处培养5周，温度26±1℃。

[0264] 愈伤继代

[0265] 挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度26±1℃。

[0266] 预培养

[0267] 挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养4天，温度26±1℃。

[0268] 农杆菌培养

[0269] (1)在带有卡那霉素的LA培养基上预培养含构建好载体的农杆菌EHA105两天，温度28℃；

[0270] (2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

[0271] 农杆菌侵染

[0272] (1)将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；

[0273] (2)调节农杆菌的悬浮液至OD6000.8-1.0；

[0274] (3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

[0275] (4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养2天，温度19-20℃。

[0276] 愈伤洗涤和选择培养

[0277] (1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

[0278] (2)浸泡在含400ppm头孢霉素的灭菌水中30分钟；

[0279] (3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

[0280] (4)转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。(第一次头孢霉素筛选浓度为400ppm，第二次以后为250ppm)

[0281] 分化

[0282] (1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7天；

[0283] (2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃，5-7周。

[0284] 生根

[0285] (1)拔出分化好的苗子，剪掉分化时产生的根；

[0286] (2)然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

[0287] 移栽

[0288] 洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。在温室炼苗约2周左右后，再移载大田。

[0289] 序列表

[0290] <110>华中农业大学

[0291] <120>控制水稻纤维素合成的基因BC1L4作为水稻遗传改良的应用[0292] <130>

[0293] <141>2009-05-13

[0294] <160>1

[0295] <170>PatentIn version 3.1

[0296] <210>1

[0297] <211>2851

[0298] <212>DNA

[0299] <213>水稻(Oryza sativa)

[0300] <220>

[0301] <221>gene

[0302] <222>(1)..(2851)

[0303] <223>

[0304] <220>

[0305] <221>exon

[0306] <222>(2559)..(2848)

[0307] <223>

[0308] <220>

[0309] <221>exon

[0310] <222>(2158)..(2438)

[0311] <223>

[0312] <220>

[0313] <221>exon

[0314] <222>(1907)..(2066)

[0315] <223>

[0316] <220>

[0317] <221>exon

[0318] <222>(1053)..(1509)

[0319] <223>

[0320] <220>

[0321] <221>exon

[0322] <222>(689)..(768)

[0323] <223>

[0324] <220>

[0325] <221>exon

[0326] <222>(1)..(103)

[0327] <223>

[0328] <400>1

[0329] atg gcg gtg ggg gga gcc ggg agc tcc aga tcc gtg gcg ccg tgc tgc 48[0330] Met Ala Val Gly Gly Ala Gly Ser Ser Arg Ser Val Ala Pro Cys Cys[0331] 1 5 10 15[0332] tgc tgc gcc gtg ctg ctc gcg gcg gcg ctg ctc ttc tcc gcg ccg gcc 96[0333] Cys Cys Ala Val Leu Leu Ala Ala Ala Leu Leu Phe Ser Ala Pro Ala[0334] 20 25 30

[0335] acc aca g gtttccccgg ctctcgctcc ttctctctct ctctctctgt ttgcgcctgc 153[0336] Thr Thr

[0337] cagctcgtgc cgtgccggtc tcagatccat gcgccggccc gatcgccgag gctctcgact 213[0338] aactttcacg agttgtgacc acgagatttg ggcaatgcga tcccctcctg actgtgtcgg 273[0339] tggctccagt tcggtgtgtc ggtggctttt tttttttttt tgaattccga ttcgtttcat 333[0340] cagtaattca gttcgtttcg ctcctgcttt tgccagaatt cttggagcag attaggtagc 393[0341] agtaattcag ttcgtttcgc tcccgcttga ccggattctt ggatcaggtt aggtagctta 453[0342] gatccattga gaggagcacg catggagctt ccttcccaca ctaatcagtg cccaaggtga 513[0343] tagatctgat caggagaggc gaattcgaaa aaaaattccc ttccagatcg aaatcgggat 573[0344] cacgatataa ctaactcatg gggcttattc atctgccgaa ctgctaattt acccccattt 633[0345] cgtttccctt gttcaggatc ttgatatgca actctttttt gttttcctct tgcag ag 690[0346] Glu

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[0352] 55 60

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[0369] aag gat ccc aca gtt gtt gat ctg ctt ccg ggc acc cca tac aac atg 1271[0370] Lys Asp Pro Thr Val Val Asp Leu Leu Pro Gly Thr Pro Tyr Asn Met[0371] 120 125 130

[0372] caa atc gct aat tgc tgc aaa gct gga gtt ata aat aca ttt aac cag 1319[0373] Gln Ile Ala Asn Cys Cys Lys Ala Gly Val Ile Asn Thr Phe Asn Gln[0374] 135 140 145 150[0375] gac cca tca aat gct gct tct tcc ttc cag atc agt gta ggt ctt gct 1367[0376] Asp Pro Ser Asn Ala Ala Ser Ser Phe Gln Ile Ser Val Gly Leu Ala[0377] 155 160 165[0378] ggg act acc aac aag aca gtt aag ttg cct aag aac ttc act ctt aag 1415[0379] Gly Thr Thr Asn Lys Thr Val Lys Leu Pro Lys Asn Phe Thr Leu Lys[0380] 170 175 180[0381] gcc cca ggt cct ggg tac acg tgc ggg cgt gct atg att gtc agg cct 1463[0382] Ala Pro Gly Pro Gly Tyr Thr Cys Gly Arg Ala Met Ile Val Arg Pro[0383] 185 190 195

[0384] act aag ttt ttc acc ggg gat ggg cgc aga gca acc caa gct cta a 1509[0385] Thr Lys Phe Phe Thr Gly Asp Gly Arg Arg Ala Thr Gln Ala Leu[0386] 200 205 210

[0387] gtaagtagct catctgttgt tctttaatgt ttaataccaa ttgctttcat tctttgagga 1569[0388] aatgcatttg cagcctaaac aacaattgca tggttgaact aggttacctt atgtgtaggg 1629[0389] ttagtaagaa gatgtaatct gttgaaggga aagagattgt tctcaaagtg agatgagtcc 1689[0390] aactgtgaat aatagttgat aataggttat attacttggc atgttggcct aatagaatac 1749[0391] agctaattca gttaatatta ttctctagca aataatattc gtcaaatgca gacatgcatc 1809[0392] atagtggctc catatagaag ttaaatttgt caaaatctta taccataaag ttcatttttg 1869[0393] ttttttgttt cttaacaaaa ataaaatctg tttgcag tg aca tgg aat gtg acc 1923[0394] Met Thr Trp Asn Val Thr[0395] 215

[0396] tgc aca tac tcc caa ttt ctt gct cag aag act cct tcc tgc tgt gta 1971[0397] Cys Thr Tyr Ser Gln Phe Leu Ala Gln Lys Thr Pro Ser Cys Cys Val[0398] 220 225 230 235[0399] tct ctc tca tca ttt tat aat gac aca att gtg aac tgc cca aca tgc 2019[0400] Ser Leu Ser Ser Phe Tyr Asn Asp Thr Ile Val Asn Cys Pro Thr Cys[0401] 240 245 250[0402] tct tgt ggc tgc caa aac aat ggg aca agt cct gga agc tgt gta aa 2066[0403] Ser Cys Gly Cys Gln Asn Asn Gly Thr Ser Pro Gly Ser Cys Val Asn[0404] 255 260 265[0405] gtgagttaat aaaaccaaaa ctcttacttc gcttcttgtt gaggcccaac ttttctgcaa 2126[0406] aattgctaac aagttccatg catttccaca g t gag aat tca cct tat tta caa 2179[0407] Glu Asn Ser Pro Tyr Leu Gln[0408] 270

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[0421] ttc aat aat atc acc cag ctg ttt agc ttc aac tac aag cca ctt act 2419[0422] Phe Asn Asn Ile Thr Gln Leu Phe Ser Phe Asn Tyr Lys Pro Leu Thr[0423] 340 345 350

[0424] cca tat gga agc aag ata a gtaagtcaat ttacaaactg ttctccttta 2468[0425] Pro Tyr Gly Ser Lys Ile

[0426] 355 360

[0427] tttaagaaaa ttggagtgca cttgtaatac gttcctttat ctctctctct ctctctcttt 2528[0428] ctctgatgaa gtttattcct tctattttag at gat act gcg atg ttc tgg gga 2581[0429] Asn Asp Thr Ala Met Phe Trp Gly[0430] 365

[0431] gtt aag ttc tat aac gat ttg ctc atg caa gct ggt cca ctt gga aat 2629[0432] Val Lys Phe Tyr Asn Asp Leu Leu Met Gln Ala Gly Pro Leu Gly Asn[0433] 370 375 380

[0434] gca cag tca gaa ctt ctt ctg cgt aag gat tcc aag gac ttc acc ttt 2677[0435] Ala Gln Ser Glu Leu Leu Leu Arg Lys Asp Ser Lys Asp Phe Thr Phe[0436] 385 390 395 400[0437] gac aag gga tgg gcc ttc cca cac cgc gtg tac ttc aat ggt gat aat 2725[0438] Asp Lys Gly Trp Ala Phe Pro His Arg Val Tyr Phe Asn Gly Asp Asn[0439] 405 410 415[0440] tgt gtc atg cca cct ccg gat gca tat cca tgg ttg cct aat gca agt 2773[0441] Cys Val Met Pro Pro Pro Asp Ala Tyr Pro Trp Leu Pro Asn Ala Ser[0442] 420 425 430[0443] cct ctg aca aaa caa cca ttg aca ctc tcg gtt ttg gta ttt tcg att 2821[0444] Pro Leu Thr Lys Gln Pro Leu Thr Leu Ser Val Leu Val Phe Ser Ile[0445] 435 440 445

[0446] gtg ttg gct act ttg ctg gct tat gca tga 2851[0447] Val Leu Ala Thr Leu Leu Ala Tyr Ala

[0448] 450 455