抗人颗粒酶K的单克隆抗体K42-D2和分泌该抗体的杂交瘤细胞系

摘要

本发明提供了一种产生抗人颗粒酶K单克隆抗体的杂交瘤细胞及其分泌的单克隆抗体K42-D2，该单克隆抗体与重组人颗粒酶K及表达人天然颗粒酶K的细胞呈强阳性反应，而与其它不表达颗粒酶的细胞无交叉反应。本发明还提供了包含单克隆抗体K42-D2的试剂盒和使用单克隆抗体K42-D2检测颗粒酶K的含量的方法。

权利要求

1.一种抗人颗粒酶K的单克隆抗体K42-D2，其特征在于：所述单克隆抗体K42-D2由保藏编号为CGMCC No.2309的小鼠杂交瘤细胞株K42-D2产生。

2.产生权利要求1所述的单克隆抗体K42-D2的小鼠杂交瘤细胞株K42-D2，其保藏编号为CGMCC No.2309。

3.权利要求1所述的单克隆抗体K42-D2在制备免疫抑制剂中的应用。

4.用于检测颗粒酶K的含量的试剂盒，其包含权利要求1所述的单克隆抗体K42-D2。

5.根据权利要求4的试剂盒，其中所述颗粒酶K的含量可作为临床病人固有性免疫和适应性免疫水平的指徵。

6.根据权利要求4或5的试剂盒，其中所述试剂盒用于检测NK92细胞或PBMC的颗粒酶K的含量。

7.一种检测细胞的颗粒酶K的含量的方法，该方法包括：(1)将权利要求1所述的单克隆抗体K42-D2与待检测的分离的细胞或该细胞的裂解液进行接触；和(2)判断是否有阳性反应。

8.根据权利要求7的方法，其中所述阳性反应是通过免疫荧光检测进行判断的。

说明书

抗人颗粒酶K的单克隆抗体K42-D2和分泌该抗体的杂交瘤

细胞系

技术领域

[0001] 本发明涉及单克隆抗体领域，更具体地，本发明涉及抗人颗粒酶K的单克隆抗体K42-D2，它是由小鼠杂交瘤细胞系K42-D2产生的。

背景技术

[0002] 颗粒体调节的靶细胞杀伤是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤病毒感染细胞和肿瘤细胞的主要效应途径。在人当中存在5种颗粒酶，分别是颗粒酶A、B、K、H和M。尽管颗粒酶A和B诱导的细胞死亡途径已经基本阐明，然而其它孤儿颗粒酶(K、H和M)在CTL调节的靶细胞杀伤中的作用远未阐明。颗粒酶K和颗粒酶A均属类胰蛋白酶，它们位于同一染色体上。研究发现颗粒酶K介导了快速的靶细胞死亡。类似于颗粒酶A，磷脂酰丝氨酸外翻、染色体凝集、核形态变化及单链断裂为颗粒酶K介导靶细胞死亡的主要特征。颗粒酶K介导的靶细胞死亡不依赖于caspase的激活。Caspase抑制剂Z-VAD及Bcl-xL的过量表达均不能阻断颗粒酶K介导的靶细胞死亡。此外，颗粒酶K亦不能够激活细胞裂解液及细胞内的Caspase3。颗粒酶K水解重组、细胞裂解液以及细胞内的SET。SET既是核小体装配蛋白，又是DNA酶NM23H1的抑制剂。颗粒酶K切割SET破坏了小体装配功能及对NM23H1的抑制作用。颗粒酶K进入靶细胞以后，DNA酶NM23H1及其抑制剂SET共同进入细胞核。DNA酶NM23H1的激活导致了染色体DNA的单链断裂。此外，颗粒酶K能够切割SET复合物中颗粒酶A的另外两个底物DNA结合蛋白HMG2及DNA氧化还原修复酶ApeI，表明颗粒酶K部分的提供了颗粒酶A的功能备份。

[0003] 线粒体途径在细胞凋亡过程中发挥重要作用。在凋亡进程中，一些凋亡前体蛋白如Cyto c、EndoG、SMAC、HtrA2和AIF等释放到细胞质中去。研究发现颗粒酶K能够诱导靶细胞线粒体肿胀、膨大及脊消失等形态特征的变化。通过线粒体氧化还原电势特异性染料DiOC6(3)染色，我们发现颗粒酶K能够诱导靶细胞氧化还原电势降低，从而使线粒体发生去极化。氧自由基特异性染料HE染色证明颗粒酶K诱导了细胞内ROS的升高。抗氧化剂NAC及氧自由基清除剂Tiron能够抑制颗粒酶K引起的ROS的升高，从而拮抗颗粒酶K引起的靶细胞死亡。颗粒酶K既能够切割体外重组的Bid又能破坏细胞裂解液及细胞内的Bid，从而引起线粒体Cyto c和EndoG释放。颗粒酶K通过作用于线粒体途径，加速了靶细胞死亡进程。

[0004] 颗粒酶K单抗的潜在用途包括：1.用于检测组织和细胞或其裂解液中颗粒酶K的含量，可作为临床病人固有性免疫和适应性免疫水平的指徵；

[0005] 2.阻断颗粒酶K引起的细胞凋亡，临床上可作为免疫抑制剂用于器官移植和自身免疫病的治疗。

[0006] 发明内容

[0007] 本发明的目的是提供一种抗人颗粒酶K的单克隆抗体K42-D2。

[0008] 本发明提供了一种抗人颗粒酶K的单克隆抗体K42-D2，其特征在于，它是由小鼠杂交瘤细胞系K42-D2产生的。以重组人颗粒酶K免疫Balb/C小鼠，应用淋巴细胞杂交瘤技术制备的一株能稳定分泌特异性抗人颗粒酶K单克隆抗体的细胞株K42-D2。K42-D2单抗与重组人颗粒酶K及表达人天然颗粒酶K的细胞呈强阳性反应，而与其它不表达颗粒酶的细胞无交叉反应。

[0009] 更具体地，本发明提供以下各项：

[0010] 1)一种抗人颗粒酶K的单克隆抗体K42-D2，它由小鼠杂交瘤细胞系K42-D2(CGMCC No.2309)产生。

[0011] 2)一种产生抗人颗粒酶K单克隆抗体K42-D2的杂交瘤细胞，其特征在于，它是保藏号为CGMCC No.2309的小鼠杂交瘤细胞系K42-D2。

[0012] 3)以上1)所述的单克隆抗体K42-D2在制备免疫抑制剂中的应用。所述免疫抑制剂可以含有其它辅剂或佐剂，其制备是本领域技术人员所公知的技术。

[0013] 4)用于检测颗粒酶K的含量的试剂盒，其包含以上1)所述的单克 隆抗体K42-D2。试剂盒的制备可以通过本领域技术人员所公知的方法来进行。

[0014] 5)根据以上4)的试剂盒，其中所述颗粒酶K的含量可作为临床病人固有性免疫和适应性免疫水平的指徵。

[0015] 6)根据以上4或5的试剂盒，其中所述试剂盒用于检测NK92细胞或PBMC的颗粒酶K的含量。

[0016] 7)一种检测细胞的颗粒酶K的含量的方法，该方法包括：(1)将以上1)所述的单克隆抗体K42-D2与待检测的分离的细胞或该细胞的裂解液进行接触；和(2)判断是否有阳性反应。在一个实施方案中，所述分离的细胞是从人体分离的。细胞裂解液的制备可以通过本领域技术人员所公知的方法来进行。

[0017] 8)根据以上7)的方法，其中所述阳性反应是通过免疫荧光检测进行判断的。免疫荧光检测可以通过本领域技术人员所公知的方法来进行。

附图说明

[0018] 图1表示K42-D2单抗，按常规方法对重组人颗粒酶K(泳道1)、NK92细胞裂解液(泳道2)、PBMC裂解液(泳道3)、K562细胞裂解液(泳道4)进行western blot。 具体实施方式

[0019] 颗粒酶K在激活的CTL和NK细胞中高度表达，尤其是在CD8+和CD56brightNK细胞中，此外在CD56+T细胞、CD4+T细胞、TCRγδ+T细胞亚类中亦有表达(Detection of soluble human granzyme K in vitro and invivo.Eur J Immunol.2005 Oct；35(10)：2940-8.Bade B，Lohrmann J，tenBrinke A，Wolbink AM，Wolbink GJ，ten Berge IJ，Virchow JC Jr，Luttmann W，Hack CE.)；Differential expression of human granzymes A，B，and K in naturalkiller cells and during CD8+T cell differentiation in peripheral blood.Eur JImmunol.2005 Sep；35(9)：2608-16.Bratke K，Kuepper M，Bade B，VirchowJC Jr，Luttmann W.)。在鼠CTL和LAK细胞中颗粒酶K的表达量远远低于颗粒酶A，而有研究认为在大鼠NK(RNK-16)细胞中颗粒酶K表达量大于颗粒酶A。最近有研究表明颗粒酶A基因敲除的小鼠(GzmA-/-)中，颗粒酶K表达未见异常，小鼠能够正常成长发育，其淋巴细胞亦能够正常发育、激活和增值，能够杀伤病毒感染和癌变细胞，但对某些病毒感染如小鼠痘病毒和单纯疱疹病毒缺少抵抗能力(Residual cytotoxicity andgranzyme K expression in granzyme A-deficient cytotoxic lymphocytes.J BiolChem.1997 Aug 8；272(32)：
20236-44.Shresta S，Goda P，Wesselschmidt R，Ley TJ.)。颗粒酶A介导了一条新的不依赖于Caspase的靶细胞凋亡的通路，作为处在同一染色体相同基因簇的颗粒酶K是否发挥同A相类似的作用呢？目前为止，对于人颗粒酶K深入的杀伤作用尚未阐明。我们采用原核及真核表达并纯化颗粒酶K，研究了颗粒酶K的杀伤效应。结果发现颗粒酶K既具有相同于颗粒酶A的作用机制，如颗粒酶K介导了不依赖于Caspase的靶细胞死亡，通过作用于SET复合物(切割SET、HMG2及Apel)引起靶细胞DNA单链断裂及诱导线粒体ROS产生、氧化还原电势降低等；又具有不同于颗粒酶A的作用机制。如切割Bid，诱导线粒体Cytoc及EndoG的释放等类似于颗粒酶B的作用特点。

[0020] 本发明包括：一种特异性的抗人颗粒酶K单克隆抗体K42-D2，它是由小鼠杂交瘤细胞系K42-D2产生的。以重组人颗粒酶K免疫Balb/C小鼠，应用淋巴细胞杂交瘤技术制备的一株能稳定分泌特异性抗人颗粒酶K单克隆抗体的细胞株K42-D2。

[0021] 本发明中的一种阳性杂交瘤细胞为抗人颗粒酶K单克隆抗体杂交瘤细胞株K42-D2，该杂交瘤细胞株于2007年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保藏号为CGMCC No.2309。

[0022] 本发明中的抗人颗粒酶K单克隆抗体K42-D2的实验表明，K42-D2单抗与重组人颗粒酶K及表达人天然颗粒酶K的细胞呈强阳性反应，而与其它不表达颗粒酶的细胞无交叉反应。

[0023] 本发明中的抗人颗粒酶K单克隆抗体K42-D2具有以下的特点和性能：(1)与重组人颗粒酶K呈强阳性反应；(2)与人NK肿瘤细胞系NK92呈强阳性反应；(3)与人外周血单核细胞PBMC呈强阳性反应；(4)与人白血病细胞K562呈阴性反应。

[0024] 实施例1

[0025] K42-D2单抗的制备和纯化

[0026] (1)杂交瘤的制备

[0027] 以重组人颗粒酶K(制备参见Zhao，T.，Zhang，H.，Guo，Y.，Zhang，Q.，Hua，G.，Lu，H.，Hou，Q.，Liu，H.，Fan，Z.，2007b.GzmK cleaves thenucleosome assembly protein SET to induce single-stranded DNA nicks oftarget cells.Cell Death Differ.14，489-499)免疫Balb/C小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，腹腔注射，每只小鼠每次50微克重组人颗粒酶K。2周后对小鼠进行再次免疫，注射量和方法不变。待小鼠血清效价达到要求，即效价达到1∶200以上，之后准备进行细胞融合，融合前三天对小鼠进行冲击免疫。

[0028] 在免疫小鼠的同时准备小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0(ATCC CRL-1772)。

[0029] 将致敏的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合(《实用免疫学》，杨廷彬主编，长春出版社，1994年12月出版)，用HAT培养基(购于Invitrogen公司，HAT系次黄嘌呤(hypoxantin)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidin)三种物质各英文首字之缀列，HAT培养基也就是指含有这三种物质的细胞培养基)进行选择性培养(以小鼠腹腔巨噬细胞为饲养细胞)。

[0030] 接着，用ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清：以重组人颗粒酶K包被96孔板，4℃过夜。用含0.05％tween-20的磷酸盐缓冲液洗涤3次，加待检上清100μl，37℃孵育
1h。用含0.05％tween-20的磷酸盐缓冲液洗涤3次，加酶标二抗(抗小鼠IgG-HRP)(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)，37℃孵育1h。洗涤3次，加底物显色剂四甲基联苯胺(TMB)(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)50μl，室温静置5分钟，加终止液(2mol/L的硫酸)50μl。结果用BIORAD 680型酶标仪测定，检测波长为450nm值，OD值高于阴性对照2倍以上者可视为阳性。

[0031] 然后，将选出的阳性杂交瘤细胞克隆化培养(有限稀释法，以小鼠腹腔巨噬细胞为饲养细胞)。经过2-3轮克隆化培养，获得稳定的能够产生高效价单抗的杂交瘤细胞克隆。将杂交瘤细胞克隆扩大培养，并冻存保 种。

[0032] 本发明中的一种阳性杂交瘤细胞为抗人颗粒酶K杂交瘤细胞系K42-D2，该杂交瘤细胞系于2007年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保藏号为CGMCC No.2309。

[0033] (2)K42-D2单抗的制备和纯化

[0034] 将上述杂交瘤细胞K42-D2接种至Balb/C小鼠腹腔，制备腹水，再从腹水中提取单抗。单抗K42-D2的纯化：采用Protein G亲和层析法。首先制备Protein G亲和层析柱(购于“GE”公司)，用PBS(磷酸盐缓冲液)平衡柱子后，取含K42-D2单抗的腹水过柱，然后用PBS洗柱子，至OD值接近于零，以0.2M的甘氨酸-HCl溶液(pH2.8)洗脱，收集洗脱液，测定各收集管的OD值，保留峰值区的洗脱液，洗脱液经透析浓缩后-20℃冻存。 [0035] 实施例2

[0036] K42-D2单抗的鉴定

[0037] 在实施例1中制备的K42-D2单抗，按常规方法对重组人颗粒酶K、人NK肿瘤细胞系NK92细胞裂解液、人外周血单核细胞PBMC裂解液、人白血病细胞K562细胞裂解液进行western blotting，结果如图1所示。结果表明，K42-D2单抗与重组人颗粒酶K及表达人天然颗粒酶K的细胞(NK92和PBMC)呈强阳性反应，而与其它不表达颗粒酶的细胞(K562)无交叉反应。

[0038] 在实施例1中制备的K42-D2单抗，按常规方法对NK92细胞(ATCC：CRL-2407)、PBMC(制备参考《实用免疫学》，杨廷彬主编，长春出版社，1994年12月出版)、和K562细胞(ATCC：CCL-243)进行免疫荧光反应。结果表明，K42-D2单抗与表达人天然颗粒酶K的细胞(NK92和PBMC)呈强阳性反应，而与其它不表达颗粒酶的细胞(K562)无交叉反应。 [0039] 用K42-D2单抗按常规方法对NK92、PBMC和K562细胞进行免疫荧光检测。结果如表1所示。

[0040] 表1K42-D2单抗与人细胞系的反应性

[0041]细胞系 K42-D2单抗
NK92 +++
PBMC +
K562 -

[0042] “-”表示无反应，“+”表示有反应。

[0043] 尽管本发明的具体实施例已经描述如上，但是可以知道本发明可以进行除了上述说明以外的实践。本发明的保护范围不受说明书的限制。