诱导DNA缩合的钌多吡啶配合物及其制备方法和应用转让专利
申请号 : CN200910039334.9
文献号 : CN101555253B
文献日 : 2011-05-04
发明人 : 巢晖 , 徐丽 , 陈相 , 廖国亮 , 刘朋昕 , 计亮年
申请人 : 中山大学
摘要 :
本发明提供了诱导DNA缩合的钌多吡啶配合物及其制备方法与应用，所述配合物是由钌与辅助配体和主配体配合而成，所述辅助配体为2，2-联吡啶，所述主配体为1，2-二(咪唑并[4，5-f][1，10-邻菲咯啉])苯或1，2-二(咪唑并[4，5-f][1，10-邻菲咯啉])萘；所述配合物中的阴离子部分为高氯酸根离子；所述制备方法是将钌和辅助配体的配合物二(2，2′-联吡啶)-二氯-二水合钌(II)和主配体化合物溶解于乙二醇，加热反应，冷却后加水稀释，再NaClO4饱和溶液即产生沉淀，过滤后沉淀依次用水、乙醚洗涤后干燥，即得。本发明还提供所述配合物在基因药物载体制备中的应用。本发明的钌多吡啶配合物具有高稳定性、低毒性、光物理性质丰富、容易吸收并在体内很快排泄等特点，应用前景广阔。
权利要求 :
1.诱导DNA缩合的钌多吡啶配合物，其特征在于由钌与辅助配体和主配体配合而成，所述辅助配体为2，2-联吡啶，所述主配体为1，2-二(咪唑并[4，5-f][1，10-邻菲咯啉])苯或2，3-二(咪唑并[4，5-f][1，10-邻菲咯啉])萘；
所述配合物中的阴离子部分为高氯酸根离子；
所述钌与辅助配体2，2-联吡啶和主配体1，2-二(咪唑并[4，5-f][1，10-邻菲咯啉])苯的配合物的阳离子部分的化学结构如式I所示：所述钌与辅助配体2，2-联吡啶和主配体2，3-二(咪唑并[4，5-f][1，10-邻菲咯啉])萘的配合物的阳离子部分的化学结构如式II所示：
2.权利要求1所述配合物的制备方法，其特征在于步骤如下：
将钌和辅助配体的配合物二(2，2′-联吡啶)-二氯-二水合钌(II)和主配体化合物溶解于乙二醇，加热反应，冷却后加水稀释，再加入NaClO4饱和溶液即产生沉淀，过滤后沉淀依次用水、乙醚洗涤后干燥，即得。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于干燥后的粗产品采用氧化铝柱色谱分离提纯。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述加热反应的温度为120～160℃，同时用氩气保护；反应时间为8～12小时。
5.权利要求1所述配合物在基因药物载体制备中的应用。
说明书 :
诱导DNA缩合的钌多吡啶配合物及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及诱导DNA缩合的钌多吡啶配合物及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] DNA分子从伸展态到紧缩态的构象转变称为DNA缩合。在病毒和真核细胞的细胞核内，高度缩合且高度有序排列的DNA结构保持了基因组的稳定性，使复制得以顺利完成。细胞中聚胺(polyamine)通过静电相互作用与DNA结合，促使了这种紧密堆积状态的形成。
DNA缩合不仅是自然界常见的生理现象，也是介导基因转染的关键步骤。病毒基因载体虽然是较有效的DNA传递工具，传递效率一般在90％以上，约有75％的基因治疗应用了病毒载体介导系统，但该系统存在局限性：即病毒性和免疫原性限制其广泛应用，其次，该系统的DNA装载量有限，载体组装难度大，花费高。和病毒载体相比，非病毒载体具有安全、有效、无免疫原性等优点。从上世纪60年代中期开始，由多价阳离子和聚阳离子诱发的DNA体外缩合就受到了广泛的关注。据报道，聚胺、阳离子脂质体、带正电的多肽、蛋白质、阳离子表面活性剂以及无机阳离子都可以引起DNA缩合。迄今为止，多数化合物主要是通过所带正电荷与DNA骨架上的负电荷之间的静电作用导致DNA缩合。近来研究发现，通过链接一些具有刚性平面结构的有机基团到载体，利用基团与DNA双螺旋结构的嵌插作用，可以有效地促进载体诱导DNA缩合的形成效率。但是已知的非病毒载体如聚胺、阳离子脂质体和阳离子表面活性剂具有不易被吸收及难排泄等缺点。
DNA缩合不仅是自然界常见的生理现象，也是介导基因转染的关键步骤。病毒基因载体虽然是较有效的DNA传递工具，传递效率一般在90％以上，约有75％的基因治疗应用了病毒载体介导系统，但该系统存在局限性：即病毒性和免疫原性限制其广泛应用，其次，该系统的DNA装载量有限，载体组装难度大，花费高。和病毒载体相比，非病毒载体具有安全、有效、无免疫原性等优点。从上世纪60年代中期开始，由多价阳离子和聚阳离子诱发的DNA体外缩合就受到了广泛的关注。据报道，聚胺、阳离子脂质体、带正电的多肽、蛋白质、阳离子表面活性剂以及无机阳离子都可以引起DNA缩合。迄今为止，多数化合物主要是通过所带正电荷与DNA骨架上的负电荷之间的静电作用导致DNA缩合。近来研究发现，通过链接一些具有刚性平面结构的有机基团到载体，利用基团与DNA双螺旋结构的嵌插作用，可以有效地促进载体诱导DNA缩合的形成效率。但是已知的非病毒载体如聚胺、阳离子脂质体和阳离子表面活性剂具有不易被吸收及难排泄等缺点。
发明内容
[0003] 本发明的目的是针对已有技术的不足，提供了高稳定性、低毒性、光物理性质丰富、容易吸收并在体内能很快排泄的钌多吡啶配合物。
[0004] 本发明的另一目的是提供上述配合物的制备方法。
[0005] 本发明还有一个目的是提供上述配合物的应用。
[0006] 诱导DNA缩合的钌多吡啶配合物，是由钌与辅助配体和主配体配合而成，所述辅助配体为2，2-联吡啶(用英文表示为bpy)，所述主配体为1，2-二(咪唑并[4，5-f][1，10-邻菲咯啉])苯(用英文表示为obpibH2)或1，2-二(咪唑并[4，5-f][1，10-邻菲咯啉])萘(用英文表示为obnibH2)。
[0007] 本发明钌与bpy和obpibH2的配合物的阳离子部分的化学结构如式I所示：
[0008]
[0009] 本发明钌与bpy和obnibH2的配合物的阳离子部分的化学结构如式II所示：
[0010]
[0011] 本发明的配合物的阴离子部分优选为高氯酸根离子，也可以是不影响本发明配合物化学性质的其他阴离子。
[0012] 本发明的钌多吡啶配合物是含咪唑和1，10-邻菲咯啉基团的多吡啶类衍生物配体的双核钌多吡啶配合物，和单核金属配合物相比，双核金属配合物具有更大的电荷数，构型和大小也更具可变性，可以进一步增强配合物对DNA的亲和力和诱导DNA缩合。
[0013] 本发明还提供所述钌多吡啶配合物的制备方法，步骤如下：
[0014] 将钌和辅助配体的配合物二(2，2′-联吡啶)-二氯-二水合钌(II)和主配体化合物溶解于乙二醇，加热反应，冷却后加水稀释，再NaClO4饱和溶液即产生沉淀，过滤后沉淀依次用水、乙醚洗涤后干燥，即得。
[0015] 干燥后的粗产品可经氧化铝柱色谱分离提纯。
[0016] 所述加热反应的优选温度为120～160℃，同时用氩气保护更有利于配合物的制备，反应时间8～12小时反应进行较为充分。
[0017] 本发明的钌配合物能应用于新型基因药物载体的设计或制备领域中。
[0018] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0019] 本发明的钌多吡啶配合物具有高稳定性、低毒性、光物理性质丰富、容易吸收并在体内很快排泄等特点，本发明提供的双核钌多吡啶配合物，通过静电结合和嵌插结合共同作用导致DNA缩合，并且在较强的盐离子浓度(如人体生理盐浓度：150mM NaCl)下依然能诱导DNA缩合，该类化合物目前在国内外还未见相关文献报道，为设计、制备非病毒基因载3+
体提供了一种新的方法和途径。与现有技术中典型的无机阳离子[Co(NH3)6] 相比，本发明
3+
的化合物诱导DNA缩合的能力大大增强([Co(NH3)6] 诱导DNA缩合的浓度大约为1mM，本发明的化合物诱导DNA缩合的浓度大约为10μM)。
体提供了一种新的方法和途径。与现有技术中典型的无机阳离子[Co(NH3)6] 相比，本发明
3+
的化合物诱导DNA缩合的能力大大增强([Co(NH3)6] 诱导DNA缩合的浓度大约为1mM，本发明的化合物诱导DNA缩合的浓度大约为10μM)。
[0020] 本发明的钌多吡啶配合物，合成简单，结构稳定，具有良好的光电性质和强的DNA的亲和力，可以诱导DNA缩合成纳米粒子。本申请书中的化合物属于首例能诱导DNA缩合的双核钌多吡啶配合物。与以往的经典的阳离子缩合剂相比，该新型DNA缩合试剂具有更强的缩合能力，及生理盐浓度下(150mM NaCl)该新型DNA缩合试剂缩合能力不受盐离子浓度效应影响。
附图说明
[0021] 图1为配合物[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2]4+诱导pBR322DNA缩合的凝胶电泳实验图；
[0022] 图2为配合物[(bpy)2Ru(obnibH2)Ru(bpy)2]4+诱导pBR322DNA缩合的凝胶电泳实验图。
具体实施方式
[0023] 以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。
[0024] 实施例1
[0025] 1.配体1，2-二(咪唑并[4，5-f][1，10-邻菲咯啉])苯(obpibH2)的制备：
[0026] 将0.34g，2.0mM计量摩尔比的1，2-邻苯二甲酸(o-phthalic acid)和0.86g，4.1mM的1，10-菲咯啉-5，6-二胺(1，10-phenanthroline-5，6-diamine)混合溶解于多聚磷酸，在氩气保护条件下和200℃加热回流6小时。冷却到室温，用水稀释并加25％氨水中和，得深绿色沉淀，收集沉淀，真空干燥，产率62％。元素分析C32H18N8，实验值：C，74.54；H，
3.27；N，22.24％；理论值：C，74.70；H，3.53；N，21.78。FAB-MS：m/z＝516(M+1).[0027] 2.配体1，2-二(咪唑并[4，5-f][1，10-邻菲咯啉])萘(obnibH2)的制备：
3.27；N，22.24％；理论值：C，74.70；H，3.53；N，21.78。FAB-MS：m/z＝516(M+1).[0027] 2.配体1，2-二(咪唑并[4，5-f][1，10-邻菲咯啉])萘(obnibH2)的制备：
[0028] 方法如1，用0.43g，2.0mM的1，2-邻萘二甲酸与0.86g，4.1mM的1，10-菲咯啉-5，6-二胺反应，得绿色固体，产率52％。元素分析C36H20N8，实验值：C，76.82；H，3.27；N，19.62％。理论值：C，76.58；H，3.57；N，19.85。FAB-MS：m/z＝566(M+1).
[0029] 3.诱导DNA缩合的钌多吡啶配合物的制备：
[0030] (1)[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2](ClO4)2的制备
[0031] 钌和辅助配体的配合物二(2，2′-联吡啶)-二氯-二水合钌(II)(0.31g，0.58mM)和主配体obpibH2(0.15g，0.29mM)溶解于乙二醇，加热至120℃氩气保护下反应12小时后，得到暗红色清夜，冷却至室温，加水稀释后，加入NaClO4饱和溶液即产生大量红色沉淀，抽滤，用水，乙醚洗涤数次后干燥。将干燥后的粗产品经氧化铝柱色谱分离提纯，产率及元素分析如下：
[0032] [(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2](ClO4)2：产率70％。
[0033] 元素分析C72H50N16Cl4O16Ru2，实验值：C，50.05；H，3.0；N，12.60％，计算值C，49.72；1
H，2.90；N，12.89，H NMR(DMSO-d6)：9.18(s，2H)，9.02(d，4H)，8.87(d，4H)，8.83(d，4H)，
8.20(t，4H)，8.08(t，4H)，7.98(d，4H)，7.85(d，4H)，7.81(t，4H)，7.61(d，4H)，7.60(t，4H)，
2+ 3+
7.52(t，2H)，7.38(t，4H)，ES-MS[CH3CN，m/z]：771.5([M-2ClO4] )，480.7([M-3ClO4] )，
2+ 3+ 4+
720.5([M-3ClO4-H] )，447.7([M-4ClO4-H] )，335.8([M-4ClO4] )。
H，2.90；N，12.89，H NMR(DMSO-d6)：9.18(s，2H)，9.02(d，4H)，8.87(d，4H)，8.83(d，4H)，
8.20(t，4H)，8.08(t，4H)，7.98(d，4H)，7.85(d，4H)，7.81(t，4H)，7.61(d，4H)，7.60(t，4H)，
2+ 3+
7.52(t，2H)，7.38(t，4H)，ES-MS[CH3CN，m/z]：771.5([M-2ClO4] )，480.7([M-3ClO4] )，
2+ 3+ 4+
720.5([M-3ClO4-H] )，447.7([M-4ClO4-H] )，335.8([M-4ClO4] )。
[0034] (2)[(bpy)2Ru(obnibH2)Ru(bpy)2](ClO4)2的制备
[0035] 钌和辅助配体的配合物二(2，2′-联吡啶)-二氯-二水合钌(II)(0.31g，0.58mM)和主配体obnibH2(0.16g，0.29mM)溶解于乙二醇，加热至120℃氩气保护下反应12小时后，得到暗红色清夜。冷却至室温，加水稀释后，加入NaClO4饱和溶液即产生大量红色沉淀。抽滤，用水，乙醚洗涤数次后干燥。将干燥后的粗产品经氧化铝柱色谱分离提纯，产率及元素分析如下：
[0036] [(bpy)2Ru(obnibH2)Ru(bpy)2](ClO4)2：产率68％。
[0037] 元素分析C76H52N16Cl4O16Ru2，实验值：C，51.25；H，3.0；N，12.20％，计算值：C，1
51.02；H，2.93；N，12.53，H NMR(DMSO-d6)：9.18(s，2H)，9.02(d，4H)，8.87(d，4H)，8.83(d，
4H)，8.20(d，4H)，8.08(t，4H)，7.98(d，4H)，7.91(t，2H)，7.85(d，4H)，7.83(d，4H)，7.61(d，
2+
4H)，7.60(t，4H)，7.52(t，2H)，7.38(t，4H)，ES-MS[CH3CN，m/z]：795.2([M-2ClO4] )，
3+ 2+ 4+
497.0([M-3ClO4] )，744.9([M-3ClO4-H] )，463.5[M-4ClO4-H]3+)，347.9([M-4ClO4] )。
51.02；H，2.93；N，12.53，H NMR(DMSO-d6)：9.18(s，2H)，9.02(d，4H)，8.87(d，4H)，8.83(d，
4H)，8.20(d，4H)，8.08(t，4H)，7.98(d，4H)，7.91(t，2H)，7.85(d，4H)，7.83(d，4H)，7.61(d，
2+
4H)，7.60(t，4H)，7.52(t，2H)，7.38(t，4H)，ES-MS[CH3CN，m/z]：795.2([M-2ClO4] )，
3+ 2+ 4+
497.0([M-3ClO4] )，744.9([M-3ClO4-H] )，463.5[M-4ClO4-H]3+)，347.9([M-4ClO4] )。
[0038] 实施例2钌多吡啶配合物诱导DNA缩合的表征：
[0039] (1)琼脂糖凝胶电泳实验：
[0040] 向含有相同量的pBR322DNA(5ng/μL)的溶液中加入不同量的钌多吡啶配合物的溶液(0，9，13，18，27，36，45，54or 63ng/μL)，混合均匀，加入缓冲液(50mM Tris，18mM NaCl buffer，pH 7.2)使反应液的最终体积保持在10μL。将反应混合物静置于黑暗的环境中30分钟，然后加入2μL溴酚蓝缓冲终止液。上样至1％琼脂糖凝胶板。在TBE中以90V电泳1.5小时。以1μL/mL的EB染色液染色30分钟，用Alpha Innotech IS-5500化学荧光成像分析系统记录电泳图片，见图1、图2。
[0041] 图1和图2分别为配合物[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2]4+诱导pBR322DNA缩合的4+
凝胶电泳实验图和[(bpy)2Ru(obnibH2)Ru(bpy)2] 诱导pBR322DNA缩合的凝胶电泳实验图。图1和图2中附图标记均表示为：0泳道：DNA空白，1-8泳道：DNA+Ru配合物。每个泳道DNA的浓度是5ng/μL，从第1泳道到第8泳道配合物的浓度依次分别为：9，13，18，27，36，
45，54and 63ng/μL。从电泳图片中得出[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2](ClO4)2诱导DNA缩合的浓度为36ng/μL，[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2](ClO4)2诱导DNA缩合的浓度为27ng/μL。
凝胶电泳实验图和[(bpy)2Ru(obnibH2)Ru(bpy)2] 诱导pBR322DNA缩合的凝胶电泳实验图。图1和图2中附图标记均表示为：0泳道：DNA空白，1-8泳道：DNA+Ru配合物。每个泳道DNA的浓度是5ng/μL，从第1泳道到第8泳道配合物的浓度依次分别为：9，13，18，27，36，
45，54and 63ng/μL。从电泳图片中得出[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2](ClO4)2诱导DNA缩合的浓度为36ng/μL，[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2](ClO4)2诱导DNA缩合的浓度为27ng/μL。
[0042] (2)原子力显微镜(AFM)实验：
[0043] ①云母片(1cm×1cm)新鲜解离后，滴加20μL的二次水溶液于其上，10秒钟后，移去溶液。②滴加20μL 1mM MgCl2溶液于云母片，10秒钟后，移去溶液。③将DNA溶液(5μL)或DNA和钌多吡啶配合物的混合溶液滴在云母片的基底上，10分钟后，移去溶液，用二次水充分淋洗，进行AFM扫描。AFM扫描结果表明：
[0044] 不加入本发明诱导DNA缩合的钌多吡啶配合物的单纯DNA呈现的是松弛的环形；当加入本发明诱导DNA缩合的钌多吡啶配合物时，环形的DNA均呈现出不同大小纳米颗粒。
加入的[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2](ClO4)2的浓度为140ng/μL，颗粒直径为176nm；加入的[(bpy)2Ru(obnibH2)Ru(bpy)2](ClO4)2的浓度为140ng/μL，颗粒直径为128nm。
加入的[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2](ClO4)2的浓度为140ng/μL，颗粒直径为176nm；加入的[(bpy)2Ru(obnibH2)Ru(bpy)2](ClO4)2的浓度为140ng/μL，颗粒直径为128nm。
[0045] (3)激光动态光散射(DLS)实验：
[0046] 含有相同量的pBR322DNA(1ng/μL)的溶液中加入不同量的Ru(II)配合物的溶液，混合均匀，加入缓冲液(50mM Tris，18mM NaCl buffer，pH 7.2)使反应液的最终体积保持在50μL。样品溶液被转移到石英池中，在测量前静置2分钟。设定激光角度为90°，激发波长为660nm。每份样品平行测量三次，取其平均值。测量条件为：配合物4+ 4+
[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2] 浓度为140ng/μL，配合物[(bpy)2Ru(obnibH2)Ru(bpy)2]浓度为140ng/μL；激光角度为90°，DNA的浓度是1ng/μL；测得的诱导pBR322DNA缩合形成的纳米颗粒直径分布结果为：当[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2](ClO4)2的浓度为140ng/μL时，诱导pBR322DNA缩合纳米颗粒直径为261nm，[(bpy)2Ru(obnibH2)Ru(bpy)2](ClO4)2的浓度为140ng/μL时，诱导pBR322DNA缩合纳米颗粒直径分别为216nm。
[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2] 浓度为140ng/μL，配合物[(bpy)2Ru(obnibH2)Ru(bpy)2]浓度为140ng/μL；激光角度为90°，DNA的浓度是1ng/μL；测得的诱导pBR322DNA缩合形成的纳米颗粒直径分布结果为：当[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2](ClO4)2的浓度为140ng/μL时，诱导pBR322DNA缩合纳米颗粒直径为261nm，[(bpy)2Ru(obnibH2)Ru(bpy)2](ClO4)2的浓度为140ng/μL时，诱导pBR322DNA缩合纳米颗粒直径分别为216nm。
[0047] 实施例3钌多吡啶配合物介导的基因转染实验：
[0048] 将生长良好的HeLa细胞接种到24孔培养板中，在37℃，5％CO2条件下孵育18～24h后至细胞融合度为60％□80％，转染质粒pEGFP。转染前2h，将完全培养基吸去，用无血清培养基洗涤两次，加入不同比例的钌配合物/DNA复合物(每孔含1μg DNA)孵育5h后，将无血清培养基换成完全培养基.48h后检验转染结果。采用倒置荧光显微镜进行观察拍照，采用流式细胞仪进行定量分析。基因转染实验证实，以配合物[(bpy)2Ru(obpibH2)
4+ 4+
Ru(bpy)2] 和[(bpy)2Ru(obnibH2)Ru(bpy)2] 为载体，成功介导了质粒pEGFP在HeLa细胞中的基因转染。
4+ 4+
Ru(bpy)2] 和[(bpy)2Ru(obnibH2)Ru(bpy)2] 为载体，成功介导了质粒pEGFP在HeLa细胞中的基因转染。