一种藻菌混合微生物制剂及其制法和应用

摘要

本发明公开了一种藻菌混合微生物制剂及其制法和应用。本发明所提供的微生物制剂由无菌纯栅藻、烷烃降解菌GS3C、菲降解菌GY2B、芘降解菌GP3混合制备。烷烃降解菌和芳烃降解菌组合对石油污染物中的主要组分烷烃和芳烃物质有非常好的互补降解作用。藻能为细菌提供代谢原油所需的O2，同时产生的CO2又被藻利用生长。该混合制剂能非常高效的降解修复石油污染物。在初始体积浓度为0.3％原油污染条件下，7天能较为彻底的除去烷烃中直链和难降解支链烷烃，对芳烃中萘、芴、菲及其同系物去除率分别达96％、58％、61％以上。

权利要求

1.一种藻菌混合微生物制剂，其特征在于：由无菌纯栅藻、洋葱伯克霍尔德氏菌GS3C(Burkholderia cepacia)、鞘氨醇单胞菌GY2B(sphingomonas)、芘降解菌GP3：假单胞菌GP3A(Pseudomonas)和伯克氏菌GP3B(Pandoraea pnomenusa)组成；所述无菌纯栅藻是由栅藻除菌纯化后得到；GS3C的保藏编号为CCTCC M 207169，GY2B的保藏编号为CCTCC M206019，GP3A的保藏编号为CCTCC NO：M 207166，GP3B的保藏编号为CCTCC NO：M207167。

2.制备权利要求1所述的一种藻菌混合微生物制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用平板分离法得到单种栅藻；

(2)用溶菌酶缓冲液对栅藻进行预处理；

(3)利用抗生素对栅藻进行除菌，得到无菌纯栅藻；

(4)微生物接种量为：纯栅藻与总石油组分降解菌按照2∶1体积比例接种培养基，总石油组分降解菌为GS3C、GY2B、GP3A和GP3B按照等体积比混合；

(5)扩大培养条件：培养基为BG11培养液，在温度为25±1℃，转速150rmp的光照摇床培养，光照强度为8000LX，光暗比L/D＝14∶10，将接种后的培养液扩大培养培养7～10天，即得本发明的藻菌混合微生物制剂；

所述本发明的藻菌混合微生物制剂由纯栅藻、GY2B、GS3C、GP3A和GP3B组成。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的溶菌酶缓冲液中Tween80浓度为

0.005mol/l，EDTA浓度为0.1mol/l，SDS浓度为0.25mol/l，溶菌酶浓度为0.5g/l。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的预处理为在栅藻中加入溶菌酶缓冲液放置10分钟后，离心倒掉上清液，加入灭菌蒸馏水重复洗涤三次。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的抗生素为青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、利福平和四环素中的一种以上。

6.权利要求1所述的藻菌混合微生物制剂在水域石油污染生物修复中的应用。

说明书

一种藻菌混合微生物制剂及其制法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于环境有机污染物生物处理技术领域，具体涉及一种藻菌混合微生物制剂及其制法和应用。

背景技术

[0002] 石油作为一种非常重要的能源在世界范围被广泛使用，由其带来的污染越来越严重。据不完全统计，每年通过各种渠道泄入水体的石油和石油产品约占全球石油总产量的0.5％，约为200～1000万吨。我国近海水域水质含油量超过国家规定2～8倍，污染状况十分严峻。

[0003] 石油是一种复杂的多组分混合物，其主要组成是烃类(烷烃和芳烃等)。其中PAHs(多环芳烃)是毒性很强的物质，除可影响水生生物生理、繁殖与行为外，甚至可直接触杀水生生物。PAHs等大多属于憎水性的持久性有机污染物(POPs)，在环境中难以被降解，一方面易富集于水生生物的组织和器官中，长期释放其毒性，另一方面可通过食物链进入人体，对人类健康造成严重危害。

[0004] 生物修复技术因其具有无二次污染、处理费用低等优点，在石油污染治理方面逐渐成为核心。近年来，国内外学者在此领域做了大量研究，发现细菌中降解石油的属有假单胞菌属、黄杆菌属、棒状杆菌属、无色杆菌属、节杆菌属、不动杆菌属、小球菌属等菌等。

[0005] 目前大部分研究工作筛选的单一石油降解菌只能利用石油中一种或几种烃类；同时，石油中各组分完全生物氧化需要消耗大量的氧，据测算1克石油被微生物矿化需要3～4克氧，而1升石油，则需要消耗40万升水体中的溶解氧。在石油污染严重的水域，氧可能成为石油降解的限制因子。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种藻菌混合微生物制剂及其制法和应用，本发明针对上述现有水体石油污染生物修复技术所面临的问题，设计降解机理互补、协同作用好的混合菌剂，同时利用藻提供O2，解决污染水域供氧不足问题。

[0007] 本发明目的通过以下技术方案来实现：

[0008] 一种藻菌混合微生物制剂，由无菌纯栅藻、烷烃降解菌GS3C(Burkholderia cepacia)、菲高效降解菌GY2B(sphingomonas)、芘降解菌GP3：GP3A(Pseudomonas)，GP3B(Pandoraeapnomenusa)组成；所述无菌纯栅藻是由栅藻除菌纯化后得到。

[0009] 三种石油组分降解菌株为本课题组前期工作分离筛选所得，已经对其进行菌种鉴定，提交16SrDNA序列号至GenBank，并在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏。菲高效降解菌GY2B(sphingomonas)，GenBank登录号DQ139343，保藏编号为CCTCC M 206019；芘降解菌GP3：GP3A(Pseudomonas)，GenBank登录号为EU233280，保藏编号为CCTCC NO：M 207166；GP3B(Pandoraea pnomenusa)的登录号为EU233279，保藏编号为CCTCC NO：M207167；烷烃降解菌GS3C(Burkholderia cepacia)，登录号为EU282110，保藏编号为CCTCCM207169。

[0010] 所述的一种藻菌混合微生物制剂的制备方法，包括以下步骤

[0011] (1)利用平板分离法得到单种栅藻；

[0012] (2)用溶菌酶缓冲液对栅藻进行预处理；

[0013] (3)利用抗生素对栅藻进行除菌，得到无菌纯栅藻；

[0014] (4)微生物接种量为：纯栅藻与总石油组分降解菌按照2∶1体积比例接种培养基，总石油组分降解菌为GS3C、GY2B、GP3A和GP3B按照等体积比混合；

[0015] (5)扩大培养条件：培养基为BG11培养液，在温度为25±1℃，转速150rmp的光照摇床培养，光照强度为8000LX，光暗比L/D＝14∶10，将接种后的培养液扩大培养培养7～10天，即得本发明的藻菌混合微生物制剂。

[0016] 所述的溶菌酶缓冲液中Tween80浓度为0.005mol/l，EDTA浓度为0.1mol/l，SDS浓度为0.25mol/l，溶菌酶浓度为0.5mg/ml。

[0017] 所述的预处理为在栅藻中加入溶菌酶缓冲液放置10分钟后，离心倒掉上清液，加入灭菌蒸馏水重复洗涤三次；

[0018] 所述的抗生素为青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、利福平和四环素中的一种以上。

[0019] 优选青霉素+庆大霉素组合，能将栅藻所带细菌全部去除而得到无菌栅藻。

[0020] 所得栅藻形态学特征为：藻细胞为真性定形群体，扁平，4个细胞为一组，群体细胞并排成一列，细胞纺锤形，上下两端逐渐尖细，群体两侧细胞凸出，细胞壁平滑。

[0021] 由于单种藻是单一藻类及其附生的细菌，即天然的菌藻混合共生体系。由于其本身附生的细菌与石油组分降解菌株并不能非常好的相互适应，单种栅藻与石油组分降解菌并不能发挥良好的作用。故对栅藻除菌纯化后得无菌纯栅藻与石油组分降解菌组建高效的石油降解体系。

[0022] 本发明相对于现有技术的有益效果和优点：

[0023] 1、能更彻底的降解原油污染物；

[0024] 2、在实际污染修复中能解决溶解氧限制问题，从而降低修复费用。

附图说明

[0025] 图1烷烃降解率图；

[0026] 图2萘系列物质降解率图；

[0027] 图3芴系列物质降解率图；

[0028] 图4菲系列物质降解率图；

[0029] 图5为单种藻、单种栅藻+菌和纯栅藻+菌的DGGE图

[0030] 左为单种藻；中为单种栅藻+菌；右为纯栅藻+菌；

[0031] 图6烷烃组分降解前GC/MS图谱；

[0032] 图7烷烃组分降解后GC/MS图谱；

[0033] 图8芳烃组分降解前GC/MS图谱；

[0034] 图9芳烃组分降解后GC/MS图谱。

具体实施方式

[0035] 以下结合具体实施方式对本发明近一步进行说明。

[0036] 实施例1：藻菌组合对原油降解效果，最佳菌藻组合优化

[0037] 分别对各菌藻组合对原油降解效果测定，以得到降解效果最佳的混合制剂。原油各组分降解率图为图1到图4。

[0038] (1)石油组分降解菌对原油降解

[0039] GS3C是以正十六烷烃为碳源得到的石油组分降解菌，它对原油的烷烃组分有非常好的降解效果，但不降解芳烃；GY2B是菲高效降解菌株，它对石油组分中多环芳烃的萘系列、芴系列、菲系列物质都有一定降解效果，但不能利用烷烃；GP3是由芘富集得到的两株混合菌GP3A和GP3B，它对原油中烷烃能有较好的去除效果，而对芳烃降解率却比较低。一方面由于实验用原油几乎不含四个环的芘，另外GP3A是假单胞菌属(Pseudomonas)，它与很多同类假单胞菌一样具有降解烷烃的性能。

[0040] GY2B+GS3C有非常好的互补作用，能对烷烃和芳烃都有较高的降解率。GY2B+GP3也有类似互补，但其稳定性能不如GY2B+GS3C组合。GP3+GS3C对烷烃有非常好的降解效果，但芳烃降解率很低。

[0041] 三种菌组合对烷烃和芳烃都有较高去除率，相比GY2B+GS3C，加入GP3能将烷烃中难降解的支链烷烃都去除，使得烷烃的降解更彻底。

[0042] (2)石油组分降解菌与单种藻组合

[0043] 并未出现促进或者加和作用，相比未加藻组合，降解率反而变低，烷烃降解率下降尤其明显。

[0044] (3)石油组分降解菌与纯藻组合

[0045] 纯藻能对菌或者混合菌对原油各组分的降解有相应的促进作用，提高降解率。对混合菌而言，与纯藻混合培养更能提高体系稳定性能，各平行样之间降解率相对误差变小。

[0046] 以纯藻和三种石油组分降解菌组合构建的体系为原油降解效果最佳的菌藻共生体系。

[0047] 本实施例说明三个石油组分降解菌株对原油主要成分烷烃和芳烃有非常好的互补降解作用，而利用纯藻不仅能协同菌，进一步促进其降解作用，还能提高混合体系降解稳定性能，以纯栅藻、GY2B、GS3C、GP3制备的混合制剂是一种高效、稳定的石油污染微生物修复制剂。

[0048] 实施例2：藻菌混合体系生物多态性分析

[0049] 用PCR-DGGE分子生物学手段对各混合体系多态性进行分析，得到DGGE图片如图5所示。

[0050] (1)单种藻

[0051] 图5中单种栅藻体系DGGE图，单种藻体系有5个条带，其核酸序列在GenBank数据库中比对结果如表1所示：条带1为栅藻GH2的16SrDNA片断，其他4个条带对应四种优势细菌。带2与拟杆菌门(Bacteroidetes)细菌相似度最高；条带3为氢噬胞菌(Hydrogenophaga)；条带4最接近不可培养的β-变性杆菌(beta-proteobacterium)；条带5为嗜甲基菌(Methylophilus)。

[0052] 在无藻生长的情况下，条带2和4也随之消失，说明这两种细菌是必须要依附栅藻才能在培养体系中生长。

[0053] 表1

[0054]

[0055] (2)单种栅藻+石油组分降解菌体系

[0056] 图5中单种栅藻+石油组分降解菌体系DGGE图，图片显示，GS3C+GP3使单种藻体系优势菌数量和种类变少，条带2，3，4几乎消失，条带5变淡，这是因为GS3C+GP3降解绝大部分烷烃，一方面与其他菌株竞争毒性较小的烷烃碳源，同时滞留的大部分芳烃对这些菌株的毒性作用使其不能良好生长。

[0057] GS3C+GP3+GY2B能同时对芳烃也有较好的去除，故未出现此现象。其他菌组合均为对单种藻自带菌体现出强烈的抑制作用。

[0058] 通过对细菌系统发育树来分析，GS3C与微藻自带菌的条带3、4、5同源性都为比较较近，同属于β-变形杆菌，这有可能是对某些共同需要的碳源或其他营养物质产生竞争，使得GS3C在这个体系中对烷烃降解性能反而下降。

[0059] (3)纯藻+石油组分降解菌体系

[0060] 图5中纯藻+石油组分降解菌体系DGGE图，除了石油组分降解菌株和栅藻GH2，DGGE图片上没有出现其他细菌的条带，对微藻自带菌彻底除去，才更有利于构建稳定的新的菌藻共生体系。

[0061] 实施例3：藻菌混合制剂制备及其对原油降解效果的GC/MS分析

[0062] 本发明藻菌混合微生物制剂的制备：利用平板分离法得到单种栅藻，配制溶菌酶缓冲液，其中Tween80在溶菌酶缓冲液中的浓度为0.005mol/l，EDTA占0.1mol/l，SDS占0.25mol/l，溶菌酶占0.5mg/ml。在栅藻中加入溶菌酶缓冲液浸没栅藻放置10分钟后，离心倒掉上清液，加入灭菌蒸馏水重复洗涤三次；将青霉素和庆大霉加入培养基对栅藻进行除菌，得到无菌纯栅藻；纯栅藻与总石油组分降解菌按照2∶1体积比例接种培养基，总石油组分降解菌为GS3C、GY2B、GP3按照体积比1∶1∶1混合；培养基为BG11培养液，在温度为25±1℃，转速150rmp的光照摇床培养，光照强度为8000LX，光暗比L/D＝14∶10，将接种后的培养液扩大培养培养7～10天，即得本发明的藻菌混合微生物制剂。

[0063] 从图6-9，可以看出本发明的藻菌混合制剂7天能较为彻底的去除原油组分中直链及难降解的支链烷烃；对芳烃物质而言，能基本去除萘(Naphthalene)、芴(Fluorene)、菲(Phenanthrene)以及萘的三个及其以下甲基取代同系物的C1N、C2N、C3N，对芴同系物，菲同系物中C1P、C2P、C3P均有明显的去除作用。