用于生物脱氮的睾丸酮丛毛单胞菌菌株及其应用转让专利
申请号 : CN200910085188.3
文献号 : CN101560487B
文献日 : 2010-12-08
发明人 : 陈倩 , 倪晋仁
申请人 : 北京大学
摘要 :
本发明公开了一种用于生物脱氮的睾丸酮丛毛单胞菌菌株及其应用。本发明提供的睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)GAD4已于2009年3月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC№ 2963。将该菌株置于溶解氧为2-6mg/L的含氮废水中即可生物脱氮。该菌株不但具有异养硝化能力，同时具有好氧反硝化能力。在处理含氮废水时，只需一个好氧阶段，脱氮效率高，操作便捷，与传统生物脱氮工艺相比具有巨大的经济效益。
权利要求 :
1.睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)菌株GAD4，其保藏号为CGMCC№ 2963。
2.权利要求1所述的保藏号为CGMCC № 2963的睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)菌株GAD4在脱氮中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述脱氮在含氮液体中进行，所述含氮液体的溶解氧是4-6mg/L。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述含氮液体的温度为15-40℃。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述含氮液体的温度为30-35℃。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述含氮液体的pH为6-12。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述含氮液体的pH为7-11。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述含氮液体中的氮是氨氮、硝酸盐氮和/或亚硝酸盐氮。
9.一种用于生物脱氮的微生物菌剂，其活性成分为权利要求1所述的保藏号为CGMCC № 2963的睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)菌株GAD4。
说明书 :
技术领域
本发明涉及生物脱氮领域，特别涉及一种用于生物脱氮的睾丸酮丛毛单胞菌菌株及其应用。
背景技术
氮元素在废水中的主要存在形式有分子态氮、有机态氮、氨态氮、亚硝态氮、硝态氮，以及部分存在于硫氢化物和氰化物中的氮。由于氨氮的毒性作用、硝酸盐的致癌作用以及氮化物对生态系统、河流、湖泊、近海海洋的酸化和富营养化作用，如何经济、高效地去除水中的氮素的污水处理技术已成为水污染控制领域的研究重点和热点。
在目前已应用的多种脱氮方法中，生物脱氮仍是废水脱氮处理的主要手段。传统的废水脱氮工艺是：污水中的有机氮化合物在生化过程中首先转化为氨氮，氨氮在硝化过程中由自养菌将其转化为硝酸盐和亚硝酸盐；然后由反硝化菌在缺氧条件下将硝酸盐和亚硝酸盐还原转化为气体产物而使废水脱氮。硝化是反硝化的前提，但反硝化过程才真正达到废水中的含氮化合物脱除的目的。由于硝化细菌具有强烈的好氧性，硝化过程必须好氧；而传统反硝化菌在有氧条件下即以氧气为电子受体进行有氧呼吸，只有无氧状态时才以硝酸盐或亚硝酸盐为电子受体，获取合成细胞体的能量，因此传统反硝化菌仅能在缺氧环境下才能进行反硝化。根据传统生物脱氮理论而发展起来的生物脱氮工艺通常将硝化和反硝化分别在好氧区与缺氧区进行，形成分级硝化反硝化工艺，因此必须分别建造硝化池和反硝化池，这样就使得分级硝化反硝化工艺存在很多不足之处：(1)工艺冗长。由于硝化与反硝化作用需氧性不同，必须分别建造硝化池和反硝化池，形成分级硝化反硝化工艺，增加了基建投资和运行费用；(2)能耗大。氨氮硝化需要耗氧供能，前置反硝化系统必须进行硝化液内回流，增加了动力消耗与运行费用；(3)反硝化细菌要有碳源作为电子供体，若污水中碳/氮比过低，则需投加甲醇等有机碳，这不仅增加了运行费用，也增加了运行管理与后续处理的难度；(4)硝化菌群通常是自养菌，增殖缓慢，难以维持较高的生物浓度，而且容易在废水生物处理中被淘汰。
针对传统工艺中的缺陷和不足，国内外一直进行着解决这些问题的研究，努力探求新型、效果更好的脱氮微生物。20世纪80年代以来生物学家研究发现一些细菌可以对有机或无机氮化合物进行异养硝化。与自养型硝化细菌相比，异养型硝化细菌的生长速率快，细胞产率高。此外，研究报道证实一些菌株在好氧的条件下也能够进行反硝化作用。事实上，研究者已经从土壤和活性污泥中分离出许多好氧反硝化细菌，如Thiosphaera Pantotropha，Diaphorobacter，Comamonas，ParacoccusDenitrifications，Alcaligenes Faecalis和Microvirgula Aerodenitrificans等。这些发现为实现废水的脱氮处理提供了一种新的思路。
需要指出的是，随着研究的深入，人们又发现了一些细菌可以对有机或无机氮化合物进行异养硝化。然而，目前还没有对兼有异养硝化-好氧反硝化能力细菌的报道，将这类特殊细菌应用于废水脱氮处理过程的实际应用更是空白。因此发掘更多的具有这种功能的细菌，并将其应用于实际的含氮废水的处理过程，对弥补传统生物脱氮过程中的不足具有划时代的意义。
在目前已应用的多种脱氮方法中，生物脱氮仍是废水脱氮处理的主要手段。传统的废水脱氮工艺是：污水中的有机氮化合物在生化过程中首先转化为氨氮，氨氮在硝化过程中由自养菌将其转化为硝酸盐和亚硝酸盐；然后由反硝化菌在缺氧条件下将硝酸盐和亚硝酸盐还原转化为气体产物而使废水脱氮。硝化是反硝化的前提，但反硝化过程才真正达到废水中的含氮化合物脱除的目的。由于硝化细菌具有强烈的好氧性，硝化过程必须好氧；而传统反硝化菌在有氧条件下即以氧气为电子受体进行有氧呼吸，只有无氧状态时才以硝酸盐或亚硝酸盐为电子受体，获取合成细胞体的能量，因此传统反硝化菌仅能在缺氧环境下才能进行反硝化。根据传统生物脱氮理论而发展起来的生物脱氮工艺通常将硝化和反硝化分别在好氧区与缺氧区进行，形成分级硝化反硝化工艺，因此必须分别建造硝化池和反硝化池，这样就使得分级硝化反硝化工艺存在很多不足之处：(1)工艺冗长。由于硝化与反硝化作用需氧性不同，必须分别建造硝化池和反硝化池，形成分级硝化反硝化工艺，增加了基建投资和运行费用；(2)能耗大。氨氮硝化需要耗氧供能，前置反硝化系统必须进行硝化液内回流，增加了动力消耗与运行费用；(3)反硝化细菌要有碳源作为电子供体，若污水中碳/氮比过低，则需投加甲醇等有机碳，这不仅增加了运行费用，也增加了运行管理与后续处理的难度；(4)硝化菌群通常是自养菌，增殖缓慢，难以维持较高的生物浓度，而且容易在废水生物处理中被淘汰。
针对传统工艺中的缺陷和不足，国内外一直进行着解决这些问题的研究，努力探求新型、效果更好的脱氮微生物。20世纪80年代以来生物学家研究发现一些细菌可以对有机或无机氮化合物进行异养硝化。与自养型硝化细菌相比，异养型硝化细菌的生长速率快，细胞产率高。此外，研究报道证实一些菌株在好氧的条件下也能够进行反硝化作用。事实上，研究者已经从土壤和活性污泥中分离出许多好氧反硝化细菌，如Thiosphaera Pantotropha，Diaphorobacter，Comamonas，ParacoccusDenitrifications，Alcaligenes Faecalis和Microvirgula Aerodenitrificans等。这些发现为实现废水的脱氮处理提供了一种新的思路。
需要指出的是，随着研究的深入，人们又发现了一些细菌可以对有机或无机氮化合物进行异养硝化。然而，目前还没有对兼有异养硝化-好氧反硝化能力细菌的报道，将这类特殊细菌应用于废水脱氮处理过程的实际应用更是空白。因此发掘更多的具有这种功能的细菌，并将其应用于实际的含氮废水的处理过程，对弥补传统生物脱氮过程中的不足具有划时代的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于生物脱氮的睾丸酮丛毛单胞菌菌株及其应用，该菌株兼有异养硝化-好氧反硝化能力。
本发明提供的睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)GAD4已于2009年3月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC№2963。
菌株GAD4是从处理垃圾渗滤液的组合系统中取样，经驯化、分离及纯化得到的一株革兰氏阴性细菌。
形态特征：菌株GAD4在30-40℃下，营养琼脂培养基上培养16-32h后，菌落表面光滑，无色素；通过革兰氏染色后在显微镜下呈阴性，菌体呈杆状，大小为(0.5-1.0)μm×(1.5-5.0)μm，细胞单个或成对出现，有端生成束的鞭毛，不产芽孢。
生理生化特征：接触酶、氧化酶、尿素酶反应结果为阳性；不能够进行纤维素水解反应；MR和VP结果呈阴性；能够以柠檬酸钠为碳源进行生长；能够利用丙酸盐；不能利用葡萄糖、果糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、乳糖、甘露糖和麦芽糖发酵。
该菌株的16S rRNA基因序列特征：其16S rRNA具有如序列表示所示的核苷酸序列，序列长度为1462bp。
根据其形态特征和生理生化特征及其16S rRNA基因序列，鉴定该菌株为睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)。
该菌株可用来脱氮，在实际应用中，可将菌株GAD4置于含氮液体中，进行生物脱氮。所述含氮液体的溶解氧可为2-6mg/L。
所述含氮液体的pH可为6-12，优选为7-11。
所述含氮液体的温度可为15-40℃，优选为30-35℃。
所述含氮液体中的碳源可为无水乙酸钠、琥珀酸钠、酒石酸钾钠和/或柠檬酸钠。
所述含氮液体中的氮是氨氮、硝酸盐氮和/或亚硝酸盐氮。
本发明的又一目的在于提供一种用于生物脱氮的微生物菌剂，其活性成分为所述的菌株GAD4。
本发明的睾丸酮丛毛单胞菌及其应用与现有技术相比较有如下有益效果：
1.本发明的菌株GAD4的生长细胞、细胞悬浮液均能分别以氨氮或硝酸盐氮为唯一氮源生长，能够在有氧条件下进行异养硝化-好氧反硝化作用，是一株新发现的具有同步硝化反硝化能力的细菌。该菌株的这种特性，可以将其直接接种于含氮废水中，只需通过好氧阶段即可实现氮素的去除；解决了传统废水处理中生物脱氮需要采取缺氧反硝化、好氧硝化分段处理的问题；另外，简化了工艺流程，节省了设备和投资的成本，因此，具有巨大的经济效益和环境效益；
2.该菌株适用于各种含氮废水的脱氮处理，应用前景广阔，具有很好的社会效益；
3.本发明的菌株GAD4接种于初始氨氮浓度为75mg/L的废水中，可以利用有机物为唯一碳源，氨氮为唯一氮源进行新陈代谢，12h内氨氮和总氮的去除率分别达到90.85％和84.45％，氨氮降解速率为5.79mgN/L·h；废水中大部分的氨氮通过异养硝化-好氧反硝化作用直接转化为气体产物，亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的积累较少；
4.本发明的菌株GAD4接种到初始硝酸盐氮浓度为160mg/L的废水中，可以利用硝酸盐为唯一氮源进行新陈代谢，24h内硝酸盐氮的去除率达到64.05％，降解速率为4.25mgN/L·h，说明菌株具有良好的好氧反硝化能力；
5、本发明的菌株GAD4接种于初始浓度为400mg/L的氨氮或硝酸盐氮废水中，仍具有较好的降解效果和脱氮能力，氨氮和硝酸盐氮降解速率分别为3.14mgN/L·h和3.12mgN/L·h；
6、本发明的菌株GAD4接种于不同pH值的硝酸盐氮废水中，在中性及偏碱性的条件下菌株的降解能力较强，此时pH对降解效果的影响不大，这种特性使该菌株的实用性大大增强。
本发明提供的睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)GAD4已于2009年3月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC№2963。
菌株GAD4是从处理垃圾渗滤液的组合系统中取样，经驯化、分离及纯化得到的一株革兰氏阴性细菌。
形态特征：菌株GAD4在30-40℃下，营养琼脂培养基上培养16-32h后，菌落表面光滑，无色素；通过革兰氏染色后在显微镜下呈阴性，菌体呈杆状，大小为(0.5-1.0)μm×(1.5-5.0)μm，细胞单个或成对出现，有端生成束的鞭毛，不产芽孢。
生理生化特征：接触酶、氧化酶、尿素酶反应结果为阳性；不能够进行纤维素水解反应；MR和VP结果呈阴性；能够以柠檬酸钠为碳源进行生长；能够利用丙酸盐；不能利用葡萄糖、果糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、乳糖、甘露糖和麦芽糖发酵。
该菌株的16S rRNA基因序列特征：其16S rRNA具有如序列表示所示的核苷酸序列，序列长度为1462bp。
根据其形态特征和生理生化特征及其16S rRNA基因序列，鉴定该菌株为睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)。
该菌株可用来脱氮，在实际应用中，可将菌株GAD4置于含氮液体中，进行生物脱氮。所述含氮液体的溶解氧可为2-6mg/L。
所述含氮液体的pH可为6-12，优选为7-11。
所述含氮液体的温度可为15-40℃，优选为30-35℃。
所述含氮液体中的碳源可为无水乙酸钠、琥珀酸钠、酒石酸钾钠和/或柠檬酸钠。
所述含氮液体中的氮是氨氮、硝酸盐氮和/或亚硝酸盐氮。
本发明的又一目的在于提供一种用于生物脱氮的微生物菌剂，其活性成分为所述的菌株GAD4。
本发明的睾丸酮丛毛单胞菌及其应用与现有技术相比较有如下有益效果：
1.本发明的菌株GAD4的生长细胞、细胞悬浮液均能分别以氨氮或硝酸盐氮为唯一氮源生长，能够在有氧条件下进行异养硝化-好氧反硝化作用，是一株新发现的具有同步硝化反硝化能力的细菌。该菌株的这种特性，可以将其直接接种于含氮废水中，只需通过好氧阶段即可实现氮素的去除；解决了传统废水处理中生物脱氮需要采取缺氧反硝化、好氧硝化分段处理的问题；另外，简化了工艺流程，节省了设备和投资的成本，因此，具有巨大的经济效益和环境效益；
2.该菌株适用于各种含氮废水的脱氮处理，应用前景广阔，具有很好的社会效益；
3.本发明的菌株GAD4接种于初始氨氮浓度为75mg/L的废水中，可以利用有机物为唯一碳源，氨氮为唯一氮源进行新陈代谢，12h内氨氮和总氮的去除率分别达到90.85％和84.45％，氨氮降解速率为5.79mgN/L·h；废水中大部分的氨氮通过异养硝化-好氧反硝化作用直接转化为气体产物，亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的积累较少；
4.本发明的菌株GAD4接种到初始硝酸盐氮浓度为160mg/L的废水中，可以利用硝酸盐为唯一氮源进行新陈代谢，24h内硝酸盐氮的去除率达到64.05％，降解速率为4.25mgN/L·h，说明菌株具有良好的好氧反硝化能力；
5、本发明的菌株GAD4接种于初始浓度为400mg/L的氨氮或硝酸盐氮废水中，仍具有较好的降解效果和脱氮能力，氨氮和硝酸盐氮降解速率分别为3.14mgN/L·h和3.12mgN/L·h；
6、本发明的菌株GAD4接种于不同pH值的硝酸盐氮废水中，在中性及偏碱性的条件下菌株的降解能力较强，此时pH对降解效果的影响不大，这种特性使该菌株的实用性大大增强。
附图说明
图1为菌株GAD4的显微镜照片；
图2为菌株GAD4对氨氮的降解曲线；
图3为菌株GAD4对硝酸盐氮的降解曲线；
图4为菌株GAD4对氨氮的降解曲线；
图5为菌株GAD4对硝酸盐氮的降解曲线；
图6为菌株GAD4在不同转速条件下对氨氮的降解；
图7为菌株GAD4在不同pH条件下对硝酸盐氮的降解；
图2为菌株GAD4对氨氮的降解曲线；
图3为菌株GAD4对硝酸盐氮的降解曲线；
图4为菌株GAD4对氨氮的降解曲线；
图5为菌株GAD4对硝酸盐氮的降解曲线；
图6为菌株GAD4在不同转速条件下对氨氮的降解；
图7为菌株GAD4在不同pH条件下对硝酸盐氮的降解；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中，所述百分含量如无特殊说明，均为质量百分含量。
实施例1.具有异养硝化-好氧反硝化性能的菌株GAD4的获得和生物脱氮实验
一、具有异养硝化-好氧反硝化性能的菌株GAD4的分离纯化方法
该方法有以下步骤：
1)从深圳布吉垃圾填埋场垃圾渗滤液组合处理系统中取出污泥样本；
2)接种到装有100mL富集培养液的500mL锥形瓶中：每L含0.95g NaNO3，0.7g蛋白胨，0.5g牛肉膏，0.15g尿素，0.04g NaCl，0.15g KH2PO4，0.02g KCl，0.03g MgSO4·7H2O，0.20g CaCl2·2H2O，其中培养液pH为7.0-7.5；
3)用纱布包好瓶口，于30℃，140rpm条件下摇床振荡培养4d；
4)以此摇瓶中的菌液为菌种源，取出10mL接种至新鲜的装有150mL富集培养液的锥形瓶中，培养条件相同，每隔4d转接一次；
5)转接4次后，对培养液进行10倍梯度稀释，稀释液均匀涂布在营养培养基上：每L含1.5g KNO3；1.0g KH2PO4；0.06g FeSO4·7H2O；0.2g CaCl2·2H2O；1.0gMgSO4·7H2O；8.5g琥珀酸钠；18g琼脂；其中培养基中pH为7.0，30℃恒温培养3d；
6)从菌落数为100左右的平板上挑选形状不同的菌落反复划线纯化，并进行显微镜观察直至获得单菌落作为初筛菌种；
7)对获得的初筛菌种进行性能测试；
8)由此分离出一株高效的具有异养硝化-好氧反硝化能力的细菌-菌株GAD4。
二、以氨氮(NH4+-N)为氮源的生物脱氮实验
以氨氮为氮源，琥珀酸钠为有机碳源，实施菌株GAD4对氨氮的去除能力测定。具体实施步骤如下：
将菌株GAD4接种于1L含0.5g KNO3和0.35g NH4Cl的LB培养基中(每升含NaCl 5g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g)，防止杂菌的侵入及保持菌体的生长活力，进行富集培养。将培养得到的菌液离心，用0.05％的NaCl水溶液洗涤三次，制成光密度OD600为1-2的菌悬液。
取10mL所制备的菌株GAD4菌悬液，加入三个含有90ml测试培养基的培养瓶中(每L培养基含0.29g NH4Cl，1.0g KH2PO4，0.06g FeSO4·7H2O，0.2gCaCl2·2H2O，1.0g MgSO4·7H2O，8.5g琥珀酸钠，pH 7.0-7.3)，用9层纱布封口，30℃，180rpm(回旋半径15mm)的摇床中振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。每隔2小时取反应液，其中一部分直接用于测定菌体光密度(OD600)，其余部分在4000rpm下离心10min，取上清液测定各种含氮化合物的浓度。
结果如图2所示，菌株GAD4对氨氮有较强的降解能力，异养硝化速率高。在反应期间的12h内，氨氮的去除率即达到90.85％。从菌株的生长曲线看，在最初的2h内菌株处于静止期，随后的2-8h菌株进入对数生长期，氨氮的降解非常迅速，其降解曲线几乎呈直线下降；此后，微生物生长进入内源呼吸期，菌体几乎没有出现增长。
同时，总氮(TN)的去除率也达到84.45％。大部分的氨氮通过异养硝化-好氧反硝化作用被去除，残留的氮素主要以硝酸盐氮的形式存在。
步骤二中菌株GAD4降解氨氮的途径是将氨氮转化为硝酸盐氮，然后硝酸盐氮还原为气体产物，与传统方法不同的是这两个过程由同一株菌株独立完成。
由此可以看出，以氨氮为氮源，菌株GAD4具有较强的异养硝化-好氧反硝化能力。
三、以硝酸盐氮(NO3--N)为氮源的生物脱氮实验
取10mL按照步骤二的方法所制备的菌株GAD4的菌悬液，加入到三个含有90ml测试培养基的培养瓶中(每L培养基含1.16g KNO3，1.0g KH2PO4，0.06gFeSO4·7H2O，0.2g CaCl2·2H2O，1.0g MgSO4·7H2O，8.5g琥珀酸钠，pH 7.0～7.3)，用9层纱布封口，30℃，180rpm(回旋半径15mm)的摇床中振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。每隔2小时取反应液，并在4000rpm下离心10min，取上清液测定各种含氮化合物的浓度。
结果如图3所示，菌株GAD4在好氧的条件下对硝酸盐氮有较强的去除能力，24h内实现了对硝酸盐氮64.05％的去除，去除速率为4.25mg氮/L·h(mgN/L·h)；总氮的去除率为63.28％，几乎没有出现亚硝酸盐氮(NO2--N)的积累。最初的4-6h内，硝酸盐氮的浓度基本保持不变，说明微生物处于静止期；此后微生物进入对数生长期，曲线呈直线下降。充分说明在好氧条件下菌株能够以硝酸盐氮和亚硝酸盐氮为电子受体进行反硝化作用，好氧反硝化的能力良好。
四、含氮废水的生物脱氮实验
在废水(废水水质如下：pH为7.5，氨氮含量30mg/L，硝酸盐氮含量6mg/L，COD 550mg/L)中加入菌株GAD4，使得水样中细菌浓度为1012个细菌/毫升废水，溶解氧维持在4-6mg/L，温度为25-30℃，连续曝气30h，实验重复3次，结果如表1所示，COD去除率在92％，氨氮的去除率在99％，总氮去除率在78％。
表1.废水的生物脱氮结果
COD(mg/L) 氨氮(mg/L) 总氮(mg/L) 处理前 550 30 36 处理后 44±1.23 0.3±0.05 7.92±1.15 去除率 92％±0.22％ 99％±0.17％ 78％±3.19％
实施例2.生物脱氮实验
以实施例1提供的方法制备的菌株GAD4及其菌悬液进行生物脱氮实验。
一、以氨氮(NH4+-N)为氮源的生物脱氮实验
取5mL所制备的菌株GAD4菌悬液，加入三个含有95ml测试培养基的培养瓶中(每L培养基含1.52g NH4Cl，1.0g KH2PO4，0.06g FeSO4·7H2O，0.2gCaCl2·2H2O，1.0g MgSO4·7H2O，8.1g柠檬酸钠，pH为8.0)，用9层纱布封口，15℃，160rpm(旋转半径15mm)的摇床中振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。隔天取反应液，并在4000rpm下离心10min，取上清液测定各种含氮化合物的浓度。
结果如图4所示，菌株GAD4在氨氮初始浓度为400mg/L时，仍有较强的降解能力，异养硝化速率高。在接种的第一天内，氨氮的降解速率较快，去除率达到37.75％；之后三天内氨氮的浓度呈直线下降的趋势，最终96h内氨氮的去除率为80％，降解速率为3.14mgN/L·h。
二、以硝酸盐氮(NO3--N)为氮源的生物脱氮实验
取5mL按照实施例1的方法所制备的菌株GAD4的菌悬液，加入到三个含有95ml测试培养基的培养瓶中(每L培养基含2.89g KNO3，1.0g KH2PO4，0.06gFeSO4·7H2O，0.2g CaCl2·2H2O，1.0g MgSO4·7H2O，8.1g柠檬酸钠，pH为8.0，)，用9层纱布封口，15℃，160rpm(旋转半径25mm)的摇床中振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。隔天取反应液，并在4000rpm下离心10min，取上清液测定各种含氮化合物的浓度。
结果如图5所示，菌株GAD4在初始硝酸盐浓度为400mg/L时，96h内硝酸盐氮的去除率达到74.91％，降解速率为3.12mgN/L·h；总氮浓度从初始的400mg/L降低到115mg/L，去除率为71.25％。
降解过程中亚硝酸盐氮出现了少量的积累，在第三天达到峰值60.71mg/L。由此可以看出，好氧反硝化细菌同厌氧反硝化细菌的降解过程类似，都是经历硝酸盐氮转化为亚硝酸盐氮，亚硝酸盐氮进而转化为氮气两个过程。然而，好氧反硝化细菌的降解速率要高于厌氧反硝化细菌。
实施例3.生物脱氮实验
以实施例1提供的方法制备的菌株GAD4及其菌悬液进行生物脱氮实验。
一、以氨氮(NH4+-N)为氮源的生物脱氮实验
取5mL所制备的菌株GAD4菌悬液，加入4个含有95ml测试培养基的培养瓶中(每L培养基含0.42g NH4Cl，1.0g KH2PO4，0.06g FeSO4·7H2O，0.2gCaCl2·2H2O，1.0g MgSO4·7H2O，7.72g无水乙酸钠，pH为8.5)。用9层纱布封口，40℃，分别在转速为100rpm、150rpm和200rpm(旋转半径15mm)的摇床中振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。培养24h取摇瓶中反应液，并在4000rpm下离心10min，取上清液测定各种含氮化合物的浓度。
结果如图6所示，菌株GAD4在摇床转速为100rpm、150rpm和200rpm下对氨氮的去除率分别为64.45％、89.76％和84.88％；对总氮的去除率分别为61.62％、83.23％和75.09％。摇床转速的差异可以间接反应体系内的溶解氧水平，当摇床转速为100rpm时，体系内溶解氧水平较低，氨氮和总氮去除速率相对较低；当摇床转速为200rpm时，去除率稍低于转速为150rpm的情况，说明振荡速度过大和过低都不利于菌种的生长，菌株GAD4最适宜的摇床转速为150rpm。
二、以硝酸盐氮(NO3--N)为氮源的生物脱氮实验
取5mL所制备的菌株GAD4菌悬液，加入9个含有95ml测试培养基的培养瓶中(每L培养基含1.0g KNO3，1.0g KH2PO4，0.06g FeSO4·7H2O，0.2g CaCl2·2H2O，1.0g MgSO4·7H2O，7.72g无水乙酸钠)，初始pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0。用9层纱布封口，40℃，160rpm(旋转半径为15mm)的摇床中振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。培养24h取摇瓶中反应液，并在4000rpm下离心10min，取上清液测定各种含氮化合物的浓度。
结果如图7所示，菌株GAD4在中性偏碱性的条件下对硝酸盐氮有较好的降解效果，在酸性条件下去除效果不佳。当pH大于7时，24h内总氮的去除率在65％；当pH大于9时，脱氮效率没有急剧下降而是维持在一定的水平，说明菌株GAD4对碱性环境的适应性较强。因此，所述含氮液体的pH可为6-12，优选为7-11。这种特性使该菌株的实用性大大增强。
序列表
<110>北京大学
<120>用于生物脱氮的睾丸酮丛毛单胞菌菌株及其应用
<130>CGGNARL92320
<160>1
<210>1
<211>1462
<212>DNA
<213>睾丸酮丛毛单胞菌(Comamobas teststeroni)
<400>1
catgctttaa catgcaagtc gaacggtaac aggtcttcgg atgctgacga gtggcgaacg 60
ggtgagtaat acatcggaac gtgcctagta gtgggggata actactcgaa agagtagcta 120
ataccgcatg agatctacgg atgaaagcag gggacctttg ggccttgtgc tactagagcg 180
gctgatggca gattaggtag ttggtggggt aaaggcttac caagcctgcg atctgtagct 240
ggtctgagag gacgaccagc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg 300
cagcagtggg gaattttgga caatgggcga aagcctgatc cagcaatgcc gcgtgcagga 360
tgaaggccct cgggttgtaa actgcttttg tacggaacga aaagcctggg gctaatatcc 420
ccgggtcatg acggtaccgt aagaataagc accggctaac tacgtgccag cagccgcggt 480
aatacgtagg gtgcaagcgt taatcggaat tactgggcgt aaagcgtgcg caggcggttt 540
tgtaagacag tggtgaaatc cccgggctca acctgggaac tgccattgtg actgcaaggc 600
tagagtgcgg cagaggggga tggaattccg cgtgtagcag tgaaatgcgt agatatgcgg 660
aggaacaccg atggcgaagg caatcccctg ggcctgcact gacgctcatg cacgaaagcg 720
tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc ctaaacgatg tcaactggtt 780
gttgggtctt aactgactca gtaacgaagc taacgcgtga agttgaccgc ctggggagta 840
cggccgcaag gttgaaactc aaaggaattg acggggaccc gcacaagcgg tggatgatgt 900
ggtttaattc gatgcaacgc gaaaaacctt acccaccttt gacatggcag gaacttacca 960
gagatggttt ggtgctcgaa agagaacctg cacacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct 1020
cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgcca ttagttgcta 1080
cattcagttg agcactctaa tgggactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac 1140
gtcaagtcct catggccctt ataggtgggg ctacacacgt catacaatgg ctggtacaaa 1200
gggttgccaa cccgcgaggg ggagctaatc ccataaagcc agtcgtagtc cggatcgcag 1260
tctgcaactc gactgcgtga agtcggaatc gctagtaatc gtggatcaga atgtcacggt 1320
gaatacgttc ccgggtcttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagcgg gtctcgccag 1380
aagtaggtag cctaaccgca aggagggcgc ttaccacggc ggggttcgtg actggggtga 1440
agtcgtaaca agagccagac gg 1462
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中，所述百分含量如无特殊说明，均为质量百分含量。
实施例1.具有异养硝化-好氧反硝化性能的菌株GAD4的获得和生物脱氮实验
一、具有异养硝化-好氧反硝化性能的菌株GAD4的分离纯化方法
该方法有以下步骤：
1)从深圳布吉垃圾填埋场垃圾渗滤液组合处理系统中取出污泥样本；
2)接种到装有100mL富集培养液的500mL锥形瓶中：每L含0.95g NaNO3，0.7g蛋白胨，0.5g牛肉膏，0.15g尿素，0.04g NaCl，0.15g KH2PO4，0.02g KCl，0.03g MgSO4·7H2O，0.20g CaCl2·2H2O，其中培养液pH为7.0-7.5；
3)用纱布包好瓶口，于30℃，140rpm条件下摇床振荡培养4d；
4)以此摇瓶中的菌液为菌种源，取出10mL接种至新鲜的装有150mL富集培养液的锥形瓶中，培养条件相同，每隔4d转接一次；
5)转接4次后，对培养液进行10倍梯度稀释，稀释液均匀涂布在营养培养基上：每L含1.5g KNO3；1.0g KH2PO4；0.06g FeSO4·7H2O；0.2g CaCl2·2H2O；1.0gMgSO4·7H2O；8.5g琥珀酸钠；18g琼脂；其中培养基中pH为7.0，30℃恒温培养3d；
6)从菌落数为100左右的平板上挑选形状不同的菌落反复划线纯化，并进行显微镜观察直至获得单菌落作为初筛菌种；
7)对获得的初筛菌种进行性能测试；
8)由此分离出一株高效的具有异养硝化-好氧反硝化能力的细菌-菌株GAD4。
二、以氨氮(NH4+-N)为氮源的生物脱氮实验
以氨氮为氮源，琥珀酸钠为有机碳源，实施菌株GAD4对氨氮的去除能力测定。具体实施步骤如下：
将菌株GAD4接种于1L含0.5g KNO3和0.35g NH4Cl的LB培养基中(每升含NaCl 5g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g)，防止杂菌的侵入及保持菌体的生长活力，进行富集培养。将培养得到的菌液离心，用0.05％的NaCl水溶液洗涤三次，制成光密度OD600为1-2的菌悬液。
取10mL所制备的菌株GAD4菌悬液，加入三个含有90ml测试培养基的培养瓶中(每L培养基含0.29g NH4Cl，1.0g KH2PO4，0.06g FeSO4·7H2O，0.2gCaCl2·2H2O，1.0g MgSO4·7H2O，8.5g琥珀酸钠，pH 7.0-7.3)，用9层纱布封口，30℃，180rpm(回旋半径15mm)的摇床中振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。每隔2小时取反应液，其中一部分直接用于测定菌体光密度(OD600)，其余部分在4000rpm下离心10min，取上清液测定各种含氮化合物的浓度。
结果如图2所示，菌株GAD4对氨氮有较强的降解能力，异养硝化速率高。在反应期间的12h内，氨氮的去除率即达到90.85％。从菌株的生长曲线看，在最初的2h内菌株处于静止期，随后的2-8h菌株进入对数生长期，氨氮的降解非常迅速，其降解曲线几乎呈直线下降；此后，微生物生长进入内源呼吸期，菌体几乎没有出现增长。
同时，总氮(TN)的去除率也达到84.45％。大部分的氨氮通过异养硝化-好氧反硝化作用被去除，残留的氮素主要以硝酸盐氮的形式存在。
步骤二中菌株GAD4降解氨氮的途径是将氨氮转化为硝酸盐氮，然后硝酸盐氮还原为气体产物，与传统方法不同的是这两个过程由同一株菌株独立完成。
由此可以看出，以氨氮为氮源，菌株GAD4具有较强的异养硝化-好氧反硝化能力。
三、以硝酸盐氮(NO3--N)为氮源的生物脱氮实验
取10mL按照步骤二的方法所制备的菌株GAD4的菌悬液，加入到三个含有90ml测试培养基的培养瓶中(每L培养基含1.16g KNO3，1.0g KH2PO4，0.06gFeSO4·7H2O，0.2g CaCl2·2H2O，1.0g MgSO4·7H2O，8.5g琥珀酸钠，pH 7.0～7.3)，用9层纱布封口，30℃，180rpm(回旋半径15mm)的摇床中振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。每隔2小时取反应液，并在4000rpm下离心10min，取上清液测定各种含氮化合物的浓度。
结果如图3所示，菌株GAD4在好氧的条件下对硝酸盐氮有较强的去除能力，24h内实现了对硝酸盐氮64.05％的去除，去除速率为4.25mg氮/L·h(mgN/L·h)；总氮的去除率为63.28％，几乎没有出现亚硝酸盐氮(NO2--N)的积累。最初的4-6h内，硝酸盐氮的浓度基本保持不变，说明微生物处于静止期；此后微生物进入对数生长期，曲线呈直线下降。充分说明在好氧条件下菌株能够以硝酸盐氮和亚硝酸盐氮为电子受体进行反硝化作用，好氧反硝化的能力良好。
四、含氮废水的生物脱氮实验
在废水(废水水质如下：pH为7.5，氨氮含量30mg/L，硝酸盐氮含量6mg/L，COD 550mg/L)中加入菌株GAD4，使得水样中细菌浓度为1012个细菌/毫升废水，溶解氧维持在4-6mg/L，温度为25-30℃，连续曝气30h，实验重复3次，结果如表1所示，COD去除率在92％，氨氮的去除率在99％，总氮去除率在78％。
表1.废水的生物脱氮结果
COD(mg/L) 氨氮(mg/L) 总氮(mg/L) 处理前 550 30 36 处理后 44±1.23 0.3±0.05 7.92±1.15 去除率 92％±0.22％ 99％±0.17％ 78％±3.19％
实施例2.生物脱氮实验
以实施例1提供的方法制备的菌株GAD4及其菌悬液进行生物脱氮实验。
一、以氨氮(NH4+-N)为氮源的生物脱氮实验
取5mL所制备的菌株GAD4菌悬液，加入三个含有95ml测试培养基的培养瓶中(每L培养基含1.52g NH4Cl，1.0g KH2PO4，0.06g FeSO4·7H2O，0.2gCaCl2·2H2O，1.0g MgSO4·7H2O，8.1g柠檬酸钠，pH为8.0)，用9层纱布封口，15℃，160rpm(旋转半径15mm)的摇床中振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。隔天取反应液，并在4000rpm下离心10min，取上清液测定各种含氮化合物的浓度。
结果如图4所示，菌株GAD4在氨氮初始浓度为400mg/L时，仍有较强的降解能力，异养硝化速率高。在接种的第一天内，氨氮的降解速率较快，去除率达到37.75％；之后三天内氨氮的浓度呈直线下降的趋势，最终96h内氨氮的去除率为80％，降解速率为3.14mgN/L·h。
二、以硝酸盐氮(NO3--N)为氮源的生物脱氮实验
取5mL按照实施例1的方法所制备的菌株GAD4的菌悬液，加入到三个含有95ml测试培养基的培养瓶中(每L培养基含2.89g KNO3，1.0g KH2PO4，0.06gFeSO4·7H2O，0.2g CaCl2·2H2O，1.0g MgSO4·7H2O，8.1g柠檬酸钠，pH为8.0，)，用9层纱布封口，15℃，160rpm(旋转半径25mm)的摇床中振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。隔天取反应液，并在4000rpm下离心10min，取上清液测定各种含氮化合物的浓度。
结果如图5所示，菌株GAD4在初始硝酸盐浓度为400mg/L时，96h内硝酸盐氮的去除率达到74.91％，降解速率为3.12mgN/L·h；总氮浓度从初始的400mg/L降低到115mg/L，去除率为71.25％。
降解过程中亚硝酸盐氮出现了少量的积累，在第三天达到峰值60.71mg/L。由此可以看出，好氧反硝化细菌同厌氧反硝化细菌的降解过程类似，都是经历硝酸盐氮转化为亚硝酸盐氮，亚硝酸盐氮进而转化为氮气两个过程。然而，好氧反硝化细菌的降解速率要高于厌氧反硝化细菌。
实施例3.生物脱氮实验
以实施例1提供的方法制备的菌株GAD4及其菌悬液进行生物脱氮实验。
一、以氨氮(NH4+-N)为氮源的生物脱氮实验
取5mL所制备的菌株GAD4菌悬液，加入4个含有95ml测试培养基的培养瓶中(每L培养基含0.42g NH4Cl，1.0g KH2PO4，0.06g FeSO4·7H2O，0.2gCaCl2·2H2O，1.0g MgSO4·7H2O，7.72g无水乙酸钠，pH为8.5)。用9层纱布封口，40℃，分别在转速为100rpm、150rpm和200rpm(旋转半径15mm)的摇床中振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。培养24h取摇瓶中反应液，并在4000rpm下离心10min，取上清液测定各种含氮化合物的浓度。
结果如图6所示，菌株GAD4在摇床转速为100rpm、150rpm和200rpm下对氨氮的去除率分别为64.45％、89.76％和84.88％；对总氮的去除率分别为61.62％、83.23％和75.09％。摇床转速的差异可以间接反应体系内的溶解氧水平，当摇床转速为100rpm时，体系内溶解氧水平较低，氨氮和总氮去除速率相对较低；当摇床转速为200rpm时，去除率稍低于转速为150rpm的情况，说明振荡速度过大和过低都不利于菌种的生长，菌株GAD4最适宜的摇床转速为150rpm。
二、以硝酸盐氮(NO3--N)为氮源的生物脱氮实验
取5mL所制备的菌株GAD4菌悬液，加入9个含有95ml测试培养基的培养瓶中(每L培养基含1.0g KNO3，1.0g KH2PO4，0.06g FeSO4·7H2O，0.2g CaCl2·2H2O，1.0g MgSO4·7H2O，7.72g无水乙酸钠)，初始pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0。用9层纱布封口，40℃，160rpm(旋转半径为15mm)的摇床中振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。培养24h取摇瓶中反应液，并在4000rpm下离心10min，取上清液测定各种含氮化合物的浓度。
结果如图7所示，菌株GAD4在中性偏碱性的条件下对硝酸盐氮有较好的降解效果，在酸性条件下去除效果不佳。当pH大于7时，24h内总氮的去除率在65％；当pH大于9时，脱氮效率没有急剧下降而是维持在一定的水平，说明菌株GAD4对碱性环境的适应性较强。因此，所述含氮液体的pH可为6-12，优选为7-11。这种特性使该菌株的实用性大大增强。
序列表
<110>北京大学
<120>用于生物脱氮的睾丸酮丛毛单胞菌菌株及其应用
<130>CGGNARL92320
<160>1
<210>1
<211>1462
<212>DNA
<213>睾丸酮丛毛单胞菌(Comamobas teststeroni)
<400>1
catgctttaa catgcaagtc gaacggtaac aggtcttcgg atgctgacga gtggcgaacg 60
ggtgagtaat acatcggaac gtgcctagta gtgggggata actactcgaa agagtagcta 120
ataccgcatg agatctacgg atgaaagcag gggacctttg ggccttgtgc tactagagcg 180
gctgatggca gattaggtag ttggtggggt aaaggcttac caagcctgcg atctgtagct 240
ggtctgagag gacgaccagc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg 300
cagcagtggg gaattttgga caatgggcga aagcctgatc cagcaatgcc gcgtgcagga 360
tgaaggccct cgggttgtaa actgcttttg tacggaacga aaagcctggg gctaatatcc 420
ccgggtcatg acggtaccgt aagaataagc accggctaac tacgtgccag cagccgcggt 480
aatacgtagg gtgcaagcgt taatcggaat tactgggcgt aaagcgtgcg caggcggttt 540
tgtaagacag tggtgaaatc cccgggctca acctgggaac tgccattgtg actgcaaggc 600
tagagtgcgg cagaggggga tggaattccg cgtgtagcag tgaaatgcgt agatatgcgg 660
aggaacaccg atggcgaagg caatcccctg ggcctgcact gacgctcatg cacgaaagcg 720
tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc ctaaacgatg tcaactggtt 780
gttgggtctt aactgactca gtaacgaagc taacgcgtga agttgaccgc ctggggagta 840
cggccgcaag gttgaaactc aaaggaattg acggggaccc gcacaagcgg tggatgatgt 900
ggtttaattc gatgcaacgc gaaaaacctt acccaccttt gacatggcag gaacttacca 960
gagatggttt ggtgctcgaa agagaacctg cacacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct 1020
cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgcca ttagttgcta 1080
cattcagttg agcactctaa tgggactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac 1140
gtcaagtcct catggccctt ataggtgggg ctacacacgt catacaatgg ctggtacaaa 1200
gggttgccaa cccgcgaggg ggagctaatc ccataaagcc agtcgtagtc cggatcgcag 1260
tctgcaactc gactgcgtga agtcggaatc gctagtaatc gtggatcaga atgtcacggt 1320
gaatacgttc ccgggtcttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagcgg gtctcgccag 1380
aagtaggtag cctaaccgca aggagggcgc ttaccacggc ggggttcgtg actggggtga 1440
agtcgtaaca agagccagac gg 1462