一种生产肠二醇和肠内酯的方法

摘要

本发明的目的是提供一种生产肠二醇和/或肠内酯的方法。本发明提供的生产肠二醇和/或肠内酯的方法，是以亚麻子粕、海藻、芝麻子粕、油菜籽粕、黑麦麸、小麦麸、大麦麸、玉米麸、燕麦麸和牛蒡子粕十种原料中的至少一种为底物，用肠道细菌进行厌氧培养，得到肠二醇和/或肠内酯。本发明利用价格低廉的植物资源和哺乳动物肠道菌群，采用生物技术直接转化肠二醇和肠内酯，培养液经简单的纯化工艺即可使提取物中肠二醇和肠内酯的含量大于50％(70.15％-91.12％)。本发明提供的方法简单、生产成本很低、无环境污染，非常适宜于工业化生产，具有重要的科学价值、社会及经济效益。

权利要求

1.一种生产肠二醇和/或肠内酯的方法，是以下述十种原料中的至少一种为底物，用肠道细菌进行厌氧培养，得到肠二醇和/或肠内酯；所述十种原料为亚麻子粕、海藻、芝麻子粕、油菜籽粕、黑麦麸、小麦麸、大麦麸、玉米麸、燕麦麸和牛蒡子粕；

所述厌氧培养的条件为：氧分压3.03975-10.1325kPa，25-40℃厌氧培养3-15天；

所述方法中，底物加入按照如下方法配制的培养基中：每升pH6.5-pH7.5的磷酸缓冲液中加入1.5-6g NaCl、0.5-6g NH4Cl、0.1-2.0g L-半胱氨酸盐酸盐或硫代乙醇酸钠。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述肠道细菌来自用哺乳动物粪便或肠液制备的菌液。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述哺乳动物为人、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或兔。

4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述菌液是将粪便或肠液用水、磷酸缓冲液或0.9％生理盐水进行悬浮得到的。

5.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于：在厌氧培养前先将所述菌液利用厌氧培养基进行增菌，增菌条件为：25-40℃厌氧培养10-36小时。

6.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述菌液包括传代培养后的菌液。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法中，底物加入按照如下方法配制的培养基中：每升pH 7.5的磷酸缓冲液中加入3g NaCl、1g NH4Cl、0.3g L-半胱氨酸盐酸盐或硫代乙醇酸钠。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述底物的加入量为每升培养基中加入

1-60g底物。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：厌氧培养3-8天后，用大孔树脂色谱柱进行分离纯化，采用乙醇水溶液进行梯度洗脱，从5％乙醇水溶液开始，递增洗脱液中乙醇浓度，收集含有肠二醇的洗脱液，减压浓缩干燥，得到肠二醇。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述大孔树脂为XAD-2大孔树脂或D101大孔树脂。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于：厌氧培养4-15天后，用大孔树脂色谱柱进行分离纯化，采用乙醇水溶液进行梯度洗脱，从5％乙醇水溶液开始，递增洗脱液中乙醇浓度，收集含有肠内酯的洗脱液，减压浓缩干燥，得到肠内酯。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于：所述大孔树脂为XAD-2大孔树脂或D101大孔树脂。

说明书

一种生产肠二醇和肠内酯的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种生产肠二醇和肠内酯的方法。

背景技术

[0002] 肠二醇(Enterodiol，END)和肠内酯(Enterolactone，ENL)具有雌激素和抗雌激素样生物活性，可防治乳腺癌和前列腺癌，为国际公认的植物雌激素，已被美国国立癌症研究所确定为潜在的抗癌物质。目前获得肠二醇和肠内酯的主要途径为化学合成方法，但化学合成法成本较高，且对环境造成污染。

[0003] 人体肠道菌群在严格厌氧条件下可将裂环异裂叶松脂酚二葡萄糖苷(Secoisolariciresinol diglucoside，SDG)、裂环异裂叶松脂酚(Secoisolariciresinol，SECO)、罗汉松脂素(Matairesinol，MATA)、丁香脂素(Syringaresinol，SYRI)、松脂素(Pinoresinol，PINO)或松脂酚二葡萄糖苷(Pinoresinoldiglucoside，PDG)等底物转化为肠二醇和肠内酯，由于受到苛刻厌氧条件和底物来源的限制，目前还无法利用此方法大规模生产肠二醇和肠内酯。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种生产肠二醇和/或肠内酯的方法。

[0005] 本发明提供的生产肠二醇和/或肠内酯的方法，是以下述十种原料中的至少一种为底物，用肠道细菌进行厌氧培养，得到肠二醇和/或肠内酯；所述十种原料为亚麻子粕(Flaxseed；Semen lini)、海藻(Seaweed)、芝麻子粕(Sesame seed)、油菜籽粕(Rapeseed)、黑麦麸(Rye bran)、小麦麸(Wheat bran)、大麦麸(Barley bran)、玉米麸(Corn bran)、燕麦麸(Oat bran)和牛蒡子粕(Fructus arctii)。

[0006] 所述厌氧培养的条件可为：氧分压3.03975-10.1325kPa，25-40℃厌氧培养3-15天。

[0007] 所述肠道细菌可来自用哺乳动物粪便或肠液制备的菌液。

[0008] 所述哺乳动物具体可为人、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或兔。

[0009] 所述菌液可将粪便或肠液用水、磷酸缓冲液或0.9％生理盐水进行悬浮得到。

[0010] 在厌氧培养前先可将所述菌液进行增菌，增菌条件可为：25-40℃厌氧培养10-36小时。

[0011] 所述菌液可为传代培养后的菌液，第1-50代菌液均可使用。

[0012] 所述方法中，所述底物加入厌氧培养基或按照如下方法配制的培养基中：每升pH6.5-pH7.5的磷酸缓冲液中加入1.5-6g NaCl、0.5-6g NH4Cl、0.1-2.0g L-半胱氨酸盐酸盐或硫代乙醇酸钠；优选按照如下方法配制：每升pH 7.5的磷酸缓冲液中加入3gNaCl、1g NH4Cl、0.3g L-半胱氨酸盐酸盐或硫代乙醇酸钠。

[0013] 所述底物的加入量可为每升培养基中加入1-60g底物。

[0014] 厌氧培养3-8天后，用大孔树脂色谱柱进行分离纯化，采用乙醇水溶液进行梯度洗脱，从5％乙醇水溶液开始，递增洗脱液中乙醇浓度，收集含有肠二醇的洗脱液，减压浓缩干燥，得到肠二醇；所述大孔树脂优选XAD-2大孔树脂或D101大孔树脂。

[0015] 厌氧培养4-15天后，用大孔树脂色谱柱进行分离纯化，采用乙醇水溶液进行梯度洗脱，从5％乙醇水溶液开始，递增洗脱液中乙醇浓度，收集含有肠内酯的洗脱液，减压浓缩干燥，得到肠内酯；所述大孔树脂优选XAD-2大孔树脂或D101大孔树脂。

[0016] 本发明提供的生产肠二醇和/或肠内酯的方法，是以亚麻子粕、海藻、芝麻子粕、油菜籽粕、黑麦麸、小麦麸、大麦麸、玉米麸、燕麦麸和牛蒡子粕十种原料中的至少一种为底物，用肠道细菌进行厌氧培养，得到肠二醇和/或肠内酯。本发明利用价格低廉的植物资源和哺乳动物肠道菌群，采用生物技术直接转化肠二醇和肠内酯，培养液经简单的纯化工艺即可使提取物中肠二醇和肠内酯的含量大于50％(70.15％-91.12％)。本发明提供的方法简单、生产成本很低、无环境污染，非常适宜于工业化生产，具有重要的科学价值、社会及经济效益。

[0017] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

附图说明

[0018] 图1为亚麻子粕经人体样本1的菌液厌氧培养第3天培养液的HPLC图。

[0019] 图2为亚麻子粕经人体样本1的菌液厌氧培养第7天培养液的HPLC图。

[0020] 图3为亚麻子粕经人体样本1-24的菌液厌氧培养第3天培养液中肠二醇的HPLC峰面积变化曲线。

[0021] 图4为亚麻子粕经人体样本1-24的菌液厌氧培养第7天培养液中肠内酯的HPLC峰面积变化曲线。

[0022] 图5为亚麻子粕经人体样本1的第50代菌厌氧培养6天的培养液再经XAD-2树脂洗脱的洗脱物的HPLC图。

[0023] 图6为图5中肠二醇色谱峰的UV光谱图。

[0024] 图7为亚麻子粕经人体样本1的第50代菌厌氧培养10天的培养液再经D101树脂洗脱的洗脱物的HPLC图。

[0025] 图8为图7中肠内酯色谱峰的UV光谱图。

具体实施方式

[0026] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

[0027] 以下实施例中所用的样本来源情况见表1。

[0028] 表1 24份人体样本的性别和年龄

[0029]

[0030] 实施例1、不同人体个体来源的肠道菌对亚麻子粕的生物转化

[0031] 1、厌氧培养基

[0032] 厌氧培养基(CM605，购自北京路桥技术有限责任公司)，其成分如下：

[0033] 牛肉浸液(1000mL)；蛋白胨(30g)；酵母膏(5g)；磷酸二氢钠(5g)；

[0034] 葡萄糖(3g)；可溶性淀粉(2g)。

[0035] 按试剂说明配制，碎肉渣5-30g/升，121℃高压灭菌15min。

[0036] 2、生物转化

[0037] 1)取24个健康人(见表1)的新鲜粪便，分别加入到磷酸缓冲液(pH 7.4)中，得到24种终浓度为4g粪便/20mL磷酸缓冲液的菌液。

[0038] 2)分别按1∶10的比例将步骤1得到的24种菌液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.03975kPa)36小时，进行增菌。

[0039] 3)分别在上述24种增菌后的菌液中加入亚麻子粕(即脱脂后的亚麻子，加入量为：4mg/4mL培养液)，37℃厌氧培养(氧分压为3.03975kPa)8天，得到24种培养液。

[0040] 3、样品分析

[0041] 培养过程中，每天都分别对24种培养液进行检测，方法如下：

[0042] 吸取0.2ml培养液，加入0.5ml水饱和正丁醇萃取，取正丁醇层，氮气吹干后0.2ml甲醇溶解，微孔滤膜过滤，吸取20μl滤液进行HPLC分析。

[0043] HPLC仪器为Agilent 1200HPLC仪(Agilent Technologies，USA)，包括二元高压梯度泵、二极管阵列检测器、自动进样器、柱温箱和工作站软件。色谱柱为Agilent ZorbaxSB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为水/乙腈(100∶0-50∶50)；线性梯度洗脱(0-30min)；流速为1.0mL/min；检测波长为280nm；柱温为25℃。

[0044] 图1为亚麻子粕经人体样本1的菌液厌氧培养第3天培养液的HPLC图。图2为亚麻子粕经人体样本1的菌液厌氧培养第7天培养液的HPLC图。其它人体样本培养液的HPLC图与样本1基本相同。

[0045] 图3为亚麻子粕经人体样本1-24的菌液厌氧培养第3天培养液中肠二醇的HPLC峰面积变化曲线。图4为亚麻子粕经人体样本1-24的菌液厌氧培养第7天培养液中肠内酯的HPLC峰面积变化曲线。由图可见，24份培养液中均能先后检测到肠二醇和肠内酯，不同性别和年龄的人体样本来源的菌液转化产生肠二醇和肠内酯的能力没有明显区别。

[0046] 实施例2、来自人体肠道菌液对亚麻子粕的转化

[0047] 1、配制培养基

[0048] 1)厌氧培养基

[0049] GAM肉汤培养基(Nissui Co.，Tokyo，Japan)，其成分如下：

[0050] 大豆胨3克；口胨10克；消化血清粉13.5克；酵母浸膏5克；牛肉膏2.2克；牛肝膏(粉)1.2克；葡萄糖3克；KH2PO4 2.5克；可溶性淀粉5克；L-半胱氨酸盐0.3克；硫乙醇酸钠0.3克；肉汤(牛心汤)1000毫升。按试剂说明配制。调PH7.2-7.4，10磅高压灭菌15分。

[0051] 2)配制无碳源培养基

[0052] 按照如下方法配制：每升磷酸缓冲液(pH 7.5)中加入3g NaCl、1.0g NH4Cl、0.3g L-半胱氨酸盐酸盐；用石蜡油覆盖，121℃高压灭菌15min。

[0053] 2、生物转化

[0054] 1)制备样本9的菌液(终浓度为4g粪便/20ml磷酸缓冲液)，制备方法同实施例1的步骤2的1)，得到样本9的菌液。

[0055] 2)按1∶10的比例将样本9的菌液接种至厌氧培养基，25℃厌氧培养(氧分压为7.03975kPa)10小时，进行增菌。

[0056] 3)按1∶10的比例将增菌后的菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻子粕(0.24g/4mL)，25℃厌氧培养(氧分压为7.03975kPa)7天，得到样本9的培养液。

[0057] 3、样品分析

[0058] 同实施例1的步骤3。

[0059] 不同时间培养液中肠二醇和肠内酯的HPLC峰面积见表2。

[0060] 表2不同时间培养液中肠二醇和肠内酯的HPLC峰面积

[0061]

[0062] 由表2可见：该培养体系对亚麻子粕的转化效果较好。培养4天的培养液中肠二醇的HPLC峰面积最大，培养6天的培养液中肠内酯的HPLC峰面积最大。

[0063] 实施例3、人体肠道菌种的传代次数对生物转化效果的影响

[0064] 1、配制培养基

[0065] 1)配制厌氧培养基

[0066] 同实施例1的步骤1。

[0067] 2)配制无碳源培养基

[0068] 按照如下方法配制：每升磷酸缓冲液(pH 7.0)中加入1.5g NaCl、0.5g NH4Cl、0.1g硫代乙醇酸钠；用石蜡油覆盖，121℃高压灭菌15min。

[0069] 2、菌种传代

[0070] 1)制备人体样本9的菌液(终浓度为4g粪便/20ml磷酸缓冲液)，制备方法同实施例1的步骤2的1)，得到样本9的菌液。

[0071] 2)按1∶10的比例将样本9的菌液接种至厌氧培养基，40℃厌氧培养(氧分压为7.03975kPa)24小时，进行增菌。

[0072] 3)按1∶10的比例将增菌后的菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻籽粉(80mg/4mL)，40℃厌氧培养(氧分压为9.03975kPa)6天，得到样本9的培养液(原代培养液)。

[0073] 4)每6天进行一次传代(重复步骤2)和3))，共传代50次，得到样本9的1代至50代培养液(传代培养液)。

[0074] 3、样品分析

[0075] 同实施例1的步骤3。

[0076] 监测1-50代传代培养液在培养过程中肠二醇和肠内酯的HPLC峰面积动态变化。

[0077] 可以发现，在1-50代传代培养液中均能先后检测到肠二醇和肠内酯，不同代传代培养液转化产生肠二醇和肠内酯的能力没有明显区别(见表3)。

[0078] 表3不同时间点的第1代和第50代培养液中肠二醇和肠内酯的HPLC峰面积

[0079] 实施例4、来自人体肠道菌液对不同底物的转化作用

[0080] 1、配制培养基

[0081] 1)配制厌氧培养基

[0082] 同实施例1的步骤1。

[0083] 2)配制无碳源培养基

[0084] 按照如下方法配制：每升磷酸缓冲液(pH 7.5)中加入3g NaCl、1.0g NH4Cl、0.3g L-半胱氨酸盐酸盐；用石蜡油覆盖，121℃高压灭菌15min。

[0085] 2、生物转化

[0086] 1)制备样本9的菌液(终浓度为4g粪便/20ml磷酸缓冲液)，制备方法同实施例1的步骤2的1)，得到样本9的菌液。

[0087] 2)按1∶10的比例将样本9的菌液接种至厌氧培养基，25℃厌氧培养(氧分压为7.03975kPa)10小时，进行增菌。

[0088] 3)按1∶10的比例将增菌后的菌液接种到上述无碳源培养基中，分别加入下列底物：海藻、芝麻子粕、油菜籽粕、黑麦麸、小麦麸、大麦麸、玉米麸、燕麦麸和牛蒡子(0.24g/4mL)，25℃厌氧培养(氧分压为7.03975kPa)10天。

[0089] 3、样品分析

[0090] 同实施例1的步骤3。

[0091] 第3天培养液和第10天培养液中肠二醇和肠内酯的HPLC峰面积见表4。

[0092] 表4不同时间点不同底物培养液中肠二醇和肠内酯的HPLC峰面积[0093]

[0094] 由表4可见：人体肠道菌对不同底物均有类似于亚麻子粕的转化作用。培养3天的培养液中产物以肠二醇为主，培养10天的培养液中产物以肠内酯为主。

[0095] 实施例5、不同动物来源的肠道菌对亚麻子粕的生物转化

[0096] 1、配制厌氧培养基

[0097] 同实施例2的步骤1。

[0098] 2、生物转化

[0099] 1)取小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠和家兔的新鲜粪便及新鲜肠液。粪便分别加入到磷酸缓冲液(pH 7.4)中，得到24种终浓度为4g粪便/20mL磷酸缓冲液的菌液。肠液分别用10倍量的磷酸缓冲液(pH 7.4)稀释得到菌液。共得到10种供试菌液。

[0100] 2)分别按1∶10的比例将步骤1得到的10种菌液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.03975kPa)36小时，进行增菌。

[0101] 3)分别在上述10种增菌后的菌液中加入亚麻子粕(4mg/4mL培养液)，37℃厌氧培养(氧分压为3.03975kPa)15天。

[0102] 3、样品分析

[0103] 同实施例1的步骤3。

[0104] 表5为亚麻子粕经上述10种菌液厌氧培养第4天和第15天培养液中肠二醇的HPLC峰面积变化。由表5可见，上述10份菌液中均能转化亚麻子粕而产生肠二醇和肠内酯。

[0105] 表5不同时间点不同菌液的培养液中肠二醇和肠内酯的HPLC峰面积[0106]

[0107] 实施例6、利用人体肠道菌制备肠二醇

[0108] 一、肠二醇标准曲线的建立

[0109] 精确称取肠二醇标准品(购自Sigma公司)1.98mg定容于1.0ml容量瓶中。分别进样0.1-30μL，HPLC测定其峰面积，以肠二醇进样量(μg)为横坐标(X)，肠二醇峰面积2
为纵坐标(Y)进行线性回归，得肠二醇的标准曲线为Y＝391.99X+298.16，R ＝0.9984，线性范围为：0.20μg-59.40μg。

[0110] 二、以亚麻子粕为底物转化生产肠二醇

[0111] 1、配制培养基

[0112] 1)配制厌氧培养基

[0113] 同实施例2的步骤1。

[0114] 2)配制无碳源培养基

[0115] 按照如下方法配制：每升磷酸缓冲液(pH 6.5)中加入6g NaCl、6g NH4Cl、2.0g硫代乙醇酸钠。用石蜡油覆盖，121℃高压灭菌15min。

[0116] 2、生物转化

[0117] 1)制备样本1-13的菌液(终浓度为4g粪便/20mL磷酸缓冲液)，制备方法同实施例1的步骤2的1)，得到13种菌液。

[0118] 2)按1∶10的比例将13种菌液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.1325kPa)36小时，进行增菌。

[0119] 3)按1∶10的比例将增菌后的13种菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻子粕(0.12g/4mL)，37℃厌氧培养(氧分压为10.1325kPa)6天，得到13种培养液(原代培养液)。

[0120] 4)每6天进行一次传代(重复步骤2)和3))，共传代50次，得到样本1-13的第50代培养液(传代培养液)。

[0121] 3、肠二醇的制备

[0122] 1)按1∶10的比例分别将13种菌液的第50代培养液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.1325kPa)36小时，进行增菌。

[0123] 3)按1∶10的比例将增菌后的13种菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻子粕(75g/2.5L)，37℃厌氧培养(氧分压为10.1325kPa)8天。

[0124] 4、样品分析

[0125] 分析方法同实施例1的步骤3。

[0126] 通过HPLC图谱结果对照标准曲线计算出培养液中肠二醇的含量，用肠二醇的产量除以底物的量，得到肠二醇的产率，见表6。

[0127] 5、肠二醇的提取与纯化

[0128] 用95％乙醇调节培养液中乙醇的浓度至30％，过滤得滤液。滤液经XAD-2大孔树脂柱分离，用5％-50％乙醇(乙醇浓度梯度按5％比例递增)洗脱。将洗脱液进行HPLC分析，方法同实施例1的步骤3。

[0129] 肠二醇主要存在于30％-50％乙醇洗脱液中(见图5和图6)。将30％-50％乙醇洗脱液蒸干，得到的物质的量即为洗脱物的量，通过HPLC分析对照标准曲线计算出洗脱物中肠二醇的量。洗脱物的量和洗脱物中肠二醇的含量见表6。

[0130] 表6人体肠道菌培养液中肠二醇产率、洗脱物量和洗脱物中肠二醇含量[0131]样品编号 底物量(g) END产率(％) 洗脱物量(g) 洗脱物中END含量(％)
1 50 0.36 0.11 90.64
2 50 0.39 0.18 82.09
3 50 0.45 0.22 84.19
4 50 0.36 0.17 88.80
5 50 0.30 0.27 91.12
6 50 0.33 0.30 79.28
7 50 0.55 0.19 78.36
8 50 0.43 0.21 86.43
9 50 0.31 0.16 86.81
10 50 0.29 0.21 85.37
11 50 0.41 0.17 90.08
12 50 0.34 0.25 76.64
13 50 0.25 0.27 74.87

[0132] 由表6可见，培养液洗脱物中肠二醇的含量范围为：74.87％-91.12％。

[0133] 实施例7、利用人体肠道菌制备肠内酯

[0134] 一、肠内酯标准曲线的建立

[0135] 精确称取肠内酯标准品(购自Sigma公司)2.01mg定容于1.0ml容量瓶中。分别进样0.1-30μL，HPLC测定其峰面积，以肠内酯进样量(μg)为横坐标(X)，肠内酯峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，得肠内酯的标准曲线为Y＝395.39X+156.15，R2＝0.9976，线性范围为：0.20μg-60.30μg。

[0136] 二、以亚麻子粕为底物转化生产肠内酯

[0137] 1、配制培养基

[0138] 1)配制厌氧培养基

[0139] 同实施例1的步骤1。

[0140] 2)配制无碳源培养基

[0141] 按照如下方法配制：每升磷酸缓冲液(pH 7.0)中加入4g NaCl、0.5g NH4Cl、0.5g硫代乙醇酸钠。用石蜡油覆盖，121℃高压灭菌15min。

[0142] 2、生物转化

[0143] 2、生物转化

[0144] 1)制备样本1-13的菌液(终浓度为4g粪便/20mL磷酸缓冲液)，制备方法同实施例1的步骤2的1)，得到13种菌液。

[0145] 2)按1∶10的比例将13种菌液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.1325kPa)36小时，进行增菌。

[0146] 3)按1∶10的比例将增菌后的13种菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻子粕(0.24g/4mL)，37℃厌氧培养(氧分压为10.1325kPa)8天，得到13种培养液(原代培养液)。

[0147] 4)每8天进行一次传代(重复步骤2)和3))，共传代50次，得到样本1-13的第50代培养液(传代培养液)。

[0148] 3、肠内酯的制备

[0149] 1)按1∶10的比例分别将13种菌液的第50代培养液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.1325kPa)36小时，进行增菌。

[0150] 2)按1∶10的比例将增菌后的13种菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻子粕(150g/2.5L)，37℃厌氧培养(氧分压为10.1325kPa)15天。

[0151] 4、样品分析

[0152] 分析方法同实施例1的步骤3。

[0153] 通过HPLC图谱结果对照标准曲线可以计算出培养液中肠内酯的含量，用肠内酯的产量除以底物亚麻子粕的量，得到肠内酯的产率，见表7。

[0154] 5、肠内酯提取与纯化

[0155] 用95％乙醇调节培养液中乙醇的浓度至30％，过滤得滤液。滤液经D101大孔树脂柱分离，用5％-50％乙醇(乙醇浓度梯度按5％比例递增)洗脱。将洗脱液进行HPLC分析，方法同实施例1的步骤3。

[0156] 肠内酯主要存在于20％-40％乙醇洗脱液中(见图7和图8)。将20％-40％乙醇洗脱液蒸干，得到的物质的量即为洗脱物的量，通过HPLC分析结果对照标准曲线可以算出洗脱物中肠内酯的量。洗脱物的量和洗脱物中肠内酯的含量见表7。

[0157] 表7人体肠道菌培养液中肠内酯产率、洗脱物量和洗脱物中肠内酯含量[0158]样品编号底物量(g) ENL产率(％) 洗脱物量(g) 洗脱物中ENL含量(％)
1 50 0.30 0.25 84.29
2 50 0.33 0.21 75.31
3 50 0.36 0.24 79.66
4 50 0.29 0.27 82.41
5 50 0.24 0.30 85.37
6 50 0.27 0.30 74.91
7 50 0.47 0.26 73.54
8 50 0.32 0.21 81.62
9 50 0.26 0.19 81.73
10 50 0.22 0.23 70.67
11 50 0.35 0.19 85.19
12 50 0.21 0.23 71.62
13 50 0.19 0.26 69.83

[0159] 由表7可见，洗脱物中肠内酯的含量范围为：69.83％-85.37％。

[0160] 实施例8、利用小鼠粪便制备的菌液生产肠二醇和肠内酯

[0161] 一、标准曲线的建立

[0162] 1、肠二醇标准曲线的建立

[0163] 同实施例6的步骤一。

[0164] 2、肠内酯标准曲线的建立

[0165] 同实施例7的步骤一。

[0166] 二、以亚麻子粕为底物转化生产肠二醇和肠内酯

[0167] 1、配制培养基

[0168] 1)配制厌氧培养基

[0169] 同实施例2的步骤1。

[0170] 2)配制无碳源培养基

[0171] 按照如下方法配制：每升磷酸缓冲液(pH 6.5)中加入6g NaCl、6g NH4Cl、2.0g硫代乙醇酸钠。用石蜡油覆盖，121℃高压灭菌15min。

[0172] 2、菌液传代

[0173] 1)制备小鼠粪便的菌液(终浓度为4g粪便/20ml磷酸缓冲液)。

[0174] 2)按1∶10的比例将菌液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.1325kPa)36小时，进行增菌。

[0175] 3)按1∶10的比例将增菌后的菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻子粕(0.12g/4mL)，37℃厌氧培养(氧分压为10.1325kPa)6天，得到培养液(原代培养液)。

[0176] 4)每6天进行一次传代(重复步骤2)和3))，共传代50次，得到样本的第50代培养液(传代培养液)。

[0177] 3、肠二醇的制备和分析

[0178] 1)肠二醇的制备

[0179] ①按1∶10的比例分别将第50代培养液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.1325kPa)36小时，进行增菌。

[0180] ②按1∶10的比例将增菌后的菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻子粕(75g/2.5L)，37℃厌氧培养(氧分压为10.1325kPa)6天。

[0181] 2)样品分析

[0182] 分析方法同实施例1的步骤3。

[0183] 通过HPLC图谱结果对照标准曲线计算出培养液中肠二醇的含量，用肠二醇的产量除以底物的量，得到肠二醇的产率，见表8。

[0184] 3)肠二醇的提取与纯化

[0185] 方法同实施例6的步骤5。通过HPLC分析对照标准曲线计算出洗脱物中肠二醇的量。洗脱物的量和洗脱物中肠二醇的含量见表8。

[0186] 4、肠内酯的制备和分析

[0187] 1)肠内酯的制备

[0188] ①按1∶10的比例分别将第50代培养液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.1325kPa)36小时，进行增菌。

[0189] ②按1∶10的比例将增菌后的菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻子粕(150g/2.5L)，37℃厌氧培养(氧分压为10.1325kPa)15天。

[0190] 2)样品分析

[0191] 分析方法同实施例1的步骤3。

[0192] 通过HPLC图谱结果对照标准曲线可以计算出培养液中肠内酯的含量，用肠内酯的产量除以底物的量，得到肠内酯的产率，见表9。

[0193] 3)肠内酯提取与纯化

[0194] 方法同实施例7的步骤5。通过HPLC分析结果对照标准曲线可以算出洗脱物中肠内酯的量。洗脱物的量和洗脱物中肠内酯的含量见表9。

[0195] 实施例9、利用小鼠肠液制备的菌液生产肠二醇和肠内酯

[0196] 一、标准曲线的建立

[0197] 1、肠二醇标准曲线的建立

[0198] 同实施例6的步骤一。

[0199] 2、肠内酯标准曲线的建立

[0200] 同实施例7的步骤一。

[0201] 二、以亚麻子粕为底物转化生产肠二醇

[0202] 1、配制培养基

[0203] 1)配制厌氧培养基

[0204] 同实施例1的步骤1。

[0205] 2)配制无碳源培养基

[0206] 按照如下方法配制：每升磷酸缓冲液(pH 6.5)中加入6g NaCl、6g NH4Cl、2.0g硫代乙醇酸钠。用石蜡油覆盖，121℃高压灭菌15min。

[0207] 2、菌液制备及传代

[0208] 1)在厌氧环境条件下处死小鼠，取出肠液，用10倍量磷酸缓冲液稀释得到菌液。

[0209] 2)按1∶10的比例将菌液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.1325kPa)36小时，进行增菌。

[0210] 3)按1∶10的比例将增菌后的菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻子粕(0.12g/4mL)，37℃厌氧培养(氧分压为10.1325kPa)6天，得到培养液(原代培养液)。

[0211] 4)每6天进行一次传代(重复步骤2)和3))，共传代50次，得到样本的第50代培养液(传代培养液)。

[0212] 3、肠二醇的制备和分析

[0213] 1)肠二醇的制备

[0214] ①按1∶10的比例分别将第50代培养液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.1325kPa)36小时，进行增菌。

[0215] ②按1∶10的比例将增菌后的菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻子粕(75g/2.5L)，37℃厌氧培养(氧分压为10.1325kPa)3天。

[0216] 2)样品分析

[0217] 分析方法同实施例1的步骤3。

[0218] 通过HPLC图谱结果对照标准曲线计算出培养液中肠二醇的含量，用肠二醇的产量除以底物的量，得到肠二醇的产率，见表8。

[0219] 3)肠二醇的提取与纯化

[0220] 方法同实施例6的步骤5。通过HPLC分析对照标准曲线计算出洗脱物中肠二醇的量。洗脱物的量和洗脱物中肠二醇的含量见表8。

[0221] 4、肠内酯的制备和分析

[0222] 1)肠内酯的制备

[0223] ①按1∶10的比例分别将第50代培养液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.1325kPa)36小时，进行增菌。

[0224] ②按1∶10的比例将增菌后的菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻子粕(150g/2.5L)，37℃厌氧培养(氧分压为10.1325kPa)5天。

[0225] 2)样品分析

[0226] 分析方法同实施例1的步骤3。

[0227] 通过HPLC图谱结果对照标准曲线可以计算出培养液中肠内酯的含量，用肠内酯的产量除以底物的量，得到肠内酯的产率，见表9。

[0228] 3)肠内酯提取与纯化

[0229] 方法同实施例7的步骤5。通过HPLC分析结果对照标准曲线可以算出洗脱物中肠内酯的量。洗脱物的量和洗脱物中肠内酯的含量见表9。

[0230] 实施例10、利用大鼠粪便制备的菌液生产肠二醇和肠内酯

[0231] 一、标准曲线的建立

[0232] 1、肠二醇标准曲线的建立

[0233] 同实施例6的步骤一。

[0234] 2、肠内酯标准曲线的建立

[0235] 同实施例7的步骤一。

[0236] 二、以亚麻子粕为底物转化生产肠二醇

[0237] 1、配制培养基

[0238] 1)配制厌氧培养基

[0239] 同实施例1的步骤1。

[0240] 2)配制无碳源培养基

[0241] 按照如下方法配制：每升磷酸缓冲液(pH 6.5)中加入6g NaCl、6g NH4Cl、2.0g硫代乙醇酸钠。用石蜡油覆盖，121℃高压灭菌15min。

[0242] 2、菌液传代

[0243] 1)制备大鼠粪便的菌液(终浓度为4g粪便/20ml磷酸缓冲液)。

[0244] 2)按1∶10的比例将菌液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.1325kPa)36小时，进行增菌。

[0245] 3)按1∶10的比例将增菌后的菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻子粕(0.12g/4mL)，37℃厌氧培养(氧分压为10.1325kPa)6天，得到培养液(原代培养液)。

[0246] 4)每6天进行一次传代(重复步骤2)和3))，共传代50次，得到样本的第50代培养液(传代培养液)。

[0247] 3、肠二醇的制备和分析

[0248] 1)肠二醇的制备

[0249] ①按1∶10的比例分别将第50代培养液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.1325kPa)36小时，进行增菌。

[0250] ②按1∶10的比例将增菌后的菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻子粕(75g/2.5L)，37℃厌氧培养(氧分压为10.1325kPa)3天。

[0251] 2)样品分析

[0252] 分析方法同实施例1的步骤3。

[0253] 通过HPLC图谱结果对照标准曲线计算出培养液中肠二醇的含量，用肠二醇的产量除以底物的量，得到肠二醇的产率，见表8。

[0254] 3)肠二醇的提取与纯化

[0255] 方法同实施例6的步骤5。通过HPLC分析对照标准曲线计算出洗脱物中肠二醇的量。洗脱物的量和洗脱物中肠二醇的含量见表8。

[0256] 4、肠内酯的制备和分析

[0257] 1)肠内酯的制备

[0258] ①按1∶10的比例分别将第50代培养液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.1325kPa)36小时，进行增菌。

[0259] ②按1∶10的比例将增菌后的菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻子粕(150g/2.5L)，37℃厌氧培养(氧分压为10.1325kPa)15天。

[0260] 2)样品分析

[0261] 分析方法同实施例1的步骤3。

[0262] 通过HPLC图谱结果对照标准曲线可以计算出培养液中肠内酯的含量，用肠内酯的产量除以底物的量，得到肠内酯的产率，见表9。

[0263] 3)肠内酯提取与纯化

[0264] 方法同实施例7的步骤5。通过HPLC分析结果对照标准曲线可以算出洗脱物中肠内酯的量。洗脱物的量和洗脱物中肠内酯的含量见表9。

[0265] 实施例11、利用大鼠肠液制备的菌液生产肠二醇和肠内酯

[0266] 一、标准曲线的建立

[0267] 1、肠二醇标准曲线的建立

[0268] 同实施例6的步骤一。

[0269] 2、肠内酯标准曲线的建立

[0270] 同实施例7的步骤一。

[0271] 二、以亚麻子粕为底物转化生产肠二醇

[0272] 1、配制培养基

[0273] 1)配制厌氧培养基

[0274] 同实施例1的步骤1。

[0275] 2)配制无碳源培养基

[0276] 按照如下方法配制：每升磷酸缓冲液(pH 6.5)中加入6g NaCl、6g NH4Cl、2.0g硫代乙醇酸钠。用石蜡油覆盖，121℃高压灭菌15min。

[0277] 2、菌液制备及传代

[0278] 1)在厌氧环境条件下处死大鼠，取出肠液，用9倍量磷酸缓冲液稀释得到菌液。

[0279] 2)按1∶10的比例将菌液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.1325kPa)36小时，进行增菌。

[0280] 3)按1∶10的比例将增菌后的菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻子粕(0.12g/4mL)，37℃厌氧培养(氧分压为10.1325kPa)6天，得到培养液(原代培养液)。

[0281] 4)每6天进行一次传代(重复步骤2)和3))，共传代50次，得到样本的第50代培养液(传代培养液)。

[0282] 3、肠二醇的制备和分析

[0283] 1)肠二醇的制备

[0284] ①按1∶10的比例分别将第50代培养液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.1325kPa)36小时，进行增菌。

[0285] ②按1∶10的比例将增菌后的菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻子粕(75g/2.5L)，37℃厌氧培养(氧分压为10.1325kPa)8天。

[0286] 2)样品分析

[0287] 分析方法同实施例1的步骤3。

[0288] 通过HPLC图谱结果对照标准曲线计算出培养液中肠二醇的含量，用肠二醇的产量除以底物的量，得到肠二醇的产率，见表8。

[0289] 3)肠二醇的提取与纯化

[0290] 方法同实施例6的步骤5。通过HPLC分析对照标准曲线计算出洗脱物中肠二醇的量。洗脱物的量和洗脱物中肠二醇的含量见表8。

[0291] 4、肠内酯的制备和分析

[0292] 1)肠内酯的制备

[0293] ①按1∶10的比例分别将第50代培养液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.1325kPa)36小时，进行增菌。

[0294] ②按1∶10的比例将增菌后的菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻子粕(150g/2.5L)，37℃厌氧培养(氧分压为10.1325kPa)15天。

[0295] 2)样品分析

[0296] 分析方法同实施例1的步骤3。

[0297] 通过HPLC图谱结果对照标准曲线可以计算出培养液中肠内酯的含量，用肠内酯的产量除以底物的量，得到肠内酯的产率，见表9。

[0298] 3)肠内酯提取与纯化

[0299] 方法同实施例7的步骤5。通过HPLC分析结果对照标准曲线可以算出洗脱物中肠内酯的量。洗脱物的量和洗脱物中肠内酯的含量见表9。

[0300] 实施例12、利用仓鼠粪便制备的菌液生产肠二醇和肠内酯

[0301] 一、标准曲线的建立

[0302] 1、肠二醇标准曲线的建立

[0303] 同实施例6的步骤一。

[0304] 2、肠内酯标准曲线的建立

[0305] 同实施例7的步骤一。

[0306] 二、以亚麻子粕为底物转化生产肠二醇

[0307] 1、配制培养基

[0308] 1)配制厌氧培养基

[0309] 同实施例1的步骤1。

[0310] 2)配制无碳源培养基

[0311] 按照如下方法配制：每升磷酸缓冲液(pH 6.5)中加入6g NaCl、6g NH4Cl、2.0g硫代乙醇酸钠。用石蜡油覆盖，121℃高压灭菌15min。

[0312] 2、菌液传代

[0313] 1)制备仓鼠粪便的菌液(终浓度为5g粪便/20ml磷酸缓冲液)。

[0314] 2)按1∶10的比例将菌液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.1325kPa)36小时，进行增菌。

[0315] 3)按1∶10的比例将增菌后的菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻子粕(0.12g/4mL)，37℃厌氧培养(氧分压为10.1325kPa)6天，得到培养液(原代培养液)。

[0316] 4)每6天进行一次传代(重复步骤2)和3))，共传代50次，得到样本的第50代培养液(传代培养液)。

[0317] 3、肠二醇的制备和分析

[0318] 1)肠二醇的制备

[0319] ①按1∶10的比例分别将第50代培养液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.1325kPa)36小时，进行增菌。

[0320] ②按1∶10的比例将增菌后的菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻子粕(75g/2.5L)，37℃厌氧培养(氧分压为10.1325kPa)6天。

[0321] 2)样品分析

[0322] 分析方法同实施例1的步骤3。

[0323] 通过HPLC图谱结果对照标准曲线计算出培养液中肠二醇的含量，用肠二醇的产量除以底物的量，得到肠二醇的产率，见表8。

[0324] 3)肠二醇的提取与纯化

[0325] 方法同实施例6的步骤5。通过HPLC分析对照标准曲线计算出洗脱物中肠二醇的量。洗脱物的量和洗脱物中肠二醇的含量见表8。

[0326] 4、肠内酯的制备和分析

[0327] 1)肠内酯的制备

[0328] ①按1∶10的比例分别将第50代培养液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.1325kPa)36小时，进行增菌。

[0329] ②按1∶10的比例将增菌后的菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻子粕(150g/2.5L)，37℃厌氧培养(氧分压为10.1325kPa)15天。

[0330] 2)样品分析

[0331] 分析方法同实施例1的步骤3。

[0332] 通过HPLC图谱结果对照标准曲线可以计算出培养液中肠内酯的含量，用肠内酯的产量除以底物的量，得到肠内酯的产率，见表9。

[0333] 3)肠内酯提取与纯化

[0334] 方法同实施例7的步骤5。通过HPLC分析结果对照标准曲线可以算出洗脱物中肠内酯的量。洗脱物的量和洗脱物中肠内酯的含量见表9。

[0335] 实施例13、利用仓鼠肠液制备的菌液生产肠二醇和肠内酯

[0336] 一、标准曲线的建立

[0337] 1、肠二醇标准曲线的建立

[0338] 同实施例6的步骤一。

[0339] 2、肠内酯标准曲线的建立

[0340] 同实施例7的步骤一。

[0341] 二、以亚麻子粕为底物转化生产肠二醇

[0342] 1、配制培养基

[0343] 1)配制厌氧培养基

[0344] 同实施例1的步骤1。

[0345] 2)配制无碳源培养基

[0346] 按照如下方法配制：每升磷酸缓冲液(pH 6.5)中加入6g NaCl、6g NH4Cl、2.0g硫代乙醇酸钠。用石蜡油覆盖，121℃高压灭菌15min。

[0347] 2、菌液制备及传代

[0348] 1)在厌氧环境条件下处死仓鼠，取出肠液，用2倍量磷酸缓冲液稀释得到菌液。

[0349] 2)按1∶10的比例将菌液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.1325kPa)36小时，进行增菌。

[0350] 3)按1∶10的比例将增菌后的菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻子粕(0.12g/4mL)，37℃厌氧培养(氧分压为10.1325kPa)6天，得到培养液(原代培养液)。

[0351] 4)每6天进行一次传代(重复步骤2)和3))，共传代50次，得到样本的第50代培养液(传代培养液)。

[0352] 3、肠二醇的制备和分析

[0353] 1)肠二醇的制备

[0354] ①按1∶10的比例分别将第50代培养液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.1325kPa)36小时，进行增菌。

[0355] ②按1∶10的比例将增菌后的菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻子粕(75g/2.5L)，37℃厌氧培养(氧分压为10.1325kPa)6天。

[0356] 2)样品分析

[0357] 分析方法同实施例1的步骤3。

[0358] 通过HPLC图谱结果对照标准曲线计算出培养液中肠二醇的含量，用肠二醇的产量除以底物的量，得到肠二醇的产率，见表8。

[0359] 3)肠二醇的提取与纯化

[0360] 方法同实施例6的步骤5。通过HPLC分析对照标准曲线计算出洗脱物中肠二醇的量。洗脱物的量和洗脱物中肠二醇的含量见表8。

[0361] 4、肠内酯的制备和分析

[0362] 1)肠内酯的制备

[0363] ①按1∶10的比例分别将第50代培养液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.1325kPa)36小时，进行增菌。

[0364] ②按1∶10的比例将增菌后的菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻子粕(150g/2.5L)，37℃厌氧培养(氧分压为10.1325kPa)12天。

[0365] 2)样品分析

[0366] 分析方法同实施例1的步骤3。

[0367] 通过HPLC图谱结果对照标准曲线可以计算出培养液中肠内酯的含量，用肠内酯的产量除以底物的量，得到肠内酯的产率，见表9。

[0368] 3)肠内酯提取与纯化

[0369] 方法同实施例7的步骤5。通过HPLC分析结果对照标准曲线可以算出洗脱物中肠内酯的量。洗脱物的量和洗脱物中肠内酯的含量见表9。

[0370] 实施例14、利用豚鼠粪便制备的菌液生产肠二醇和肠内酯

[0371] 一、标准曲线的建立

[0372] 1、肠二醇标准曲线的建立

[0373] 同实施例6的步骤一。

[0374] 2、肠内酯标准曲线的建立

[0375] 同实施例7的步骤一。

[0376] 二、以亚麻子粕为底物转化生产肠二醇

[0377] 1、配制培养基

[0378] 1)配制厌氧培养基

[0379] 同实施例1的步骤1。

[0380] 2)配制无碳源培养基

[0381] 按照如下方法配制：每升磷酸缓冲液(pH 6.5)中加入6g NaCl、6g NH4Cl、2.0g硫代乙醇酸钠。用石蜡油覆盖，121℃高压灭菌15min。

[0382] 2、菌液传代

[0383] 1)制备豚鼠粪便的菌液(终浓度为1.5g粪便/20ml磷酸缓冲液)。

[0384] 2)按1∶10的比例将菌液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.1325kPa)36小时，进行增菌。

[0385] 3)按1∶10的比例将增菌后的菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻子粕(0.12g/4mL)，37℃厌氧培养(氧分压为10.1325kPa)6天，得到培养液(原代培养液)。

[0386] 4)每6天进行一次传代(重复步骤2)和3))，共传代50次，得到样本的第50代培养液(传代培养液)。

[0387] 3、肠二醇的制备和分析

[0388] 1)肠二醇的制备

[0389] ①按1∶10的比例分别将第50代培养液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.1325kPa)36小时，进行增菌。

[0390] ②按1∶10的比例将增菌后的菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻子粕(75g/2.5L)，37℃厌氧培养(氧分压为10.1325kPa)5天。

[0391] 2)样品分析

[0392] 分析方法同实施例1的步骤3。

[0393] 通过HPLC图谱结果对照标准曲线计算出培养液中肠二醇的含量，用肠二醇的产量除以底物的量，得到肠二醇的产率，见表8。

[0394] 3)肠二醇的提取与纯化

[0395] 方法同实施例6的步骤5。通过HPLC分析对照标准曲线计算出洗脱物中肠二醇的量。洗脱物的量和洗脱物中肠二醇的含量见表8。

[0396] 4、肠内酯的制备和分析

[0397] 1)肠内酯的制备

[0398] ①按1∶10的比例分别将第50代培养液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.1325kPa)36小时，进行增菌。

[0399] ②按1∶10的比例将增菌后的菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻子粕(150g/2.5L)，37℃厌氧培养(氧分压为10.1325kPa)8天。

[0400] 2)样品分析

[0401] 分析方法同实施例1的步骤3。

[0402] 通过HPLC图谱结果对照标准曲线可以计算出培养液中肠内酯的含量，用肠内酯的产量除以底物的量，得到肠内酯的产率，见表9。

[0403] 3)肠内酯提取与纯化

[0404] 方法同实施例7的步骤5。通过HPLC分析结果对照标准曲线可以算出洗脱物中肠内酯的量。洗脱物的量和洗脱物中肠内酯的含量见表9。

[0405] 实施例15、利用豚鼠肠液制备的菌液生产肠二醇和肠内酯

[0406] 一、标准曲线的建立

[0407] 1、肠二醇标准曲线的建立

[0408] 同实施例6的步骤一。

[0409] 2、肠内酯标准曲线的建立

[0410] 同实施例7的步骤1。

[0411] 二、以亚麻子粕为底物转化生产肠二醇

[0412] 1、配制培养基

[0413] 1)配制厌氧培养基

[0414] 同实施例1的步骤一。

[0415] 2)配制无碳源培养基

[0416] 按照如下方法配制：每升磷酸缓冲液(pH 6.5)中加入6g NaCl、6g NH4Cl、2.0g硫代乙醇酸钠。用石蜡油覆盖，121℃高压灭菌15min。

[0417] 2、菌液制备及传代

[0418] 1)在厌氧环境条件下处死豚鼠，取出肠液，用8倍量磷酸缓冲液稀释得到菌液。

[0419] 2)按1∶10的比例将菌液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.1325kPa)36小时，进行增菌。

[0420] 3)按1∶10的比例将增菌后的菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻子粕(0.12g/4mL)，37℃厌氧培养(氧分压为10.1325kPa)6天，得到培养液(原代培养液)。

[0421] 4)每6天进行一次传代(重复步骤2)和3))，共传代50次，得到样本的第50代培养液(传代培养液)。

[0422] 3、肠二醇的制备和分析

[0423] 1)肠二醇的制备

[0424] ①按1∶10的比例分别将第50代培养液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.1325kPa)36小时，进行增菌。

[0425] ②按1∶10的比例将增菌后的菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻子粕(75g/2.5L)，37℃厌氧培养(氧分压为10.1325kPa)6天。

[0426] 2)样品分析

[0427] 分析方法同实施例1的步骤3。

[0428] 通过HPLC图谱结果对照标准曲线计算出培养液中肠二醇的含量，用肠二醇的产量除以底物的量，得到肠二醇的产率，见表8。

[0429] 3)肠二醇的提取与纯化

[0430] 方法同实施例6的步骤5。通过HPLC分析对照标准曲线计算出洗脱物中肠二醇的量。洗脱物的量和洗脱物中肠二醇的含量见表8。

[0431] 4、肠内酯的制备和分析

[0432] 1)肠内酯的制备

[0433] ①按1∶10的比例分别将第50代培养液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.1325kPa)36小时，进行增菌。

[0434] ②按1∶10的比例将增菌后的菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻子粕(150g/2.5L)，37℃厌氧培养(氧分压为10.1325kPa)13天。

[0435] 2)样品分析

[0436] 分析方法同实施例1的步骤3。

[0437] 通过HPLC图谱结果对照标准曲线可以计算出培养液中肠内酯的含量，用肠内酯的产量除以底物的量，得到肠内酯的产率，见表9。

[0438] 3)肠内酯提取与纯化

[0439] 方法同实施例7的步骤5。通过HPLC分析结果对照标准曲线可以算出洗脱物中肠内酯的量。洗脱物的量和洗脱物中肠内酯的含量见表9。

[0440] 实施例16、利用家兔粪便制备的菌液生产肠二醇和肠内酯

[0441] 一、标准曲线的建立

[0442] 1、肠二醇标准曲线的建立

[0443] 同实施例6的步骤一。

[0444] 2、肠内酯标准曲线的建立

[0445] 同实施例7的步骤一。

[0446] 二、以亚麻子粕为底物转化生产肠二醇

[0447] 1、配制培养基

[0448] 1)配制厌氧培养基

[0449] 同实施例1的步骤1。

[0450] 2)配制无碳源培养基

[0451] 按照如下方法配制：每升磷酸缓冲液(pH 6.5)中加入6g NaCl、6g NH4Cl、2.0g硫代乙醇酸钠。用石蜡油覆盖，121℃高压灭菌15min。

[0452] 2、菌液传代

[0453] 1)制备家兔粪便的菌液(终浓度为3g粪便/20ml磷酸缓冲液)。

[0454] 2)按1∶10的比例将菌液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.1325kPa)36小时，进行增菌。

[0455] 3)按1∶10的比例将增菌后的菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻子粕(0.12g/4mL)，37℃厌氧培养(氧分压为10.1325kPa)6天，得到培养液(原代培养液)。

[0456] 4)每6天进行一次传代(重复步骤2)和3))，共传代50次，得到样本的第50代培养液(传代培养液)。

[0457] 3、肠二醇的制备和分析

[0458] 1)肠二醇的制备

[0459] ①按1∶10的比例分别将第50代培养液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.1325kPa)36小时，进行增菌。

[0460] ②按1∶10的比例将增菌后的菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻子粕(75g/2.5L)，37℃厌氧培养(氧分压为10.1325kPa)6天。

[0461] 2)样品分析

[0462] 分析方法同实施例1的步骤3。

[0463] 通过HPLC图谱结果对照标准曲线计算出培养液中肠二醇的含量，用肠二醇的产量除以底物的量，得到肠二醇的产率，见表8。

[0464] 3)肠二醇的提取与纯化

[0465] 方法同实施例6的步骤5。通过HPLC分析对照标准曲线计算出洗脱物中肠二醇的量。洗脱物的量和洗脱物中肠二醇的含量见表8。

[0466] 4、肠内酯的制备和分析

[0467] 1)肠内酯的制备

[0468] ①按1∶10的比例分别将第50代培养液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.1325kPa)36小时，进行增菌。

[0469] ②按1∶10的比例将增菌后的菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻子粕(150g/2.5L)，37℃厌氧培养(氧分压为10.1325kPa)15天。

[0470] 2)样品分析

[0471] 分析方法同实施例1的步骤3。

[0472] 通过HPLC图谱结果对照标准曲线可以计算出培养液中肠内酯的含量，用肠内酯的产量除以底物的量，得到肠内酯的产率，见表9。

[0473] 3)肠内酯提取与纯化

[0474] 方法同实施例7的步骤5。通过HPLC分析结果对照标准曲线可以算出洗脱物中肠内酯的量。洗脱物的量和洗脱物中肠内酯的含量见表9。

[0475] 实施例17、利用家兔肠液制备的菌液生产肠二醇和肠内酯

[0476] 一、标准曲线的建立

[0477] 1、肠二醇标准曲线的建立

[0478] 同实施例6的步骤一。

[0479] 2、肠内酯标准曲线的建立

[0480] 同实施例7的步骤一。

[0481] 二、以亚麻子粕为底物转化生产肠二醇和肠内酯

[0482] 1、配制培养基

[0483] 1)配制厌氧培养基

[0484] 同实施例1的步骤1。

[0485] 2)配制无碳源培养基

[0486] 按照如下方法配制：每升磷酸缓冲液(pH 6.5)中加入6g NaCl、6g NH4Cl、2.0g硫代乙醇酸钠。用石蜡油覆盖，121℃高压灭菌15min。

[0487] 2、菌液制备及传代

[0488] 1)在厌氧环境条件下处死家兔，取出肠液，用5倍量磷酸缓冲液稀释得到菌液。

[0489] 2)按1∶10的比例将菌液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.1325kPa)36小时，进行增菌。

[0490] 3)按1∶10的比例将增菌后的菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻子粕(0.12g/4mL)，37℃厌氧培养(氧分压为10.1325kPa)6天，得到培养液(原代培养液)。

[0491] 4)每6天进行一次传代(重复步骤2)和3))，共传代50次，得到样本的第50代培养液(传代培养液)。

[0492] 3、肠二醇的制备和分析

[0493] 1)肠二醇的制备

[0494] ①按1∶10的比例分别将第50代培养液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.1325kPa)36小时，进行增菌。

[0495] ②按1∶10的比例将增菌后的菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻子粕(75g/2.5L)，37℃厌氧培养(氧分压为10.1325kPa)4天。

[0496] 2)样品分析

[0497] 分析方法同实施例1的步骤3。

[0498] 通过HPLC图谱结果对照标准曲线计算出培养液中肠二醇的含量，用肠二醇的产量除以底物的量，得到肠二醇的产率，见表8。

[0499] 3)肠二醇的提取与纯化

[0500] 方法同实施例6的步骤5。通过HPLC分析对照标准曲线计算出洗脱物中肠二醇的量。洗脱物的量和洗脱物中肠二醇的含量见表8。

[0501] 4、肠内酯的制备和分析

[0502] 1)肠内酯的制备

[0503] ①按1∶10的比例分别将第50代培养液接种至厌氧培养基，37℃厌氧培养(氧分压为3.1325kPa)36小时，进行增菌。

[0504] ②按1∶10的比例将增菌后的菌液接种到上述无碳源培养基中，加入亚麻子粕(150g/2.5L)，37℃厌氧培养(氧分压为10.1325kPa)8天。

[0505] 2)样品分析

[0506] 分析方法同实施例1的步骤3。

[0507] 通过HPLC图谱结果对照标准曲线可以计算出培养液中肠内酯的含量，用肠内酯的产量除以底物的量，得到肠内酯的产率，见表9。

[0508] 3)肠内酯提取与纯化

[0509] 方法同实施例7的步骤5。通过HPLC分析结果对照标准曲线可以算出洗脱物中肠内酯的量。洗脱物的量和洗脱物中肠内酯的含量见表9。

[0510] 表8不同菌种培养液中肠二醇产率、洗脱物量和洗脱物中肠二醇含量[0511]菌种 底物量(g) 肠二醇产率(％) 洗脱物量(g) 洗脱物中肠二醇含量(％)
小鼠的新鲜粪便 50 0.31 0.13 89.13
大鼠的新鲜粪便 50 0.31 0.17 80.34
仓鼠的新鲜粪便 50 0.27 0.20 81.23
豚鼠的新鲜粪便 50 0.30 0.21 83.99
家兔的新鲜粪便 50 0.26 0.22 81.27
小鼠的新鲜肠液 50 0.33 0.26 80.00
大鼠的新鲜肠液 50 0.34 0.21 79.13
仓鼠的新鲜肠液 50 0.29 0.24 80.25
豚鼠的新鲜肠液 50 0.32 0.19 84.53
家兔的新鲜肠液 50 0.27 0.20 80.28

[0512] 表9不同菌种培养液中肠内酯产率、洗脱物量和洗脱物中肠内酯含量[0513]肠内酯产率
菌种 底物量(g) 洗脱物量(g) 洗脱物中肠内酯含量(％)
(％)
小鼠的新鲜粪便 50 0.29 0.27 81.38
大鼠的新鲜粪便 50 0.30 0.26 77.61
仓鼠的新鲜粪便 50 0.27 0.22 78.56
豚鼠的新鲜粪便 50 0.30 0.21 79.14
家兔的新鲜粪便 50 0.23 0.23 70.21
小鼠的新鲜肠液 50 0.28 0.28 70.61
大鼠的新鲜肠液 50 0.29 0.27 71.24
仓鼠的新鲜肠液 50 0.24 0.22 79.60
豚鼠的新鲜肠液 50 0.26 0.20 79.03
家兔的新鲜肠液 50 0.21 0.23 70.15