棉花杂交种的纯度检测方法

摘要

本发明涉及一种棉花杂交种中棉所48DNA指纹纯度检测方法，该方法利用SSR标记技术，使用选自NAU1190、CIR246、CIR105、BNL1705、BNL4030和NAU1322中的一个或多个特征引物进行检测，该方法包括下述步骤：DNA提取、使用选自NAU1190、CIR246、CIR105、BNL1705、BNL4030和NAU1322中的一个或多个特征引物进行SSR-PCR扩增、电泳和银染检测。本发明方法简单快速、准确稳定，仅需2d即可完成1份送检样品(100粒)的纯度检测。

权利要求

1.一种棉花杂交种中棉所48种子纯度检测方法，其特征在于，使用选自BNL1705的特征引物进行检测。

2.根据权利要求1所述中棉所48种子纯度检测方法，其特征在于，包括DNA提取、使用选自BNL1705特征引物进行SSR-PCR扩增、电泳和银染检测步骤。

3.根据权利要求2所述中棉所48种子纯度检测方法，其特征在于，所述DNA提取包括以下步骤：将去壳棉种充分粉碎后，加入800μlSDS提取液，漩涡充分后，65℃水浴30min，间隔10min轻摇一次；加入等体积800μl酚、氯仿和异戊醇的混合液，所述酚、氯仿和异戊醇的体积比依次为25∶24∶1，混匀至不分层，10000rpm离心10min；取上清，加入

1μlRNase(10mg/ml)，37℃水浴30min；重复抽提一次后离心取上清，加入0.7倍体积异丙醇，待DNA成团析出后，70％乙醇洗涤DNA沉淀2次，加入200μlTE或ddH2O充分溶解DNA，备用。

4.根据权利要求2所述中棉所48种子纯度检测方法，其特征在于，所述SSR-PCR扩增反应体系，其中20μl反应液中包括：1.5mmol/LMgCl2，0.1mmol/L dNTP，1×Buffer，

0.3μmol/L SSR引物，1U TaqDNA聚合酶，2μl DNA模板；反应程序为：95℃预变性2min，一个循环；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸7min，一个循环；4℃保存待用。

5.根据权利要求2所述中棉所48种子纯度检测方法，其特征在于，所述电泳步骤中，PCR扩增产物采用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒功率80W电泳1h。

6.根据权利要求2所述中棉所48种子纯度检测方法，所述银染检测包括以下步骤：用

10％乙醇和0.5％冰醋酸组成的固定液固定10min；用双蒸水快速漂洗1次；用0.2％AgNO3溶液染色5min；用双蒸水快速漂洗1次；用3％NaOH和0.5％甲醛组成的显影液显影；用

10％无水乙醇和0.5％冰醋酸组成的固定液定影。

说明书

棉花杂交种的纯度检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及分子生物学领域，特别是，涉及一种棉花杂交种中棉所48DNA指纹纯度检测方法。

背景技术

[0002] 中棉所48系中国农业科学院棉花研究所选育的抗虫杂交棉品种。该杂交种具有大铃、优质的特性，连续多年在我国主要棉区都有较大的种植面积，现已成为我国主推棉花品种。随着棉花品种数量的日益增加和遗传基础的日益狭窄，使得完全根据形态性状进行棉花品种的辨别越来越困难，给种子生产、经营、管理、维权等诸环节带来不同程度的困难，造成诸如品种多、乱、杂的现象。近年来，分子生物学的发展使品种鉴定进入到基因水平，与传统的形态学方法和蛋白质电泳技术相比，DNA标记技术能揭示更多的多态性，具有准确可靠、简单快速、易于自动化的优点，是品种鉴定技术的发展趋势。

[0003] 与其它分子标记相比，以微卫星序列为基础的简单重复序列(SSR)标记在DNA指纹鉴定上显示了独特的优越性：SSR标记数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高，以孟德尔方式遗传，呈共显性。SSR标记已成为品种纯度鉴定首选技术之一，并已在玉米，水稻等作物上初步应用。

[0004] 目前，我国棉种的真实性与品种纯度鉴定仍依靠田间小区种植鉴定方法，需投入大量的人力、物力，成本高、耗时长，时效性差。武耀廷，张天真，郭旺珍等进行了陆地棉品种SSR标记的多态性及用于杂交种纯度检测的研究；马轩，杜雄明，孙君灵等进行了18个彩色棉品系的SSR指纹分析；殷剑美，陈旭升，狄佳春等进行了杂交棉苏杂118的SSR指纹图谱构建研究。广大科研工作者普遍认为，利用分子 标记进行棉花品种鉴定是可行的。但利用现有的分子标记技术进行品种鉴定缺乏系统性研究，存在鉴别能力不够高、操作步骤较多、耗费时间较长、实验成本较高等问题，不能完全适应实践检测的需要。因此，有必要针对限制棉花DNA指纹鉴定实用化的因素，迅速开展我国棉花品种DNA指纹鉴定的研究工作，建立高效准确、经济简便的以SSR技术为基础的DNA指纹鉴定体系，在此基础上开发棉花品种纯度和真伪DNA指纹鉴定方法，将为棉花品种质量监控及品种权保护提供有利的工具。 发明内容

[0005] 本发明目的是提供一种棉花杂交种中棉所48DNA指纹纯度检测方法，以克服现有技术存在的上述不足。

[0006] 本发明通过对DNA快速提取法、分子检测标准试验体系(包括PCR扩增体系、电泳及银染检测)、特征引物筛选确定等环节进行全面系统的研究，从实践上解决限制DNA指纹技术商业化的关键技术问题，建立了快速准确、经济简便、稳定可靠的棉花DNA指纹鉴定标准实验体系，并在此基础上开发一种适用于棉花杂交种中棉所48纯度检测的方法，采用该方法不仅检测结果稳定可靠，而且操作简单方便，成本低廉，有利于技术的标准化。 [0007] 本发明提供一种棉花杂交种中棉所48DNA指纹纯度检测方法，使用选自NAU1190、CIR246、CIR105、BNL1705、BNL4030和NAU1322中的一个或多个特征引物进行检测。 [0008] 本发明棉花杂交种中棉所48DNA指纹纯度检测方法，包括DNA提取、使用选自NAU1190、CIR246、CIR105、BNL1705、BNL4030和NAU1322中的一个或多个特征引物进行SSR-PCR扩增、电泳和银染检测。

[0009] 一、特征引物的筛选确定

[0010] 1)资料初筛：广泛收集整合国内外文献资料上公布的棉花SSR 引物信息，依据以下引物筛选原则：a.在染色体上已明确定位，且位置是唯一的；b.多态性基因型数≥3。初筛出分布在棉花全基因组26条染色体上的单位点多态性SSR引物400对，作为品种鉴定的候选引物。

[0011] 2)中棉所48纯度检测特征引物

[0012] 从候选引物中进一步筛选出在中棉所48父本、母本和杂交种F1间表现为双亲互补带型的引物，并通过田间常规鉴定与室内鉴定比较，验证引物可靠性，确定出适用于中棉所48纯度检测的特征引物6个：NAU1190、CIR246、CIR105、BNL1705、BNL4030和NAU1322。使用其中任一特征引物均可对中棉所48进行纯度检测，不同特征引物的检测结果可相互验证，同时使用还可对中棉所48进行真伪检测。

[0013] 二、利用上述筛选出的引物对中棉所48进行纯度检测，包括以下步骤： [0014] 1)DNA快速提取法

[0015] 经过大量的试验与比较研究，本发明发现了一种适用于单粒棉种DNA快速提取的方法：采用电动种子粉碎器将去壳棉种充分粉碎后，加入800μl SDS提取液，漩涡充分后，65℃水浴30min，间隔10min左右轻摇一次。加入等体积800μl酚、氯仿和异戊醇的混合液(其体积比依次为25∶24∶1)，混匀至不分层，10000rpm离心10min。取上清，加入
1μlRNase(10mg/ml)，37℃水浴30min。重复抽提一次后离心取上清，加入0.7倍体积异丙醇，待DNA成团析出后，70％乙醇洗涤DNA沉淀2次，加入200μlTE或ddH2O充分溶解DNA，备用。该方法相比常规的以叶片为材料的CTAB提取法不仅能获得高质量的DNA，而且简单快速，省去了育苗时间和液氮研磨等环节，降低实验成本的同时大大提高了工作效率。 [0016] 2)SSR-PCR扩增体系

[0017] 本发明在查阅大量文献的基础上采用正交设计试验，经过多次重 复，建立了一套稳定的适用于棉种纯度鉴定的SSR-PCR反应体系：20μl反应液中包括：1.5mmol/L MgCl2，0.1mmol/L dNTP，1×Buffer，0.3μmol/L SSR 引 物 ( 选 自 NAU1190、CIR246、CIR105、BNL1705、BNL4030和NAU1322中的一个或多个特征引物)，1U Taq DNA聚合酶，2μl DNA模板。

[0018] 反应程序：95℃预变性2min，一个循环；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸7min，一个循环；4℃保存待用。该SSR-PCR扩增体系稳定可靠，确保了实验结果的可重复性。

[0019] 3)电泳

[0020] PCR扩增产物采用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒功率80W电泳1h。相比非变性胶和琼脂糖凝胶电泳，6％变性胶更适于高分辨率的棉种DNA指纹鉴定，不仅有效提高品种指纹鉴别能力，而且缩短了电泳时间。

[0021] 4)银染检测

[0022] 采用快速银染法，流程如下：

[0023] 固定液(10％乙醇，0.5％冰醋酸)固定10min；→双蒸水快速漂洗1次；→0.2％AgNO3溶液染色5min；→双蒸水快速漂洗1次；→显影液(3％NaOH，0.5％甲醛)显影；→固定液(10％无水乙醇，0.5％冰醋酸)定影。该银染法操作简单，背景容易掌握，灵敏度高，且减少了冰醋酸的使用量，30分钟内即可获得背景清晰的染色效果。

[0024] 本发明棉花杂交种中棉所48DNA指纹纯度检测方法具有以下有益效果： [0025] 本发明建立了快速准确、经济简便、稳定可靠的棉花DNA指纹鉴定标准实验体系，并在此基础上开发了一种适用于棉花杂交种中棉所48纯度检测的方法，利用该方法对棉花杂交种中棉所48的纯度进行检测，一份样品(100粒种子)从送样到出结果仅需2d，且检测结果 稳定可靠，容易统计。一般种子检验室只需具备常规的分子生物学设备就可按提供的操作步骤进行实际检测。

附图说明

[0026] 图1为中棉所48纯度检测标准图谱，图中1-6依次为引物：NAU1190、BNL1705、CIR246、CIR105、NAU1322、BNL4030对中棉所48的父本、F1杂交种及母本的标准样品DNA进行SSR-PCR扩增的电泳图谱；

[0027] 图2为引物BNL1705对20份中棉所48种子DNA样品纯度检测图谱，图中：左边依次为分子量Marker、中棉所48父本、杂交F1及母本标准样品电泳谱带。

具体实施方式

[0028] 下面通过基于PCR技术的SSR分析实施例进一步说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0029] 实施例1

[0030] 对中棉所48种子样品进行纯度检测包括以下步骤，其中，本方法中所用引物信息见表1；所用的试剂配制见表2。

[0031] 1、单粒棉种DNA提取

[0032] (1)将单粒棉花种子去壳，充分粉碎后转入2ml的离心管中。

[0033] (2) 加 入 800ul DNA 提 取 液 (1 ％ SDS，0.01M EDTA 8.0，0.7MNaCl，0.05M Tris-HCl，0.5％山梨醇，1％PVP，1％β-巯基乙醇)，漩涡至充分混匀后，65℃水浴30min，间隔10min左右轻摇一下。

[0034] (3)水浴结束后，加入等体积800μl苯酚、氯仿和异戊醇的混合液(其体积比依次为2-5∶24∶1)，上下颠倒混匀至不分层，10000rpm离心10min。

[0035] (4)吸取上清液转移到另一2ml离心管中，加入1uL RNase酶(10mg/ml)，混匀后37℃水浴30min。

[0036] (5)加入等体积800ul的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)， 上下颠倒混匀至不分层，10000rpm离心10min。

[0037] (6)将上清液转移到另一2ml离心管中，加入0.7倍体积异丙醇缓慢摇动几次，静置30min，絮状DNA成团析出。

[0038] (7)用剪口枪头吸取DNA转移至盛有70％乙醇的离心管中，浸泡两次，第一次约2小时，第二次浸泡过夜。

[0039] (8)倒掉乙醇，自然通风干燥DNA，加入200ul TE(pH 8.0)或ddH2O，充分溶解备用。

[0040] (9)紫外检测DNA浓度，用ddH2O将DNA原液稀释至使用浓度20ng/μl，4℃保存备用。

[0041] 2、SSR-PCR扩增

[0042] SSR引物可选用NAU1190、BNL1705、CIR246、CIR105、NAU1322和BNL4030中的一个或多个，PCR反应体系如下：

[0043]

[0044] 反应程序：95℃预变性2min，一个循环；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸7min，一个循环；4℃保存待用。

[0045] 3、电泳检测

[0046] (1)清洗玻璃板：用自来水沾上洗涤灵把玻璃板反复擦洗干净，用纯水擦洗一遍，再用95％酒精擦洗一遍。在方板上涂上1ml Binding Silane(0.5％)，凹板上涂上1ml Repelsilane(2％)。操作过程中防止两块玻璃板互相污染。

[0047] (2)6％胶的制备：

[0048]

[0049] 注：40％PA胶：190g acrylamide+10g bisacrylamide用水稀释至500ml。 [0050] TEMED和10％APS在灌胶前加入。

[0051] (3)灌胶：灌胶过程中防止出现气泡，轻轻插入梳子，使其聚合2小时以上。 [0052] (4)变性：20μl PCR样品加上5μl 6×Loaling buffer，混匀后，在PCR仪上运行变性程序：95℃变性5分钟，4℃冷却10分钟(或置于冰上冷却)。

[0053] (5)电泳：用移液器吹吸加样槽，清除气泡，擦入样品梳子，每一个加样孔点入3μl样品。80W(1600V/50mA)恒功率电泳至上部的Loading buffer带(二甲苯青)至胶板的另一前沿(约1小时)。电泳结束后，小心分开两块玻璃板，胶会紧贴在涂Binding silane的玻璃板上。

[0054] 4、银染

[0055] 固定：10％无水乙醇+0.5％冰醋酸固定液，轻轻晃动10分钟；

[0056] 漂洗：双蒸水快速漂洗，不超过10秒；

[0057] 染色：0.2％AgNO3溶液中染色5分钟；

[0058] 漂洗：双蒸水快速漂洗，时间不超过10秒；

[0059] 显影：3％NaOH+0.5％甲醛显影液，轻轻晃动至带纹出现；

[0060] 定影；固定液中定影5分钟；

[0061] 5、数据统计与分析

[0062] 对电泳结果进行分析，参照中棉所48父本、母本及F1标准电泳图谱(见图1)，确定代表父本带型、母本带型、其他杂株带型及F1带型的各种基因型，只有同时具有亲本特异条带的种子才为真正的中棉所48F1种子，统计代表各种类型的基因型数，即可计算出待检中棉所48种子纯度百分率及杂株率。多个特征引物同时使用，取平均值即为待检样品纯度。 [0063] 表1中棉所48纯度检测特征引物基本信息表

[0064]

[0065] 表2实施例1的试剂配制

[0066]

[0067]

[0068] 实施例2

[0069] 按照实施例1的步骤，采用特征引物BNL1705对中棉所48种子样品进行纯度检测。数据统计与分析结果如下：

[0070] 图2所示为特征引物BNL1705对20份中棉所48种子样品的纯度检验结果，对照图1中所示中棉所48父本、母本和杂交种F1的标准电泳谱带可知：①父本带型：16号样品；②母本带型：7号和20号样品；③其他杂株带型：13号样品；④真实杂交种带型：除以上三种杂株带型外，其他16份样品均为真实杂交种带型。因此，这20份中棉所48种子样品纯度为80％；杂株率为20％(其中父本杂株率为5％，母本杂株率为10％，其他品种杂株率为
5％)。

[0071] 序列表

[0072] <110>中国农业科学院棉花研究所

[0073] <120>棉花杂交种中棉所48DNA指纹纯度检测方法

[0074] <130>KHP08113336.5

[0075] <160>12

[0076] <170>PatentIn version 3.5

[0077] <210>1

[0078] <211>20

[0079] <212>DNA

[0080] <213>人工序列

[0081] <400>1

[0082] ccatgtccgt atccatgtta 20 [0083] <210>2

[0084] <211>20

[0085] <212>DNA

[0086] <213>人工序列

[0087] <400>2

[0088] taaggcaaga tagggtcagg 20 [0089] <210>3

[0090] <211>19

[0091] <212>DNA

[0092] <213>人工序列

[0093] <400>3

[0094] ttagggttta gttgaatgg 19 [0095] <210>4

[0096] <211>15

[0097] <212>DNA

[0098] <213>人工序列

[0099] <400>4

[0100] atgaacacac gcacg 15 [0101] <210>5

[0102] <211>22

[0103] <212>DNA

[0104] <213>人工序列

[0105] <400>5

[0106] gtctcttgtc tttctttctt ac 22 [0107] <210>6

[0108] <211>16

[0109] <212>DNA

[0110] <213>人工序列

[0111] <400>6

[0112] aaccaaactg aaccca 16 [0113] <210>7

[0114] <211>24

[0115] <212>DNA

[0116] <213>人工序列

[0117] <400>7

[0118] gccaatttag tataggaagc aagt 24 [0119] <210>8

[0120] <211>24

[0121] <212>DNA

[0122] <213>人工序列

[0123] <400>8

[0124] catgtattat tttcacccct ctct 24 [0125] <210>9

[0126] <211>20

[0127] <212>DNA

[0128] <213>人工序列

[0129] <400>9

[0130] cctccctcac ttaaggtgca 20 [0131] <210>10

[0132] <211>20

[0133] <212>DNA

[0134] <213>人工序列

[0135] <400>10

[0136] atgttgtaag ggtgcaaggc 20 [0137] <210>11

[0138] <211>19

[0139] <212>DNA

[0140] <213>人工序列

[0141] <400>11

[0142] ctccaatcga atgattttt 19 [0143] <210>12

[0144] <211>20

[0145] <212>DNA

[0146] <213>人工序列

[0147] <400>12

[0148] ggtagggttt tggaggtttt 20