一种柑桔碎叶病毒分子变异的快速检测方法

摘要

本发明涉及一种用于诊断柑桔碎叶病毒(CTLV)分子变异的快速检测方法。它包括设计特异性引物对CTLV基因组特定区域的核酸序列进行逆转录聚合酶链式反应扩增(RT-PCR)，并用Taq I、Mse I、Hinf I或其它限制性内切酶对其RT-PCR产物进行消化，然后依据电泳图谱诊断CTLV的分子变异。本发明的方法具有速度快、成本低、重复性好、稳定性高、操作性强等特点，适合大规模、高通量的样品分析，适用于田间样品检测CTLV流行监控、脱毒苗木鉴定等多种用途。

权利要求

1.一种柑桔碎叶病毒分子变异的快速检测方法，其特征在于，用特异性引物对柑桔碎叶病毒基因组特定区域的核酸序列进行逆转录聚合酶链式扩增，并应用限制性内切酶对其扩增产物进行消化，依据电泳图谱诊断柑桔碎叶病毒的分子变异，该方法依次包括下述步骤：(1)取适量柑桔碎叶病毒寄主植物的叶或皮在液氮中充分研磨，加入核酸提取液按常规方法提取样品总核酸或RNA；

(2) 根 据 柑 桔 碎 叶 病 毒 的 保 守 序 列 设 计 特 异 引 物 CTLVR：

5′-AGAGTGGACAAACTCTAGAC-3′，CTLVF：5′-CCCTCTCAGC TAGAATTGAA-3′，以所提取的核酸为模版，对柑桔碎叶病毒基因组特定区域进行逆转录聚合酶链式扩增；

(3)应用限制性内切酶对柑桔碎叶病毒的RT-PCR产物进行消化；

(4)琼脂糖凝胶或聚丙烯酰氨凝胶电泳、染色、获取电泳图谱；

(5)依据上述图谱的条带特征诊断柑桔碎叶病毒的分子变异类型。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的柑桔碎叶病毒基因组特定区域是指包含或部分包含外壳蛋白基因、运动蛋白基因或其它基因的核酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的限制性内切酶是指Taq I、Mse I、HinfI或其它限制性内切酶中的1种或2种。

说明书

一种柑桔碎叶病毒分子变异的快速检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及病毒检测技术领域，特别是涉及一种柑桔碎叶病毒分子变异的快速检测方法。

背景技术

[0002] 柑桔碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus，CTLV)引起的柑桔碎叶病是威胁柑桔生产的重要病害之一，可以导致以枳作砧木的宽皮柑桔减产25％左右。柑桔碎叶病毒在美国、日本、南非、澳大利亚和中国等多个国家已有发生，尤其以日本和中国最为普遍。在浙江、湖南、福建和广西等省的局部地区柑桔碎叶病毒已造成比较严重的为害。柑桔碎叶病毒是RNA病毒，极易发生重组、突变，一旦强致病性的变异株系出现流行，将给柑桔产业带来不可估量的损失。

[0003] 目前为止，指示植物鉴定是检测柑桔碎叶病毒株系变异的重要依据和手段之一。苏鸿基根据柑桔碎叶病在腊斯克枳橙和特洛亚枳橙上的症状，将柑桔碎叶病毒划分为致病力强弱不同的株系。何新华等(1996)曾对11个柑桔碎叶病毒分离株致病力强弱进行比较。虽然用指示植物能够检测柑桔碎叶病毒的株系变异，但是费工、费时(30-45天)、成本高，而且受环境的影响较大(温度高于30℃不表现症状)，并且不能明确变异的分子特征。

[0004] 随着分子生物学的发展，许多科学工作者开始通过柑桔碎叶病毒全部或部分核苷酸序列测定来研究其分子变异，目前已测定了来源于苹果的P-209、百合的L和Li-23等7个分离株的全基因组核苷酸序列。Magome等(1997)对6个来源于苹果、日本梨和欧洲梨的分离物以及2个来源于柑桔的柑桔碎叶病毒分离物的V-区、CP和ORF2编码蛋白氨基酸序列进行研究，结果表明不同来源的病毒分离物包含2-4个分子变种，用V-区、CP和ORF2编码蛋白氨基酸序列构建的系统发育树中，这些分离物和分子变种可分为几个组群。但是序列测定成本较高，并需要大型仪器设备，不适合高通量大规模进行。

[0005] 单链构象多态性(SSCP)分析精确性高，理论上能检测到只有一个碱基突变的序列差异。Magome等(1999)根据研究发现柑桔碎叶病毒存在高度可变区(V-区)，利用SSCP技术研究了柑桔碎叶病毒V区的序列变异。该方法定义变异的类型比较困难，需要单一的标准分离株，因而重复性较差，不同实验室的结果之间可能存在差异，并且该方法电泳时间较长，后期的染色程序比较复杂，结果判定需要丰富的经验。

[0006] 到目前为止，尚无适合高通量快速检测柑桔碎叶病毒分子变异的方法报道。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供一种柑桔碎叶病毒分子变异的快速检测方法。该方法具有速度快、成本低、重复性好、稳定性高、操作性强等特点，适合大规模、高通量的样品分析，适用于田间样品检测、柑桔碎叶病毒流行监控、脱毒苗木鉴定等多种用途。

[0008] 本发明的目的通过如下措施来实现：

[0009] 一种柑桔碎叶病毒分子变异的快速检测方法，技术路线是用特异性引物对柑桔碎叶病毒基因组特定区域的核酸序列进行逆转录聚合酶链式扩增(RT-PCR)，并应用限制性内切酶对其扩增产物进行消化，依据电泳图谱诊断柑桔碎叶病毒的分子变异。

[0010] 该方法依次包括下述步骤：

[0011] (1)取适量柑桔碎叶病毒寄主植物的叶或皮在液氮中充分研磨，加入核酸提取液按常规方法提取样品总核酸或RNA；

[0012] (2)根据柑桔碎叶病毒的保守序列设计特异引物，以所提取的核酸为模版，对柑桔碎叶病毒基因组特定区域进行逆转录聚合酶链式扩增；

[0013] (3)应用限制性内切酶对柑桔碎叶病毒的RT-PCR产物进行消化；

[0014] (4)琼脂糖凝胶或聚丙烯酰氨凝胶电泳、染色、获取电泳图谱；

[0015] (5)依据上述图谱的条带特征诊断柑桔碎叶病毒的分子变异类型。

[0016] 上述方法中：

[0017] 步骤(2)所述的柑桔碎叶病毒基因组特定区域是指包含或部分包含外壳蛋白基因、运动蛋白基因或其它基因的核酸序列。

[0018] 步骤(3)所述的限制性内切酶是指Taq I、Mse I、HinfI或其它限制性内切酶中的1种或2种。

附图说明

[0019] 图1是本发明检测结果示意图

[0020] 1-7：柑桔碎叶病毒分子变异类型；M：DNA标准Marker

[0021] 本发明相比现有技术具有如下优点：

[0022] (1)速度快：从样品制备到获取可用于诊断柑桔碎叶病毒分子变异的酶切图谱可在一天内完成。

[0023] (2)操作简便，重复性好、稳定性高：同一样品的不同检测批次，不同人员操作，其结果一致性100％。

[0024] (3)适合大规模、高通量的样品分析：一次可轻松处理几十个样品。

具体实施方式

[0025] 下述实施例是为清楚说明本发明而进行的进一步详细描述，不构成对本发明的任何限定：

[0026] 实施例1：核酸提取

[0027] 称取5mg病毒寄主皮或叶装入一无菌离心管中，在液氮中研磨后依次加入60μL TES缓冲液和60μL饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀；70℃水浴5～10分钟；室温下13000rpm离心5分钟，吸取40μL上清液加入由Sephadex G-50-80构成的微柱中，置于一新的无菌离心管，5000rpm离心4分钟，收集洗脱液。

[0028] 实施例2：逆转录聚合酶链式扩增

[0029] 设计特异引物CTLVR：5′-AGAGTGGACA AACTCTAGAC-3′，CTLVF：5′-CCCTCTCAGC TAGAATTGAA-3′用于扩增包含柑桔碎叶病毒外壳蛋白基因在内的889bp核酸序列，逆转录聚合酶链式扩增在PCR仪中进行，所用反应体系总体积10μL，包括：2×PCR缓冲液5μL，10μmol/μL引物各1.25μL，50mmol/L MgSO4 0.3μL，5U/μLRT/Taq酶(Invitrogen公司)0.2μL，按前述方法所提取的核酸混合液1μL，超纯水1.5μL；反应条件为：42℃，30分钟；94℃，2分钟；94℃20s，54.5℃20s，72℃45s，40个循环；72℃10分钟。

[0030] 实施例3：限制性内切酶消化

[0031] 逆转录聚合酶链式扩增结束后，直接加入以下混合液10μL进行HinfI酶切反应：超纯水6.25μL；buffer B 2.5μL；BSA(10μg/μL)0.25μL；Hinf I(10U/μL)1μL；充分混匀后，37℃水浴1小时。

[0032] 实施例4：电泳及图谱获取

[0033] 配制3％琼脂糖凝胶，将上步消化混合液与8μL染料混匀后点样，同时点5μL的DNA标准Marker；电泳条件为初始电压150V，10分钟；后续电压100V，60分钟；电泳完毕后EB染色15分钟，在凝胶成像系统中获取酶切图谱。

[0034] 实施例5：柑桔碎叶病毒分子变异的诊断

[0035] 检测结果如图1所示，通过与DNA标准Marker比较可以估计出图谱中各条带的大小，从而判定15个柑桔碎叶病毒样品中出现7种分子变异类型。