木糖醇发酵重组酵母菌株的构建方法及应用

摘要

本发明公开了一种木糖醇发酵重组酵母菌株的构建方法，其主要是采用基因工程技术完全突变产木糖醇的酵母细胞中木糖醇脱氢酶双拷贝基因中的第一拷贝；以及突变第二拷贝3′端的60-150碱基，使得突变基因编码的木糖醇脱氢酶变构体在C-端有氨基酸缺失，从而降低酶活性。用本发明方法得到的重组热带假丝酵母菌株发酵生产木糖醇，产木糖醇119.2克/升，木糖转化率提高29.8％，提高了木糖醇的得率。

权利要求

1.一种木糖醇发酵重组酵母菌株的构建方法，其特征在于，完全突变产木糖醇酵母细胞中的木糖醇脱氢酶双拷贝基因中的第一拷贝，使其不被表达且不影响其他核苷酸序列表达；以及突变第二拷贝3′端的60-150个碱基对，使第二拷贝能部分表达且维持部分木糖醇脱氢酶活性。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述酵母选自热带假丝酵母(Candida Tropicilis)、季蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)、莫基假丝酵母(Candida mogii)、平滑肌假丝酵母(Candida parasilosisn)、汉孙德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)或管郎酵母属(Pachysolen)的酵母。

3.如权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，用易筛选的已知基因分别替换第一拷贝及所述第二拷贝3′端的60-150个碱基对。

4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，用抗潮霉素B基因替换第一拷贝的基因；用乳清苷酸脱羧酶基因替换第二拷贝3′端的150个碱基对。

5.权利要求1-4任一项所述方法得到的重组酵母菌株。

6.如权利要求5所述的重组酵母菌株，其特征在于，为在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的编号为CGMCCNo.3040的热带假丝酵母。

7.权利要求5或6所述的重组酵母菌株在发酵生产木糖醇中的应用。

8.一种通过权利要求4中所述方法构建的木糖醇脱氢酶突变基因，其特征在于，其序列为：如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。

9.含有权利要求8所述突变基因的表达载体。

10.含有权利要求9所述表达载体的宿主，其特征在于，所述宿主是酵母。

11.权利要求8所述突变基因在构建木糖醇发酵酵母菌株中的应用。

说明书

木糖醇发酵重组酵母菌株的构建方法及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及酵母发酵领域，尤其是涉及利用基因工程突变木糖醇脱氢酶基因，构建木糖醇高转化率的重组酵母菌株的方法及应用。

背景技术

[0002] 木糖醇是一种具有营养价值的甜味物质，是人体糖类代谢的正常中间体，也是防龋齿的最好甜味剂。木糖醇可制成糖尿病人的甜味剂、营养补充剂和辅助治疗剂，在体内缺少胰岛素影响糖代谢情况下，无需胰岛素促进，木糖醇也能透过细胞膜，被组织吸收利用，供细胞以营养和能量，且不会引起血糖值升高，消除糖尿病人服用后的三多症状，是最适合糖尿病患者食用的营养性的食糖代替品。

[0003] 木糖醇的生产方法包括化学催化加氢法和生物转化法。化学催化加氢法生产木糖醇，不仅工艺复杂、安全性差，而且还必须以纯木糖为原料，成本较高。生物法生产木糖醇的原理是利用细胞内的木糖还原酶，将木糖还原为木糖醇。该工艺流程在常温常压下进行，具有能耗低、设备简单、操作安全等特点。目前生物转化法工艺，首先在培养基中加入葡萄糖和木糖，酵母细胞首先利用葡萄糖生长，然后由酵母细胞把木糖转变成木糖醇。现有的工艺所涉及的木糖转化以及木糖醇进一步代谢过程描述如下：

[0004] (1)使用假丝酵母野 生型，木糖转化成 木糖醇最高得率约70 ％，其余的部分再由木糖醇进一步转化成维持酵母细胞生长以及新陈代谢的 营 养 成 分，如 下 式 所 示：

[0005] (2)韩国的Ko采用基因工程的方法，敲除木糖醇脱氢酶基因双拷贝。这种方法在木糖醇转化发酵阶段，因为木糖醇脱氢酶基因缺失，酵母细胞不能产生木糖醇脱氢酶，从而导致木糖醇不能转变成木酮糖，需额外添加价格昂贵的甘油作为碳源，维持酵母细胞生长及新陈代谢。

[0006] 本发明人经多年研究，通过采用基因工程技术突变木糖醇脱氢酶基因，从而构建可获得木糖醇高转化率的重组酵母菌株。所得到的重组酵母菌株中由该突变基因编码的木糖醇脱氢酶变构体酶活力降低，导致木糖醇降解速度减慢，致使木糖产量增加；同时还保证微量的木糖醇继续代谢维持酵母的存活，不必额外添加甘油作为碳源保证酵母细胞的存活，其克服了目前木糖醇生产工艺上的不足，适合工业化生产。

发明内容

[0007] 本发明的第一个目的是提供一种木糖醇发酵重组酵母菌株的构建方法，其主要是采用基因工程技术，使产木糖醇的酵母细胞中木糖醇脱氢酶双拷贝基因中的第一拷贝完全失活，第二拷贝部分失活，其突变基因编码的木糖醇脱氢酶变构体酶活性大大降低，导致木糖醇降解速度减慢，致使木糖产量增加；同时还保证微量的木糖醇继续代谢维持酵母的存活。

[0008] 本发明的第二个目的是提供由上述构建方法构建的重组酵母菌株。

[0009] 本发明的第三个目的是提供一种木糖醇脱氢酶突变基因，其可以直接转化至宿主细胞中，用于构建木糖发酵酵母菌株。

[0010] 本发明涉及木糖代谢的相关基因和其编码的酶，具体描述是木糖醇脱氢酶基因和其编码的木糖醇脱氢酶，来源于热带假丝酵母(Candida Tropicilis)，但也包括产木糖醇其它的酵母：假丝酵母，如季蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)、莫基假丝酵母(Candida mogii)、平滑肌假丝酵母(Candida parasilosisn)；以及部分属于德巴利酵母属，如汉孙德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)；还有管郎酵母属(Pachysolen)。

[0011] 本发明的目的通过以下技术方案来实现：首先提供一种木糖醇发酵重组酵母菌株的构建方法，采用基因工程技术，完全突变产木糖醇酵母细胞中的木糖醇脱氢酶双拷贝基因中的第一拷贝；以及突变第二拷贝3′端的60-150个碱基对。

[0012] 本发明的构建方法，其中所述完全突变酵母细胞中木糖醇脱氢酶双拷贝基因中的第一拷贝的方法可以采用一易筛选的已知的基因对第一拷贝进行替换，以达到使第一拷贝失活的效果，也可以采用其他已知的如基因置换、重组、或移码等手段对第一拷贝进行处理，只要能使其不被表达且不影响其他核苷酸序列表达即可；所述突变第二拷贝3′端60-150碱基对的方法也可以采用一易筛选的已知的基因替换第二拷贝的3′端60-150碱基对，或采用其他已知的如基因置换、重组、或移码等手段对其3′端60-150碱基对进行处理，只要能使第二拷贝能部分表达且维持部分木糖醇脱氢酶活性即可。

[0013] 优选地，本发明采用抗潮霉素B基因来替换第一拷贝，筛选的标记是抗潮霉素B；采用乳清苷酸脱羧酶基因来替换第二拷贝3′端150碱基对，筛选的标记是尿嘧啶营养缺陷型。

[0014] 根据以上方法得到的重组酵母菌株，其木糖醇脱氢酶活性大大降低，导致木糖醇降解速度减慢，致使木糖产量增加；同时还保证微量的木糖醇继续代谢维持酵母的存活，不必额外添加甘油作为碳源保证酵母细胞的存活，可广泛应用在发酵生产木糖醇中。

[0015] 现有技术中发酵生产木糖醇最常用的是热带假丝酵母菌株，本发明最优选利用工业用热带假丝酵母来构建重组酵母菌株，采用上述优选优选构建方法得到重组热带假丝酵母菌株，对其进行PCR产物测序，得到一种木糖醇脱氢酶双拷贝基因的突变基因，其具有SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列，测定表明热带假丝酵母木糖醇脱氢酶基因双拷贝的一个拷贝被抗潮霉素B基因所替换，另一拷贝3′端150碱基对被URA3基因替换，表达产物是C-端50个氨基酸缺失变构体。利用其发酵生产木糖醇，产木糖醇119.2克/升，木糖转化率提高
29.8％，提高了木糖醇的得率。所得的突变基因可通过将其表达并转化在适合的宿主中以得到基因工程菌，构建合适的木糖醇发酵生产菌株，此核苷酸序列在一般情况下经改变、添加和/或缺失一个或多个核苷酸也具有相同功能。由其编码的木糖醇脱氢酶变构体，具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

[0016] 本发明提供的技术方案具有如下优点：采用基因工程技术，首先完全突变酵母中木糖醇脱氢酶两个拷贝中的一个，也就是说使该基因拷贝灭活；然后使另一基因拷贝3′端有一个60-150碱基对缺失，其编码的木糖醇脱氢酶变构体酶活力降低，只相当于正常的木糖醇脱氢酶约1％，导致木糖醇降解速度减慢，致使木糖产量增加；但是还会保证微量的木糖醇继续代谢维持酵母的存活，没有必要额外添加甘油作为碳源保证酵母细胞的存活；这样由木糖生产木糖醇的转化率可提高到99％，从而提高木糖醇的生产效率，降低木糖醇的生产成本。

附图说明

[0017] 图1为本发明实施例中重组热带假丝酵母CP-FY-12的构建原理图；

[0018] 图2为本发明实施例中PCR扩增抗潮霉素B表达单位基因(1520bp)；

[0019] 图3为本发明实施例中构建的质粒pMD-xyl21-HYG-xyl22；

[0020] 图4为本发明实施例中PCR扩增URA3基因(1180bp)；

[0021] 图5为本发明实施例中构建的质粒pMD-xyl23-URA3-xyl24；

[0022] 图6为本发明实施例中PCR重组假丝酵母CP-FY-11的抗潮霉素B基因(1320bp)，其中1：CP-FY-10株，2：CP-FY-11株；

[0023] 图7为本发明实施例中PCR验证重组假丝酵母CP-FY-12木糖醇脱氢酶基因第二拷贝是否是基因缺失变构体(590bp)，其中1：CP-FY-11株，2：CP-FY-12株；

[0024] 图8为本发明实施例中SDS-PAGE电泳分析CP-FY-10株表达木糖醇脱氢酶基因表达产物和CP-FY-12表达木糖醇脱氢酶基因片段缺失变构体表达产物，其中1：CP-FY-10株，2：CP-FY-12株。

具体实施方式

[0025] 下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0026] 一、热带假丝酵母木糖醇脱氢酶双拷贝基因中第一拷贝基因缺失体的构建[0027] 1、pMD-xyl21-HYG-xyl23质粒的构建

[0028] 以pTriEX-2hygro(Novagen公司产品)载体为模板，PCR扩增抗潮霉素B基因表达单位。正向引物如SEQ ID NO.3所示：5′-CCTCCACACT CCAACCTGAA GAATGTATAAA ATAGAACCCAAATGTCGTGA AGGAAGCAGT-3′。斜体字母AAT前面的40个碱基取自木糖醇脱氢酶编码基因5′端前基因序列。碱基序列AATGTCGTGAAGGAAGCAGT取自HYG基因表达单位的5′端。反向引物如SEQID NO.4所示：5′-TCAATCGGGCATT TGACGGCACA GTTACCTGCTCTAACCAAGT TATTAGCCAG AAGTCAGATG-3′。斜体字母TAT前面的43个碱基取自木糖醇脱氢酶编码基因3′端基因序列。碱基序列ATTAGCCAG AAGTCAGATG取自HYG基因表达单位的3′端。PCR反应在50μL总体积中进行，Pfu酶作为扩增反应的酶。反应条件为在94℃变性5min后开始循环，然后94℃变性60s，58℃退火1min，72℃延伸5min，共30个循环后，再于72℃延伸10min。添加Taq酶后继续72℃保温5min。电泳分析PCR产物(图2)。纯化PCR产物，该产物于T-载体进行连接。转化DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒后进行双酶切分析验证，并进行DNA测序鉴定。构建的表达质粒被称为pMD-xyl21-HYG-xyl22质粒(图3)。

[0029] 2、热带假丝酵母木糖醇脱氢酶双拷贝基因中第一拷贝缺失体的构建[0030] (1)菌体的准备：挑取酵母CP-FY-10单菌落，接种至含有5ml YPD培养基的50ml三角瓶中，30℃、250～300r/min培养过夜。取100～500μl的培养物接种至含有500ml新鲜培养基的2L三角摇瓶中，28～30℃、250～300r/min培养过夜，至OD600达到1.3～1.5。将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用500ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬。
按上述步骤，用250ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬。然后用20ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬备用。

[0031] (2)电击转化：将5～20μg pMD-xyl21-HYG-xyl22质粒线性化DNA溶解在5～10μl TE溶液中，与80μl的上述备用的菌体混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中。将电转化杯冰浴5min。电转化条件：电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω。电击完毕后，加入
1ml冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5ml的EP管中。将菌体悬液涂布于MD或RDB平板上，每200～600μl涂布一块平板(潮霉素B100μg/mL)。将平板置于30℃培养，直至单个菌落出现。抗潮霉素B的酵母被命名为CP-FY-11。

[0032] (3)PCR验证重组假丝酵母CP-FY-11基因组DNA含抗潮霉素B基因酵母株CP-FY-11的培养和基因组DNA提取参照上述步骤2(1)和下述步骤二中的操作1(1)。正向引物如SEQ ID NO.5所示：5′-AGAATGTATAA ATAGAACCCA-3′，该序列取自木糖醇脱氢酶基因5′端前序列。反向引物如SEQ ID NO.6所示：5′-CGGCCATTGTCCGTCAGGAC 3′，该序列取自抗潮霉素B基因。PCR反应方法参照上述步骤1，CP-FY-10作为对照组。PCR产物电泳分析表明：CP-FY-11组在1320bp处出现电泳条带，并与预计的大小相符；而对照组无电泳条带出现(图6)。试验表明：假丝酵母木糖醇脱氢酶基因双拷贝的一个拷贝被抗抗潮霉素B基因所替换，也就是说木糖醇脱氢酶基因的一个拷贝被敲除。

[0033] 二、热带假丝酵母木糖醇脱氢酶双拷贝基因中第一拷贝缺失，第二拷贝基因片段缺失的变构体的构建

[0034] 1、pMD-xyl21-URA3-xy22质粒的构建

[0035] (1)热带假丝酵母基因组DNA提取：取1.5mL对数生长期酵母细胞离心(12000rpm)1-2min。沉淀溶于590μlSE缓冲液中混匀，加入10μl溶菌酶，37℃保温1hr。然后离心(12000rpm)8-10min。沉淀部分溶于100μL，0.5μl蛋白酶K，混匀，37℃保温1hr。
加入1.2ml的CTAB/NaCL，200μl20％PVP混匀65℃保温30min，加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液，混匀，然后离心，12000rpm，4-5min。去除液体部分，保留沉淀部分待干燥后，加入200ml TE缓冲液复溶。

[0036] (2)热带假丝酵母URA3基因的扩增：根据Haas报道，使用PCR方法扩增1200bp热带假丝酵母URA3基因片段。以上述提取假丝酵母基因组DNA(1μg)为PCR反应模板，正向引物如SEQ ID NO.7所示：5′-CTTGGACCAGACTGAGAATG-3′。反向引物如SEQ ID NO.8所示：5′-AGGGCGAATGTGACGTGGTT-3′。PCR反应在50μL总体积中进行，反应条件为在94℃变性5min后开始循环，然后94℃变性50s，58℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环后，再于72℃延伸10min。

[0037] (3)pMD-URA3质粒的构建：凝胶回收上述PCR产物。通过凝胶回收试剂盒回收，然后与pMD18-T进行连接(16℃，16h)，转化DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒后进行双酶切分析验证，并进行DNA测序鉴定。构建的质粒被称为pMD-URA3。

[0038] pMD-xyl21-URA3-xy22质粒的构建：以pMD-URA3质粒为模板，正向引物如SEQ ID NO.9所示：5′-AGATATGGTTACGGTGACTACCAAAATTCAATTGATATTTTAGACTAGATAGTAACGAAAGAATAAACAAGAATAAGTTTGATCTGGTTTGGATTGTTGGAG-3′，该引物TAG前端碱基序列为木糖醇脱氢酶缺失变构体(含N-端315个氨基酸，完整木糖醇脱氢酶含有365氨基酸)C-端的编码基因，TAG为终止密码子，ATAGTAACGA AAGAATAAACAAGAATAAGTT是连接序列，并含有AATAA序列，连接序列后为URA3基因序列。反向引物如SEQ ID NO.10所示：5′-ACAAAAATCAAACTCTATCTTTTTACTCGTACTATGCACTCCTATATAGGGCGAATGTGACGTGGTT-3 ′，其 中ACAAAAATCAAACTC TATCTTTTTACTCGTACTATGCACTCCTATA序列为木糖醇脱氢酶3′序列，AGGGCGAATGTGACGTGGTT是URA3序列。PCR反应在50μL总体积中进行，Pfu酶作为扩增反应的酶。反应条件为在94℃变性5min后开始循环，然后94℃变性60s，58℃退火1min，72℃延伸3min，共30个循环后，再于72℃延伸10min。添加Taq酶后继续72℃保温5min。电泳分析PCR产物(图4)。纯化PCR产物，该产物于T-载体进行连接。转化DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆，提取质粒后进行双酶切分析验证，并进行DNA测序鉴定。构建的表达质粒被称为pMD-xyl23-URA3-xyl24质粒(图5)。

[0039] 2、假丝酵母木糖醇脱氢酶缺陷株CP-FY-12的构建：

[0040] (1)CP-FY-11 URA3基因缺失株的构建：取适量热带假丝酵母CP-FY-11，酵母细胞均匀涂特定培养基平板上。30℃培养2-3天。凡是在该平板上生长的酵母细胞株均为URA3缺陷型株。每升特定培养基有以下营养成分：酵母氮源7克，5-氟乳清酸1克，尿嘧啶50毫克，葡萄糖20克。

[0041] (2)菌体准备和电转化方法：具体操作参照上述步骤一中2(1)和2(2)。

[0042] (3)木糖醇脱氢酶缺陷株CP-FY-12的筛选：上述电转化后的酵母细胞细胞均匀涂特定培养基平板上。30℃培养2-3天。凡是在该平板上生长的酵母细胞株均为URA3株，被命名为CP-FY-12。特定培养基平板(升)有以下成分：酵母氮源7克，葡萄糖20克，2％的琼脂粉。

[0043] (3)PCR验证重组假丝酵母CP-FY-12木糖醇脱氢酶基因第二拷贝是否是基因缺失变构体。酵母株CP-FY-12的培养和基因组DNA提取参照步骤一中2(1)和步骤二中1(1)。正向引物如SEQ ID NO.11所示：5′-TGATTTCTCAACCAGAGAAT-3′，该序列取自木糖醇脱氢酶基因序列。反向引物如SEQ ID NO.12所示：5′-TGGTCTTTTTGGACTCCATT3′，该序列取自抗潮霉素B基因。PCR反应方法参照上述技术方案，CP-FY-11作为对照组。PCR产物电泳分析表明(图7)：CP-FY-12试验组无电泳条带出现，590bp处出现电泳条带，并与预计的大小相符；而CP-FY-11作为对照组无电泳条带出现。对PCR的产物测序测定表明：説明木糖醇脱氢酶基因第二拷贝编码基因第945个碱基处出现终止密码子TAG，终止密码子TAG后基因片段已被URA3基因替换。结合上述技术方案，试验组对潮霉素B的抗性以及对潮霉素B抗性基因PCR的验证，以及尿嘧啶营养缺陷型转变为非营养缺血型。综上所述，假丝酵母木糖醇脱氢酶基因双拷贝的一个拷贝被抗抗潮霉素B基因所替换，另一拷贝3′端150碱基对被URA3基因替换，表达产物是C-端50个氨基酸缺失变构体。

[0044] 检测得到热带假丝酵母CP-FY-12木糖醇脱氢酶基因突变变构体的基因序列如SEQ ID NO.1所示；其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

[0045] 本实施例得到的热带假丝酵母CP-FY-12已在菌种保藏单位保藏，保藏信息如下：

[0046] 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；

[0047] 地址：中国北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮编100101；

[0048] 保藏日期：2009年4月27日

[0049] 保藏编号：CGMCC No.3040

[0050] 命名：热带假丝酵母(Candida tropicalis)

[0051] 三、CP-FY-10的木糖醇脱氢酶和CP-FY-12假丝酵母(CGMCCNo.3040)产生木糖醇脱氢酶变构的分离纯化

[0052] (1)假丝酵母CP-FY-10接种于YPD培养基生长12小时，按5％的接种量接种于发酵培养基中。发酵培养基组成如下(升)：K2HPO4 1g，NaCl 0.1，MgSO4 0.5g，CaCl2 0.1g，酵母粉2g，木糖20克，pH 5.0。发酵12h。取2000ml发酵液，4℃离心收集菌体，菌体用含500ml(1mm EDTA)双蒸水洗涤后，4℃离心收集菌体。-20℃冻融两次，然后用500ml(10mmol，pH7.4)磷酸钾缓冲液重新悬浮冻菌体，4℃高压匀浆菌体，4℃，12000rpm离心，收集上清部分。上清部分过NAD-agarose亲和层析柱，用上述磷酸钾缓冲液洗杂蛋白，然后用含5mM NAD上述磷酸钾缓冲液特异性洗脱木糖醇脱氢酶，并收集作进一步的电泳分析和酶活力测定。

[0053] (2)CP-FY-12假丝酵母产生木糖醇脱氢酶变构体的分析纯化参照上述。

[0054] (3)上述两组分离纯化的木糖醇脱氢酶样品进行SDS-PAGE分析，具体方法参照《分子克隆》。电泳分析结果表明：CP-FY-12木糖醇脱氢酶的电泳条带比CP-FY-10组位置低，説明分子量较CP-FY-10小。电泳结果与预期结果相符。

[0055] 四、木糖醇脱氢酶变构体酶活力测定及比较

[0056] 木糖醇脱氢酶变构体酶活力检测：1个酶活力单位定义为在25℃1分钟使1μmol NADH氧化成NAD的酶量。酶的比活(表1)：每毫克酶蛋白的活力单位数(U/mg)。酶的蛋白质测定采用考马斯亮蓝法，具体方法参考《分子克隆》第三版。结果见表1：

[0057] 表1木糖醇脱氢酶野生型与50氨基酸缺失变构体的酶活力比较

[0058]

[0059] 五、培养于非选择培养基中重组假丝酵母株CP-FY-12第1、10、20、30、40和45代木糖转化木糖醇试验

[0060] 将重组假丝酵母株CP-FY-12第5、10、20、30、40和45代接种于YPD培养基(含葡萄糖5克/升、木糖50克/升)木糖中微氧发酵45小时。发酵终止后分别测定葡萄糖、木糖和木糖醇的浓度(表2)。结果表明在非选择培养中培养45代后，木糖醇的得率和转化率没有改变。结果见表2：

[0061] 表2不同代数CP-FY-12株发酵终止时葡萄糖、木糖和木糖醇的浓度测定[0062]

[0063] 六、以重组酵母株CP-FY-12(CGMCC No.3040)发酵生产木糖醇

[0064] 使用前将假丝酵母菌株CP-FY-12划到YPD平板上1-2次活化处理。发酵参数：接种量为10％。葡萄糖浓度为12g，木糖浓度为120g，发酵温度为30℃，pH为6.0。与目前发酵工业的酵母发酵一样，在培养基中添加一定量的营养盐类和微量元素，发酵48小时，每4小时取样一次，并进行相应的检测。

[0065] 检测包括葡萄糖、木糖的消耗量、木糖醇的生成、菌体量。最后对野生假丝酵母和重组假丝酵母发酵的上述指标进行比较。

[0066] 通用对野生假丝酵母和重组假丝酵母发酵试验比较(表3)，重组假丝酵母株试验组最后的木糖醇含量为119.2克/升，转化率为99.3％，菌体量为14.9(OD值)；在发酵45小时木糖醇的得率最高，木糖醇含量为119.2克/升，转化率为99.3％，菌体量为15.1(OD值)而野生假丝酵母组最后的木糖含量为78.1克/升，转化率为65.6％，菌体量为14.7(OD值)。在发酵45小时木糖醇的得率最高，然后有下降趋势。在发酵45小时木糖醇的得率最高，木糖醇含量为83.4克/升，转化率为69.5％，菌体量为14.9(OD值)上述结果表明：重组假丝酵母组木糖转化率提高29.8％，产木糖醇119.2克/升。试验结果表明重组假丝酵母CP-FY-12株提高了木糖醇的得率。结果见表3：

[0067] 表3野生假丝酵母CP-FY-10(1)和重组假丝酵母CP-FY-12(2)发酵产木糖醇试验[0068]

[0069] 从发酵培养基中取出含有目的产物的样品1ml至1.5ml，样品保存于1.5ml的Eppendort管中，然后离心取上清，将上清稀释十倍，根据下面提供的条件用Angilent系统通过高效液相色谱(HPLC)分析得到稀释样品的木糖醇、木糖和葡萄糖的含量。

[0070] 层析柱：伯乐HPX-87H

[0071] 移动相：0.005M H2SO4

[0072] 流速：0.5mi/ml

[0073] 温度：60℃

[0074] 检测：RI检测器

[0075] 样品体积：20μl

[0076] 由以上实施例可以看出，本发明实施例通过采用构建重组热带假丝酵母菌株为例，采用基因工程技术，首先使热带假丝酵母中木糖醇脱氢酶两个拷贝中的第一拷贝被抗潮霉素B基因替换，使该基因拷贝灭活；然后采用乳清苷酸脱羧酶基因来替换第二拷贝3′端150碱基对，筛选的标记是尿嘧啶营养缺陷型，使其编码的木糖醇脱氢酶变构体酶活力降低，该木糖醇脱氢酶变构体的酶活力只相当于正常的木糖醇脱氢酶约1％，导致木糖醇降解速度减慢，致使木糖产量增加；但是还会保证微量的木糖醇继续代谢维持酵母的存活，没有必要额外添加甘油作为碳源保证酵母细胞的存活；同时由木糖生产木糖醇的转化率可提高到99％。从而提高木糖醇的生产效率，降低木糖醇的生产成本。

[0077] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

[0078] 序列表

[0079] <110>安徽丰原发酵技术工程研究有限公司

[0080] <120>木糖醇发酵重组酵母菌株的构建方法及应用

[0081] <130>

[0082] <160>12

[0083] <170>PatentIn version 3.5

[0084] <210>1

[0085] <211>948

[0086] <212>DNA

[0087] <213>人工序列

[0088] <400>1

[0089] atgactgcaa acccatcatt agttcttaac aaagttgacg atatttcctt tgaagaatac 60[0090] gaagctccaa aactcgaatc accaagagat gtcattgttg aagttaagaa aactggtatc 120[0091] tgtggatcag atatccatta ctatgcccat ggttcaattg gtccatttat tttaagaaaa 180[0092] ccaatggttt taggtcacga atcagcaggt gttgtttctg ctgtcggaag tgaagttacc 240[0093] aacttgaagg ttggtgatag agttgccatt gaacctggtg taccttcaag atttagtgat 300[0094] gagaccaaat ctggtcatta tcatttgtgc ccacatatgt cttttgccgc caccccacca 360[0095] gttaacccag atgaaccaaa tcctcaaggt actttatgta aatactacag agtcccatgt 420[0096] gactttttat tcaaattacc agatcatgtt tctttggagt tgggtgctat ggttgaacca 480[0097] ttaactgttg gtgtccacgg ttgtaaattg gctgatttga aatttggtga agacgttgtt 540[0098] gtttttggtg ccggtccagt tggtttgttg accgctgccg ttgctagaac aattggtgct 600[0099] aaaagagtca tggttgttga tatttttgac aacaaattga agatggcaaa agatatgggt 660[0100] gctgccactc atattttcaa ctcaaaaacc ggtggtgatt atcaagattt gatcaagagt 720[0101] tttgatggtg ttcaaccttc agttgttttg gaatgtagtg gtgctcaacc atgtatctat 780[0102] atgggtgtta aaatcttgaa agctggtggt agatttgttc aaattggtaa tgccggtggt 840[0103] gatgtcaatt tcccaattgc tgatttctca accagagaat tggcattata tggttctttc 900[0104] agatatggtt acggtgacta ccaaacttca attgatattt tagactag 948[0105] <210>2

[0106] <211>315

[0107] <212>PRT

[0108] <213>木糖醇脱氢酶变构体

[0109] <400>2

[0110] Met Thr Ala Asn Pro Ser Leu Val Leu Asn Lys Val Asp Asp Ile Ser[0111] 1 5 10 15[0112] Phe Glu Glu Tyr Glu Ala Pro Lys Leu Glu Ser Pro Arg Asp Val Ile[0113] 20 25 30

[0114] Val Glu Val Lys Lys Thr Gly Ile Cys Gly Ser Asp Ile His Tyr Tyr[0115] 35 40 45

[0116] Ala His Gly Ser Ile Gly Pro Phe Ile Leu Arg Lys Pro Met Val Leu[0117] 50 55 60

[0118] Gly His Glu Ser Ala Gly Val Val Ser Ala Val Gly Ser Glu Val Thr[0119] 65 70 75 80[0120] Asn Leu Lys Val Gly Asp Arg Val Ala Ile Glu Pro Gly Val Pro Ser[0121] 85 90 95[0122] Arg Phe Ser Asp Glu Thr Lys Ser Gly His Tyr His Leu Cys Pro His[0123] 100 105 110

[0124] Met Ser Phe Ala Ala Thr Pro Pro Val Asn Pro Asp Glu Pro Asn Pro[0125] 115 120 125

[0126] Gln Gly Thr Leu Cys Lys Tyr Tyr Arg Val Pro Cys Asp Phe Leu Phe[0127] 130 135 140

[0128] Lys Leu Pro Asp His Val Ser Leu Glu Leu Gly Ala Met Val Glu Pro[0129] 145 150 155 160[0130] Leu Thr Val Gly Val His Gly Cys Lys Leu Ala Asp Leu Lys Phe Gly[0131] 165 170 175[0132] Glu Asp Val Val Val Phe Gly Ala Gly Pro Val Gly Leu Leu Thr Ala[0133] 180 185 190

[0134] Ala Val Ala Arg Thr Ile Gly Ala Lys Arg Val Met Val Val Asp Ile[0135] 195 200 205

[0136] Phe Asp Asn Lys Leu Lys Met Ala Lys Asp Met Gly Ala Ala Thr His[0137] 210 215 220

[0138] Ile Phe Asn Ser Lys Thr Gly Gly Asp Tyr Gln Asp Leu Ile Lys Ser[0139] 225 230 235 240[0140] Phe Asp Gly Val Gln Pro Ser Val Val Leu Glu Cys Ser Gly Ala Gln[0141] 245 250 255[0142] Pro Cys Ile Tyr Met Gly Val Lys Ile Leu Lys Ala Gly Gly Arg Phe[0143] 260 265 270

[0144] Val Gln Ile Gly Asn Ala Gly Gly Asp Val Asn Phe Pro Ile Ala Asp[0145] 275 280 285

[0146] Phe Ser Thr Arg Glu Leu Ala Leu Tyr Gly Ser Phe Arg Tyr Gly Tyr[0147] 290 295 300

[0148] Gly Asp Tyr Gln Thr Ser Ile Asp Ile Leu Asp

[0149] 305 310 315

[0150] <210>3

[0151] <211>61

[0152] <212>DNA

[0153] <213>人工序列

[0154] <400>3

[0155] cctccacact ccaacctgaa gaatgtataa aatagaaccc aaatgtcgtg aaggaagcag 60[0156] t 61[0157] <210>4

[0158] <211>63

[0159] <212>DNA

[0160] <213>人工序列

[0161] <400>4

[0162] tcaatcgggc atttgacggc acagttacct gctctaacca agttattagc cagaagtcag 60[0163] atg 63[0164] <210>5

[0165] <211>21

[0166] <212>DNA

[0167] <213>人工序列

[0168] <400>5

[0169] agaatgtata aatagaaccc a 21[0170] <210>6

[0171] <211>20

[0172] <212>DNA

[0173] <213>人工序列

[0174] <400>6

[0175] cggccattgt ccgtcaggac 20[0176] <210>7

[0177] <211>20

[0178] <212>DNA

[0179] <213>人工序列

[0180] <400>7

[0181] cttggaccag actgagaatg 20[0182] <210>8

[0183] <211>20

[0184] <212>DNA

[0185] <213>人工序列

[0186] <400>8

[0187] agggcgaatg tgacgtggtt 20[0188] <210>9

[0189] <211>102

[0190] <212>DNA

[0191] <213>人工序列

[0192] <400>9

[0193] agatatggtt acggtgacta ccaaaattca attgatattt tagactagat agtaacgaaa 60[0194] gaataaacaa gaataagttt gatctggttt ggattgttgg ag 102[0195] <210>10

[0196] <211>67

[0197] <212>DNA

[0198] <213>人工序列

[0199] <400>10

[0200] acaaaaatca aactctatct ttttactcgt actatgcact cctatatagg gcgaatgtga 60[0201] cgtggtt 67[0202] <210>11

[0203] <211>20

[0204] <212>DNA

[0205] <213>人工序列

[0206] <400>11

[0207] tgatttctca accagagaat 20[0208] <210>12

[0209] <211>20

[0210] <212>DNA

[0211] <213>人工序列

[0212] <400>12

[0213] tggtcttttt ggactccatt 20