生菜MPBQMT蛋白编码序列

摘要

本发明涉及一种基因工程技术领域的生菜MPBQ MT蛋白编码序列。它包括：编码具有生菜MPBQ MT蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列由SEQIDNO.3中第162-1175位的核苷酸序列构成，至少70％的同源性。本发明转化入植物提高植物维生素E含量的方法：将编码具有生菜MPBQ MT蛋白活性的多肽的纯化的核苷酸序列连于植物表达调控序列，形成含生菜MPBQ MT蛋白基因的植物表达载体；将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌，将含表达载体的农杆菌通过浸花法转化拟南芥；再通过抗生素筛选，获得含有生菜MPBQ MT蛋白基因的转化细胞并最终再生转基因植株及其包括植物种子及植物组织的后代。本发明将所说的基因在植物中表达，所获得的转基因植物中维生素E的含量有了显著的提高。

权利要求

1.一种生菜MPBQ MT蛋白，其特征在于，所述蛋白的多肽的核苷酸序列如SEQID NO.3中第162-1175位所示。

2.如权利要求1所述的生菜MPBQ MT蛋白，其特征是，所述蛋白的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.如权利要求2所述的蛋白的转化入拟南芥提高植物维生素E含量的方法，其特征是，步骤如下：(1)将SEQ ID NO.3中第162-1175位连于植物表达调控序列，形成含生菜MPBQMT蛋白基因的植物表达载体；

(2)将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌，将含表达载体的农杆菌通过浸花法转化拟南芥；

(3)再通过抗生素筛选，获得含有生菜MPBQ MT蛋白基因的转化细胞并最终再生转基因植株及其包括植物种子及植物组织的后代。

说明书

生菜MPBQ MT蛋白编码序列

技术领域

[0001] 本发明涉及的是一种基因工程技术领域的蛋白编码序列，具体地，本发明涉及一种生菜MPBQ MT蛋白编码序列。

背景技术

[0002] 自1922年维生素E的生物学功能被发现后，长期医学研究表明，维生素E不仅仅与生殖系统有关，而且与中枢神经系统、消化系统、心血管系统和肌肉系统的正常代谢都有密切关系(Traber and Sies，1996)。维生素E是一种脂类维生素，其天然产物依结构的不同分为八种类型，分别是α、β、γ、δ-生育酚(tocopherol)和α、β、γ、δ-生育三烯酚(tocotrienol)，其中α-生育酚的生物活性最高，被认为是维生素E的主要活性成分。维生素E参与细胞膜的构建和维持，是动物和人体内重要的抗氧化物质。维生素E是治疗冠心病、动脉粥样硬化等心脑血管疾病的重要辅助性药物，有助于降低血脂和血胆固醇含量，抗凝血、抗氧化并且消除自由基，从而起到预防及治疗血管栓塞的作用。维生素E对于提高机体免疫能力有着重要的影响，具有抗衰老的功能，可以消除细胞色素沉淀，改善皮肤弹性，减弱性腺萎缩，因而在大量保健品和美容用品中广泛使用。维生素E可以预防和治疗多种妇科疾病，治疗早产儿溶血性贫血和蚕豆病，治疗营养不良儿童的巨幼红细胞性贫血。维生素E可以促进胆汁分泌、胆管形成和胆红素分泌，对急慢性肝炎和肝硬化有着治疗作用。
维生素E可以预防癌症发生，对于癌症患者的治疗也有重要的辅助作用。

[0003] 维生素E对于人类和动物健康有重要作用，但维生素E的合成途径只存在于绿色光合植物中，包括低等单细胞植物蓝藻和高等植物；人体和动物体内不存在维生素E合成途径，故而日常营养所需的维生素E摄取自绿色植物，特别是各种油类作物的种子，以及由种子所榨取的植物油。

[0004] 直接由植物油脱臭馏出物中获得的生育酚混缩液的生物活性很低，α-生育酚的含量较低。工业生产维生素E主要是以上述生育酚混缩液为原料，经过半合成法，将其中的非α-生育酚成分转变为α-生育酚。但是成本较高，而且产生的α-生育酚消旋性与天然α-生育酚不同，活性也低于天然α-生育酚。因此，提高植物天然生育酚含量及其α-生育酚比例具有很重要的应用价值。

[0005] 随着近年来植物基因组学的发展，DellaPenna于1999年提出了营养基因组学(nutritional genomics)的概念，即充分的利用基因组学的研究成果，分离植物营养代谢途径的关键酶基因，解析植物微量营养素代谢途径，深入了解代谢途径的调控方式，从而利用代谢工程的方法和手段改良作物品质，提高作物营养价值。

[0006] 基于基因组学的基础，维生素E合成途径的基因分离、克隆和功能性研究已经取得了突破性的进展。人们已经初步完成了对参与维生素E合成途径关键基因的分离和功能验证工作，初步分析了维生素E(生育酚)合成途径概貌。

[0007] 维生素E(生育酚)合成途径主要由以下五个步骤组成。(1)4-羟苯丙酮酸(HPP)在4-羟苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)的催化下，生成尿黑酸(HGA)(Norriset al.，1998)；(2)尿黑酸在尿黑酸植基转移酶(HPT)催化下，与植基二磷酸(PDP)发生缩合，生成2-甲基-6-植基-苯醌(Collakova and DellaPenna，2001)；(3)2-甲基-6-植基-苯醌在甲基植基苯醌甲基转移酶(MPBQ MT)的催化下，生成2，3-二甲基-6-植基-苯醌(van Eenennaam et al.，2003)；(4)2，3-二甲基-6-植基-苯醌在生育酚环化酶(TC)的催化下，生成γ-生育酚(Porfirova et al.，2002)；(5)γ-生育酚在γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)的催化下，生成α-生育酚。

[0008] 在对现有技术文献的分析中，至今尚未发现有利用基因工程技术对生菜提高植物中维生素E含量的技术措施，也未发现与本发明提及的生菜MPBQ MT蛋白序列及其核酸序列相关的报道。

发明内容

[0009] 本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种生菜MPBQ MT蛋白编码序列。该基因编码甲基植基苯醌甲基转移酶(MPBQ MT)，它参与维生素E的合成代谢途径；生菜MPBQ MT蛋白在利用转基因技术提高植物维生素E上的应用。

[0010] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0011] 在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，该分子包括：编码具有生菜MPBQ MT蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列由SEQ ID NO.3中第162-1175位的核苷酸序列构成，至少70％的同源性。

[0012] 所述的核苷酸序列由SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物构成。

[0013] 所述的多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。

[0014] 在本发明的另一方面，还提供了一种利用具有生菜MPBQ MT蛋白核苷酸序列转化入提高植物维生素E含量的方法，其步骤如下：

[0015] (1)将编码具有生菜MPBQ MT蛋白活性的多肽的纯化的核苷酸序列连于植物表达调控序列，形成含生菜MPBQ MT蛋白基因的植物表达载体；

[0016] (2)将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌，将含表达载体的农杆菌通过浸花法转化拟南芥；

[0017] (3)再通过抗生素筛选，获得含有生菜MPBQ MT蛋白基因的转化细胞并最终再生转基因植株及其包括植物种子及植物组织的后代。

[0018] 含有生菜MPBQ MT蛋白基因的转基因植株中维生素E的含量有了显著提高。

[0019] 较佳地，在该方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO.3中第162-1175位的序列。

[0020] 在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

[0021] 在本发明中，术语“生菜MPBQ MT蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有生菜MPBQ MT蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第162-1175位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框第162-1175位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。

[0022] 该术语还包括能编码具有与天然的生菜MPBQ MT相同功能的蛋白的SEQ ID NO.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

[0023] 在本发明中，术语“生菜MPBQ MT蛋白(或多肽)”指具有生菜MPBQ MT活性的SEQ ID NO.4序列的多肽。该术语还包括具有与生菜MPBQ MT相同功能的、SEQ IDNO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。

[0024] 本发明的生菜MPBQ MT蛋白的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与编码生菜MPBQ MT蛋白的DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗生菜MPBQMT蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。

[0025] 在本发明中，“生菜MPBQ MT蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.4的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。如下表1[0026]最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu

[0027] 发明还包括生菜MPBQ MT蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然的生菜MPBQMT相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

[0028] 修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

[0029] 在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的生菜MPBQMT蛋白多肽时，可以将生菜MPBQMT蛋白编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成生菜MPBQ MT蛋白表达载体。

[0030] 如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

[0031] 在本发明中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、拟南芥细胞和其它植物细胞。

[0032] 此外，根据本发明的生菜MPBQ MT的核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选生菜MPBQ MT蛋白相关同源基因或同源蛋白。

[0033] 本发明的生菜MPBQ MT相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

[0034] 一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

[0035] 此外，还可用人工化学合成的方法来合成有关序列。在本申请之前，现有技术已完全可以通过先合成多个多核苷酸小片段，然后再进行连接而获得编码本发明中生菜MPBQ MT相关蛋白的核酸序列。然后，可将该核酸序列引入本领域中各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

[0036] 除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH FreemanCo.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

[0037] 利用本发明的生菜MPBQ MT蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与MPBQ MT蛋白发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。

[0038] 本发明中所涉及的农杆菌为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101，该菌株可以从市场上公开购买(来源于澳大利亚CAMBIA公司，菌株编号为Gambar3)。

附图说明

[0039] 图1为本发明的生菜MPBQ MT蛋白的氨基酸序列与其他植物物种中MPBQ MT相关蛋白的氨基酸序列的同源比较列表。其中，相同的氨基酸在不同多肽序列之间用氨基酸单字符标出。

具体实施方式

[0040] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0041] 实施例1

[0042] 生菜MPBQ MT基因的克隆

[0043] 1.RNA的提取(RNA extraction)

[0044] 取生菜叶片组织，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的1.5mL Eppendorf(EP)离心管中，充分振荡后，按照TIANGEN试剂盒的说明书抽提总RNA。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

[0045] 2.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)

[0046] 根据拟南芥中相关基因所编码的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)方法(Clontech)试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行：

[0047] (1)首链cDNA的合成：

[0048] 利用Clontech试剂盒所提供的5’-CDS primer A和SMART2 A oligo引物，以所提取的总RNA为模板，在PowerScript反转录酶的作用下合成5’-RACE-ReadycDNA；利用Clontech试剂盒所提供的3’-CDS primer A为引物，以所提取的总RNA为模板，在PowerScript反转录酶的作用下合成3’-RACE-Ready cDNA。

[0049] (2)3’-RACE

[0050] 用Clontech试剂盒提供的通用引物序列(UPM)和利用拟南芥同源区设计的基因特异引物2(GSP2)(SEQ ID NO.1)进行3’-RACE PCR反应。用琼脂糖凝胶电泳进行检测并对产物进行胶回收，将胶回收的目的片段连接到pMD18-T载体上进行测序。

[0051] (3).5’-RACE

[0052] 用Clontech试剂盒提供的通用引物序列(UPM)和利用拟南芥同源区设计的基因特异引物1(GSP1)(SEQ ID NO.2)进行5’-RACE PCR反应。用琼脂糖凝胶电泳进行检测并对产物进行胶回收，将胶回收的目的片段连接到pMD18-T载体上进行测序。

[0053] 将测序结果的重叠区拼接，得到该基因的完整编码区序列。

[0054] BLAST分析结果证明从生菜中得到的基因确为一个MPBQ MT的相关基因。

[0055] 通过上述步骤，获得了生菜中参与维生素E合成的MPBQ MT蛋白的全长编码序列(SEQ ID NO.3)。其中，(ATG)与终止密码子(TGA)在SEQ ID NO.3中用下划线标出。

[0056] 实施例2

[0057] 生菜MPBQ MT相关基因的序列信息与同源性分析

[0058] 本发明中得到的新的生菜MPBQ MT的全长cDNA长度为1328bp，详细序列见SEQID NO.3，其中开放阅读框位于162-1175位核苷酸(1014个核苷酸)。根据所获得的cDNA推导出生菜MPBQ MT的氨基酸序列，共337个氨基酸残基，分子量为38006.10，等电点为9.07。详细序列见SEQ ID NO.4。

[0059] 利用vectorNTI 9.0软件对来源于各种植物的MPBQ MT的相关氨基酸序列进行同源比对，结果发现，克隆到的生菜MPBQ MT基因与拟南芥(Arabidopsisthaliana)，油菜(Brassica napus)，衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)，葡萄(Vitis vinifera)，向日葵(Helianthus annuus)中MPBQ MT-1和MPBQ MT-2以及水稻(Oryza sativa)中同源基因所编码的氨基酸序列相似性分别为：76％，76％，58％，77％，84％，86％和70％(图1)。由此可见，生菜MPBQ MT基因与拟南芥等物种中的MPBQMT相关基因在所编码的氨基酸水平上存在较高的同源性，可以认为它们的产物在功能上也有很高的相似性。

[0060] 实施例3

[0061] 生菜MPBQ MT相关蛋白或多肽在拟南芥细胞中进行真核细胞表达及转基因植株的维生素E含量鉴定

[0062] 1.含目的基因(生菜MPBQ MT基因)的表达载体的构建

[0063] 根据生菜MPBQ MT的全长编码序列(SEQ ID NO.3)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在正反引物上分别引入BamH1和Sac1限制性内切酶位点，以便构建表达载体。以实施例1中获得的5’-RACE-Ready cDNA为模板，经PCR扩增后，将生菜MPBQ MT的编码区序列连接至中间载体pMD18-T中进行测序，再将测序正确的MPBQ MT的编码区序列进一步克隆到表达载体pHB中，接着将其转入根癌农杆菌(如GV3101，本实施例中所用为英国诺丁汉大学所赠)，并进行PCR验证。结果表明，含生菜MPBQ MT基因的植物表达载体已成功构建到根癌农杆菌菌株中。采用浸花(floral-dip)法转化拟南芥。

[0064] 2.采用浸花(floral-dip)法转化拟南芥

[0065] 1)取生长一个月左右、生长状况良好的植株(转化前可以提前一个星期将植物去顶，使植物产生较多的花苞，提高转化效率)，转化前一天浇水；

[0066] 2)将含有转基因载体的农杆菌于28℃培养过夜，至OD600≈2.0，4,500rpm离心10min；

[0067] 3)菌体沉淀悬浮于新鲜配制的转化液中，至终浓度OD600≈0.8；

[0068] 4)转化时小盆倒置，确保拟南芥地上部分全部花苞都被浸没入事先用转化Buffer悬浮好的菌液中约5sec；

[0069] 5)用吸水纸吸去多余的液体，将植物平放于一个密封的小盒内以保持湿度，避光过夜；

[0070] 6)第二天将植物取出，竖直，转移到正常条件下生长。待植物长至一定程度后，将其依附竹签绑好，以便更好地结实；

[0071] 7)T0代种子成熟后将其整株剪下，过筛。种子铺于含50μg/mL潮霉素(Hyg)的筛选培养基上，4℃春化48h，移到人工气候室24h连续光照条件下生长一周；

[0072] 8)待长出绿色的转基因抗性幼苗(转化子为绿色的幼苗且根较长；非转化子基本为黄化苗，或绿色无根幼苗)后移栽入土继续生长；

[0073] 9)单株收获转基因植株(因转基因的插入位点不同，每个都是不同的)标成不同的株系；

[0074] 10)单株收获的T2代种子已经出现性状分离。将种子均匀地铺到9cm平板上，因要确定是否是单位点插入，所以不加抗生素。待长至6-7片真叶后，喷除草剂，筛选3∶1单位点插入的株系，单株收获。继续筛选直至获得纯合的转基因植株。

[0075] 3.转基因拟南芥植株的PCR检测

[0076] 根据CaMV 35S的序列设计正向引物，根据MPBQ MT的序列设计反向引物对目的基因进行检测。结果表明，用CaMV 35S正向引物和MPBQ MT反向引物能扩增出目的基因大小的特异DNA片段。而以非转化拟南芥基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。

[0077] 实施例4

[0078] 利用HPLC-UVD测定转基因拟南芥中维生素E含量

[0079] 1.HPLC-UVD条件及系统适用性以及标准溶液的配制

[0080] HPLC：采用Waters 2695 separations module系统，色谱柱为C-18反相硅胶柱(Calesil ODS-100C18，4.6mm I.D.×250mm length)，流动相为甲醇∶水，甲醇∶水的体积比为98∶2，柱温为30℃，流速1.0mL/min，进样量30μl。

[0081] UVD：采用Waters 2996 photodiode array dectector系统，紫外光检测器检测波长292nm。

[0082] 精密称取生育酚标准品(Sigma公司)2.0mg用1mL甲醇完全溶解，得到2mg/mL生育酚标准品溶液，保存于-20℃备用。

[0083] 本发明中流动相为甲醇(methanol)∶水，比例为98％∶2％时，生育酚的出峰时间为26.3min，峰型良好。

[0084] 2.标准曲线的制作

[0085] 将所述对照品溶液在相应色谱条件下分别进样5μl，10μl，15μl，20μl，30μl记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品含量(X，μg)进行回归分析。通过研究，本发明中生育酚在10-60μg范围内呈现良好的log-log线性关系。生育酚对照品的log-log线性回归方程为：Y＝7.26e+002X+1.09e+004；R＝0.999740。

[0086] 3.样品的制备和生育酚含量的测定

[0087] 生育酚的提取过程如下：取少量新鲜的拟南芥叶片(1-2g鲜重)，液氮研磨，用4mL正己烷提取，超声30分钟。离心，收集上清液，用氮吹仪吹干，用适量甲醇溶解提取物，用于HPLC检测。

[0088] 采用HPLC-UVD测定生育酚含量，样品进样体积为30μl，根据峰面积代入线形回归方程计算出样品中的生育酚含量(mg)，折合成物质的量(pmol)，再除以样品的拟南芥叶片鲜重(mg)，从而计算出拟南芥植株中生育酚的含量。

[0089] 在本发明中MPBQ MT基因的转化显著提高了拟南芥叶片中维生素E含量，这使得转基因植株中维生素E的含量超过对照的50％以上。由此可见，MPBQ MT基因可作为一种提高植物营养价值的候选基因。用于利用转基因技术提高作物维生素E含量的研究和产业化生产中。

[0090] 本发明涉及的序列及记号分列如下：

[0091] (1)SEQ ID NO.1的信息

[0092] (i)序列特征：

[0093] (A)长度：26bp

[0094] (B)类型：核苷酸

[0095] (C)链性：单链

[0096] (D)拓扑结构：线性

[0097] (ii).分子类型：寡核苷酸

[0098] (iii).序列描述：SEQ ID NO.1

[0099] 5’-TGAGTACTGGCCTGACCCACAACGAG-3’

[0100] (2)SEQ ID NO.2的信息

[0101] (i)序列特征：

[0102] (A)长度：26bp

[0103] (B)类型：核苷酸

[0104] (C)链性：单链

[0105] (D)拓扑结构：线性

[0106] (ii).分子类型：寡核苷酸

[0107] (iii).序列描述：SEQ ID NO.2

[0108] 5’-GGCCCGATTATACATGCCTTTCCTCC-3’

[0109] (3)SEQ ID NO.3的信息

[0110] (i)序列特征：

[0111] (A)长度：1328bp

[0112] (B)类型：核苷酸

[0113] (C)链性：单链

[0114] (D)拓扑结构：线性

[0115] (ii).分子类型：核苷酸

[0116] (iii).序列描述：SEQ ID NO.3

[0117] ACTTAAATTGGTTCGTTTGCAGCAGTTCCAGGGAACTGATAAGCGTTTGTACTTCTTTCTTATCTCCAATC[0118] CCCAAAACCCCATTTGCATGTAAGAATCTTTATTTTATAAAAAGGGGTTTGATAGTATTCCGATTAGGATA[0119] TTTGATTATTTCAACAAGCATGGCTTCGTCGATGCTCTATGGAGGTCAGCATCTTACATTAACCCCAAAAG[0120] GGTTAGGGTTTAATGGGTCAGATTTGCATGGTAAGAATTTGCTGAAGATGAATTTGGTTGGTAGAAATTGT[0121] AATTTTCGATCTAAAACGCTAGTTGTACCCAAATGCAGCGTGTCTGTACCAAGGCCAGCTTCACAGCCTAG[0122] GTTCATACAGCATAAAAAA-GAGGCATTTTGGTTTTATAGGTTTCTGTCAATCGTTTACGATCATGTGATA[0123] AACCCTGGTCATTGGACTGAAGATATGCGAGACGATGCACTCGAACCAGCTGATCTTAATAGCCGCGATTC[0124] AATAGTGGTGGATGTTGGTGGAGGCACTGGGTTCACTACTTTAGGTATTGTAAAACATGTCGATGCTAAAA[0125] ATGTTACCATTTTGGATCAATCGCCTCATCAGCTTGCAAAAGCTAAAGAGAAGGAGCCTTTGAAGGAATGC[0126] AAGATCATTGAAGGAGATGCTGAAGATCTTCCTTTCAAAACTGATTATGCCGATAGATATGTGTCAGCCGG[0127] AAGCATTGAGTACTGGCCTGACCCACAACGAGGCATCAAAGAAGCATACAGGGTTCTAAAGATAGGAGGAA[0128] AGGCATGTATAATCGGGCCTGTGTATCCAACCTATTGGTTGTCGCGTTTCTTTGCAGACATGTGGATGCTG[0129] TTTCCAAAGGAGGAAGAGTACATTGAGTGGTTTGAAAGGGCTGGATTCAAAGATGTTAAGATCAAGAGGAT[0130] TGGCCCAAAGTGGTACCGTGGGGTCCGCCGCCATGGTCTTATCATGGGCTGCTCTGTTACCGGAGTTAAAC[0131] CCGCATCAGGAGATTCACCATTACAGTTGGGTCCAAAAGTGGAGGACGTGAGGGAGCCAGTGAACCCATTG[0132] GCGTTCCTAGCCCGGTTTCTTGTGGGTGCGATGGCTGGAATCTACTATGTCCTGGTCCCTGTGTACATGTG[0133] GCTCAAGGATCAAATTGTCCCAAAAGGTCAACCAATT GTCCTCAGAGATGGTTTGGTTTGGTTTGGTT[0134] TGGTTTGGTTTGTTTTAGGTTGAGTTGCATTTTCCCATTTTGGTTTTGTATGCTATGATATGATATAATTC[0135] CATGCCTGGTTTTGGTTTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

[0136] (4)SEQ ID NO.4的信息

[0137] (i)序列特征：

[0138] (A)长度：337氨基酸

[0139] (B)类型：氨基酸

[0140] (C)链性：单链

[0141] (D)拓扑结构：线性

[0142] (ii).分子类型：多肽

[0143] (iii).序列描述：SEQ ID NO.4

[0144] M A S S M L Y

[0145] G G Q H L T L T P K G L G F N G S D L H[0146] G K N L L K M N L V G R N C N F R S K T[0147] L V V P K C S V S V P R P A S Q P R F I[0148] Q H K K E A F W F Y R F L S I V Y D H V[0149] I N P G H W T E D M R D D A L E P A D L[0150] N S R D S I V V D V G G G T G F T T L G[0151] I V K H V D A K N V T I L D Q S P H Q L[0152] A K A K E K E P L K E C K I I E G D A E[0153] D L P F K T D Y A D R Y V S A G S I E Y[0154] W P D P Q R G I K E A Y R V L K I G G K[0155] A C I I G P V Y P T Y W L S R F F A D M[0156] W M L F P K E E E Y I E W F E R A G F K[0157] D V K I K R I G P K W Y R G V R R H G L[0158] I M G C S V T G V K P A S G D S P L Q L[0159] G P K V E D V R E P V N P L A F L A R F[0160] L V G A M A G I Y Y V L V P V Y M W L K[0161] D Q I V P K G Q P I