一种GFP转基因棉花杂交种纯度检测方法

摘要

本发明公开了一种GFP转基因棉花杂交种纯度检测方法，以GFP纯合子品种作父本，非GFP品种作母本获得F1杂交种为检测对象；抽取F1代种子检测样本，用28℃±2温水浸种20～30h后，在30℃±2催芽20～30h，去掉外种皮，留取同一粒种子的下胚轴和内种皮分别作一个切片放在同一个载玻上；用荧光显微镜的蓝紫光照射，观察两个切片的荧光表现，只有下胚轴切片有绿色荧光而内种皮切片无绿色荧光时判定该粒种子为F1杂交种；当下胚轴切片和内中皮切片都具有绿色荧光时判定该粒种子为父本或GFP的F2代种子；当下胚轴切片和内种皮切片都没有绿色荧光时判定该粒种子为母本或其他品种。该检测方法准确、快速、经济，便于应用。

权利要求

1.一种GFP转基因棉花杂交种纯度检测方法，其特征在于，包括下列步骤：

1)以GFP纯合子品种作父本，用非GFP品种作母本获得的F1杂交种；

2)抽取F1代种子检测样本，用28℃±2温水浸种20～30h后，在30℃±2下催芽

20～30h，去掉外种皮，留取同一粒种子的下胚轴和内种皮分别作一个切片放在同一个载玻上；

3)用荧光显微镜的蓝紫光照射，观察两个切片的荧光表现，只有下胚轴切片有绿色荧光而内种皮切片无绿色荧光时判定该粒种子为F1杂交种；当下胚轴切片和内种皮切片都具有绿色荧光时判定该粒种子为父本或GFP的F2代种子；当下胚轴切片和内种皮切片都没有绿色荧光时判定该粒种子为母本或其他品种。

说明书

一种GFP转基因棉花杂交种纯度检测方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物育种技术领域，具体涉及一种GFP转基因棉花杂交种纯度检测方法。技术背景

[0002] 杂种优势是生物界普遍规律。杂交优势利用是生物育种的热点。水稻和玉米杂交优势的广泛应用，为解决粮食安全和饲料安全起到了巨大作用。棉花杂交优势利用起步较晚，目前印度和中国是棉花杂交种应用面积最大的国家。印度选育的棉花杂交种最高增产可以达到50％以上，推广面积占棉花种植面积一半左右。我国是传统纺织品出口大国，棉花在我国纺织工业和农业生产中占有重要地位，棉花常年种植面积在6000万亩左右。我国棉花杂交种近20年来发展较快，面积已占到棉花种植面积的20-30％。棉花杂交种不仅有较大的增产潜力，而且纤维品质和抗病性方面也有较大优势，因此选育棉花杂交种是提高棉花产量和品质的重要途径。要推广杂交种，就必须进行杂交种纯度检测。目前，相关的背景技术有：

[0003] 1.田间小区种植鉴定法 这种方法是目前用于棉花杂交种纯度鉴定的主要方法，制种企业把制种户所产种子样品拿到海南去加代，每一个样品分别种成田间小区，根据样品植株的形态学特征与品种标准植株的对比来鉴定纯度，费用高，时效性差，人为影响大，性状鉴定难，特别是数量性状的变异表现为数量上的连续性，更增加了鉴定的难度。

[0004] 2.形态学标记性状的应用 为了便于纯度检测，目前，我国在棉花杂交种中应用了形态学标记性状，这类标记性状有鸡脚叶.红叶.芽黄和窄卷苞叶等。选育具有显性性状标记的父本，通过两个亲本杂交，把标记性状遗传到F1中，通过调查F1幼株标记性状整齐度检测杂交种纯度。这些标记性状都属于棉花内源基因控制的，这种方法实质上属于植株形态鉴定的范畴。我国利用鸡脚叶标记性状选育出了棉花杂交新品种——标杂A1已经开始推广种植。利用内源基因控制的显性形态标记性状存在的缺点是：亲本选择范围小，选育出高优势组合难。由于鸡脚叶性状和许多其它性状是连锁遗传的，选择鸡脚叶作标记性状的同时必然被迫地连锁了一些其它性状——尽管有些性状对育种目标并不是有利的，因而缩小了亲本选择范围，增大了育种的难度。

[0005] 3.DNA分子标记技术 随着生物技术的发展，诞生了一系列DNA分子标记技术，给种子纯度鉴定提供了新的途径。品种的纯度鉴定，归跟到底是品种基因型的差别鉴定。一个纯合品种的基因型应该是一致的，这种基因型用分子标记加以确定，就是该品种的DNA指纹图谱，DNA指纹图谱的差别实质上就是品种基因型的差别。通过比对DNA指纹图谱，根据找出不同标记点数多少的差别，来鉴定品种的纯度。DNA分子标记技术分为两大类：一类是通过限制性内切酶切割，结合分子杂交技术获得的标记，如RFLP标记技术；另一类是通过PCR扩增技术获得的标记，它包括RAPD标记技术，SSR技术和AFLP标记技术等。DNA分子标记技术检测种子纯度的主要步骤是1).DNA提取；2).放射性同位素应用或引物筛选；.3).PCR反应；4).电泳。DNA分子标记技术使品种纯度的鉴定进入了分子水平，是一种准确.可靠.快速的鉴定方法。但是用DNA分子标记技术鉴定种子纯度，步骤繁多，技术性强，费用过高，主要应用在科学研究方面；在栽培种纯度鉴定，特别是在棉花杂交制种面向千家万户的情况下，取样多，过高的鉴定费是企业和制种户都难以接受的。

[0006] 4.卡那霉素鉴定法 卡那霉素鉴定是利用不同棉花幼苗叶片对其的抗性反应来区别Bt转基因与非转基因棉花的，棉花幼苗叶片接触到一定浓度卡那霉素，非转基因棉花幼苗叶片出现黄色斑点，而Bt转基因抗虫棉花幼苗叶片则表现正常。用卡那霉素鉴定棉花杂交种纯度，杂交种的父本必须是Bt转基因抗虫棉，母本必须是非Bt转基因棉花，而在实际棉花杂交种生产中母本是收获植株，父本和母本种植比例是1∶8左右，由于母本不抗虫制种产量受到很大影响，纯度鉴定率虽在90％以上，仍达不到杂交棉种纯度标准。卡那霉素法更不能检测出加杂在F1中的其他Bt转基因棉种。

[0007] 综上所述，目前棉花杂交制种主要采用手工杂交制种法，这种制种法的漏洞是：去雄前开花早的植株已经形成自交铃，制种过程中漏花和阴雨天也易形成自交铃，制种结束后未清理干净的晚蕾形成的自交铃，剥花不彻底还易形成自交种子，以上情况对杂交种纯度影响很大；加之棉花杂交种收购价很高，人为混杂时有发生。棉花不仅制种效率低，制种纯度难以保证，而且对杂交种纯度缺乏准确、快速、经济的检测方法，因此制种效率和纯度检测方法成为棉花杂交种应用的技术瓶颈。

发明内容

[0008] 针对现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的目的在于提供一种准确，快速，经济的GFP转基因棉花杂交种纯度检测方法。

[0009] 实现上述发明目的的技术方案是：一种GFP转基因棉花杂交种纯度检测方法，具体包括下列步骤：

[0010] 1)以GFP纯合子品种(系)作父本，用非GFP品种(系)作母本获得的F1杂交种；

[0011] 2)抽取F1代种子检测样本，用28℃±2温水浸种20～30h后，在30℃±2下催芽20～30h，去掉外种皮，留取同一粒种子的下胚轴和内种皮分别作一个切片放在同一个载玻上；

[0012] 3)用荧光显微镜的蓝紫光照射，观察两个切片的荧光表现，只有下胚轴切片有绿色荧光而内种皮切片无绿色荧光时可以判定该粒种子为F1杂交种；当下胚轴切片和内中皮切片都具有绿色荧光时可以判定该粒种子为父本或GFP的F2代种子；当下胚轴切片和内种皮切片都没有绿色荧光时可以判定该粒种子为母本或其他品种。

[0013] 本发明检测方法的检测对象为仅父本用GFP转基因纯合子品种(系)，母本采用非GFP转基因品种(系)所获得的F1杂交种。

[0014] 本发明检测方法的创新点在于：用同一粒F1种子的下胚轴和内种皮分别作成一个切片，结合这两个切片的荧光表现判断真假F1杂交种。

[0015] 本发明检测方法的检测原理在于：下胚轴是由受精卵发育而成，它接受了父母双方的遗传信息，特别是接受了父本中GFP遗传基因，使其能够在蓝紫光激发下发出绿色荧光；内种皮是由母本的体细胞发育来的，由于母本没有GFP基因的存在，在蓝紫光下不能发出绿色荧光。

[0016] 与现有技术相比较，本发明的检测方法具有以下优点：

[0017] 1.检测速度快 利用绿色荧光蛋白基因标记检测棉花杂交种纯度，检测过程非常简单，只需要把用同一粒种子的下胚轴切片和内种皮切片，分别放在荧光显微镜或手握紫外灯下观察，就可以清楚分辨出那一粒是F1代杂交种。田间小区种植鉴定，需要把棉花整个生育期的性状进行调查观察记载并与标准植株比对，内容多，用时长。用DNA分子标记技术鉴定种子纯度实验过程复杂，技术性强，虽然鉴定过程用时较短，但鉴定效率低。而利用GFP标记检测棉花杂交种纯度过程仅需要2天，而且鉴定效率高，一个人一天可以完成一千多个样。

[0018] 2.成本低 利用分子标记技术鉴定一个样本需要成本500元以上，利用绿色荧光蛋白GFP基因标记检测棉花杂交种，不需要任何试剂，只需要一个荧光显微镜或一个紫外灯，鉴定一个样本成本不到1元，是所有技术中成本最低的。

[0019] 3.结果可靠 利用卡那霉素鉴定棉花杂交种纯度，虽然速度快成本低，但是不能分辨出加杂在F1中的Bt转基因抗虫棉种和父本种子，检测率达不到种子纯度标准。利用绿色荧光蛋白GFP基因鉴定棉花杂交种纯度，分辨率高，结果准确可靠，F1杂种检出率可达99％以上。

附图说明

[0020] 图1为本明GFP转基因棉花杂交种纯度检测方法的流程图。

具体实施方式

[0021] 实施例1

[0022] 一种GFP转基因棉花杂交种纯度检测方法，具体包括下列步骤：1)以GFP纯合子品种(系)作父本，用非GFP品种(系)作母本获得的F1杂交种；2)抽取F1代种子检测样本，用26℃温水浸种20后，在30℃下催芽30h，去掉外种皮，留取同一粒种子的下胚轴和内种皮分别作一个切片放在同一个载玻上；3)用荧光显微镜的蓝紫光照射，观察两个切片的荧光表现，与表1查对后确定这一粒种子是否属于F1杂交种，只有下胚轴切片有绿色荧光而内种皮切片无绿色荧光时可以判定该粒种子为F1杂交种；当下胚轴切片和内中皮切片都具有绿色荧光时可以判定该粒种子为父本或GFP的F2代种子；当下胚轴切片和内种皮切片都没有绿色荧光时可以判定该粒种子为母本或其他品种，其流程参见图1。

[0023] 表1GFP荧光检测查对表

[0024]

[0025] 注：+有绿色荧光 -无绿色荧光

[0026] 实施例2

[0027] 一种GFP转基因棉花杂交种纯度检测方法，具体包括下列步骤：

[0028] 1)以GFP纯合子品种(系)作父本，用非GFP品种(系)作母本获得的F1杂交种；

[0029] 2)抽取F1代种子检测样本，用28℃温水浸种20后，在28℃下催芽30h，去掉外种皮，留取同一粒种子的下胚轴和内种皮分别作一个切片放在同一个载玻上；

[0030] 3)用荧光显微镜的蓝紫光照射，观察两个切片的荧光表现，只有下胚轴切片有绿色荧光而内种皮切片无绿色荧光时可以判定该粒种子为F1杂交种；当下胚轴切片和内中皮切片都具有绿色荧光时可以判定该粒种子为父本或GFP的F2代种子；当下胚轴切片和内种皮切片都没有绿色荧光时可以判定该粒种子为母本或其他品种。

[0031] 实施例3

[0032] 一种GFP转基因棉花杂交种纯度检测方法，具体包括下列步骤：

[0033] 1)以GFP纯合子品种(系)作父本，用非GFP品种(系)作母本获得的F1杂交种；

[0034] 2)抽取F1代种子检测样本，用30℃温水浸种24后，在30℃下催芽24h，去掉外种皮，留取同一粒种子的下胚轴和内种皮分别作一个切片放在同一个载玻上；

[0035] 3)用荧光显微镜的蓝紫光照射，观察两个切片的荧光表现，只有下胚轴切片有绿色荧光而内种皮切片无绿色荧光时可以判定该粒种子为F1杂交种；当下胚轴切片和内中皮切片都具有绿色荧光时可以判定该粒种子为父本或GFP的F2代种子；当下胚轴切片和内种皮切片都没有绿色荧光时可以判定 该粒种子为母本或其他品种。

[0036] 实施例4

[0037] 对各个单位生产的F1种子用随机取样法抽取样本，对样本种子用26℃温水浸泡24h后，在30℃条件下催芽24h至露白。抽取露白种子100～150粒，用每一粒种子的内种皮和下胚轴分别作一个切片，下胚轴切片的厚度在0.3-0.5mm之间，两个切片放在一张载玻片上，并对每一张载玻片进行编号登记，一张载玻片代表一粒种子。作好的载玻片放在保湿条件下保存，以防切片失水。用荧光显微镜的蓝紫光对载玻片上的切片观察确认，按照表1，GFP检测对照表中内容记载观测结果，有绿色荧光的切片记为+，无绿色荧光的切片记为-，+-的载玻片判定为F1杂交种，++或--判定为非F1杂交种。最后对记载结果进行统计分析，计算出杂交种纯度，计算公式：F1纯度％＝F1种子粒数.100/实际检测种子数。根据需要可以对不合格样品进行1-2次重复。