一种史氏鲟精子诱导西伯利亚鲟雌核发育的方法

摘要

本发明涉及一种史氏鲟精子诱导西伯利亚鲟雌核发育的方法，包括：(1)史氏鲟精子遗传物质的灭活；(2)西伯利亚鲟未受精卵的采集及史氏鲟灭活精子的授精；(3)热休克诱导西伯利亚鲟雌核发育：采用热休克抑制第二极体排出的方法诱导西伯利亚鲟雌核发育，热休克起始时间为受精后0.3τ0(16℃下18min)、热休克持续时间2min及热休克温度37℃；(4)雌核发育诱导卵的培育。利用本发明技术培育出西伯利亚鲟超雌鱼，将其与正常养殖雄鱼交配可生产出全雌性鱼苗，从而提高西伯利亚鲟养殖群体中雌性个体比例，提高养殖效益。

权利要求

1.一种史氏鲟精子诱导西伯利亚鲟雌核发育的方法，包括：(1)史氏鲟精子遗传物质的灭活

采集史氏鲟精子，镜检选取活力90％以上的用于紫外线灭活，取部分精液于8000r/min下离心15min，分离精浆，将精液与精浆按1∶4的体积比混合，置于4℃预冷的培养容器中，将培养容器置于铺有碎冰的摇床上，振荡频率90rpm，培养容器正上方放置有2支15W

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的紫外灯，以0.1mJ/(cm.s)的紫外线照射精子6min，精子紫外线灭活剂量为36mJ/cm ；

(2)西伯利亚鲟未受精卵的采集及史氏鲟灭活精子的授精选择性成熟的西伯利亚鲟雌鱼，人工催产到达效应时间后采用腹部挤压法采卵，收集后于16℃水温下，与上述灭活的史氏鲟精液，以1000粒卵:2ml灭活精液的比例，轻轻摇动混匀，其中精液使用量为0.2ml，然后加入20ml清水进行授精，授精水温16℃，授精时间

2min，之后将授精后的受精卵用清水漂洗干净，再用20％的滑石粉悬浊液进行搅拌脱粘，此过程保持水温16℃；

(3)热休克诱导雌核发育

上述受精卵在16℃下受精后18min，将受精卵置于37℃的水浴中进行热休克，热休克时间2min，再将其移入16℃的水浴中复温；

(4)雌核发育诱导卵的培育

将上述经过热休克和复温后的受精卵继续脱粘，总脱粘时间45min，脱粘后的受精卵置于瓶式孵化器中孵化，孵化水温控制在16～18℃。

说明书

一种史氏鲟精子诱导西伯利亚鲟雌核发育的方法

技术领域

[0001] 本发明属西伯利亚鲟雌核的诱导发育领域，特别是涉及一种史氏鲟精子诱导西伯利亚鲟雌核发育的方法。

背景技术

[0002] 西伯利亚鲟是我国主要的经济水产养殖品种，具有生长速度快、适应性强、肉质好、鱼籽酱品质高等优点，自1996年首次引入国内以来，现已发展成为养殖产量仅次于施氏鲟的第二大鲟鱼养殖品种。由雌性鲟鱼的成熟卵子所制成的鲟鱼鱼籽酱有“黑黄金”之称，是鲟鱼养殖中附加值最高的产品，价格达8000元/kg以上，体重15～20kg的成熟雌鱼每尾仅生产鱼籽酱的产值就达1～2万元，而雄鱼仅能生产商品鱼或鱼肉制品，商品价格仅30～40元/kg，经济价值较雌鱼低很多。正常繁殖鲟鱼苗中50％左右的雄性，因此研发全雌西伯利亚鲟鱼苗，对于提高鲟鱼养殖效益和降低生产成本具有重要的现实意义。

[0003] 雌核发育是单性生殖的一种，指卵子依靠自己细胞核内遗传物质发育成个体的生殖行为。分布于我国的方正银鲫、彭泽鲫等属于天然雌核发育鱼类，国内已对银鲫的雌核发育机理进行了大量的研究，并建立了鲤鱼、大黄鱼、半滑舌鳎等的雌核发育技术。国外也就杂交鲟(欧洲鳇♀×小体鲟♂)、俄罗斯鲟、闪光鲟、匙吻鲟、高首鲟、密西西比铲鲟等的同源和异源精子诱导雌核发育技术进行了研究，但有关利用史氏鲟精子诱导西伯利亚鲟雌核发育的技术国内外均未见报道。

发明内容

[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种史氏鲟精子诱导西伯利亚鲟雌核发育的方法，利用本发明技术培育出西伯利亚鲟超雌鱼，将其与正常养殖雄鱼交配可生产出全雌性鱼苗，从而提高西伯利亚鲟养殖群体中雌性个体比例，提高养殖效益。

[0005] 本发明的一种史氏鲟精子诱导西伯利亚鲟雌核发育的方法，包括：

[0006] (1)史氏鲟精子遗传物质的灭活

[0007] 采集史氏鲟精子，镜检选取活力90％以上的用于紫外线灭活，取部分精液于8000r/min下离心15min，分离精浆，将精液与精浆按1∶4的体积比混合，置于4℃预冷的培养容器中，于铺有碎冰的摇床上，振荡频率90rpm/min，培养容器正上方放置有2支15W的
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紫外灯，以0.1mJ/cm/s的紫外线照射精子6min，精子紫外线灭活剂量为36mJ/cm ；

[0008] (2)西伯利亚鲟未受精卵的采集及史氏鲟灭活精子的授精

[0009] 选择性成熟的西伯利亚鲟雌鱼，人工催产到达效应时间后采用腹部挤压法采卵，收集后于16℃水温下，与上述灭活的史氏鲟精液，以1000粒卵：2ml灭活精液的比例，轻轻摇动混匀，然后加入2倍于卵量的水进行授精，授精水温16℃，授精时间2min，授精后的受精卵立即用20％的滑石粉悬浊液进行搅拌脱粘；

[0010] (3)热休克诱导雌核发育

[0011] 上述受精卵在受精后0.3τ0(16℃下18min)，将受精卵置于37℃的水浴中进行热休克，热休克时间2min，再将其移入16℃的水浴中复温；

[0012] (4)雌核发育诱导卵的培育

[0013] 将上述经过热休克和复温后的西伯利亚鲟卵继续脱粘，总脱粘时间45min，脱粘后的卵置于瓶式孵化器中孵化，孵化水温控制在16～18℃。

[0014] 本发明技术方案所依据的科学原理：雌核发育是孤雌生殖的一种，是卵子依靠自己细胞核内遗传物质发育成完整个体的生殖行为，同种或异种精子进入卵子内只起刺激卵子发育的作用，不形成雄性原核和提供遗传物质，其子代遗传物质全部来自于雌核，只具有母本的性状。西伯利亚鲟为ZW/ZZ性别决定型，可以通过雌核发育直接制作WW性别决定型的超雌鱼，培育成熟的超雌鱼可直接与自然养殖的西伯利亚鲟雄鱼(ZZ)交配生产出全雌雄的后代。

[0015] 有益效果

[0016] 利用本发明技术培育出西伯利亚鲟超雌鱼，将其与正常养殖雄鱼交配可生产出全雌性鱼苗，从而提高西伯利亚鲟养殖群体中雌性个体比例，提高养殖效益。

具体实施方式

[0017] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

[0018] 1.西伯利亚鲟卵和史氏鲟精子

[0019] 利用杭州千岛湖鲟龙科技开发有限公司人工培育的西伯利亚鲟雌鱼3尾(体重13.4～17.4kg)，史氏鲟雄鱼3尾(体重7.8～10.2kg)，经过人工催产，于2009年3月3日14时取史氏鲟精液，镜检活力为95％，精子进行紫外线照射灭活。2009年3月4日10时取西伯利亚鲟卵子。

[0020] 2.紫外线照射史氏鲟精子

[0021] 吸取上述史氏鲟精子1ml，置于4℃预冷的直径70mm的培养皿中，加入4ml的史氏鲟精浆稀释，将培养皿置于铺有碎冰的摇床上，振荡频率为90rmp/min。培养皿正上方放置2
有2根15W的紫外灯，利用0.1mJ/cm/s的紫外线照射0.5、1、2、3、4、5、6、7、9、11、13、15min，照射后镜检，统计精子活力、寿命、快速运动时间，如表1。从表中可以看出，经紫外线照射
2min后精子活力、寿命和快速运动时间会大幅度下降，且均表现出明显的Hertwig效应，即精子活力、寿命和快速运动时间等随紫外线照射时间的的增加呈“先急速下降，后迅速上升，最后缓慢下降”的趋势。

[0022] 表1史氏鲟精子经紫外线照射后活力、寿命和快速运动时间

[0023]

[0024] 利用不同紫外线照射剂量后(0、1、2、6、12、24、36、60、72mJ/cm2)的史氏鲟精子与西伯利亚鲟卵子受精，通过单倍体诱导率来确定最佳精子紫外线灭活剂量，如表2。从表2中可以看出，受精率随紫外线照射剂量的增加而下降，孵化率随剂量的增加呈现“先下降，后上升，再下降”的趋势。用紫外线照射后史氏鲟精子受精的西伯利亚鲟卵，由于精子遗传物质被紫外线灭活，导致部分孵出仔鱼表现出明显的尾部畸形的“单倍体综合症”，且单倍体诱导率随紫外线照射剂量的上升而上升，当紫外线剂量36mJ/cm2以上时，单倍体诱导率达到100％。综合受精率、孵化率和单倍体诱导率，选择36mJ/cm2为史氏鲟精子紫外线照射的最佳剂量，此时能保证较高的受精率、孵化率和精子遗传物质灭活效果。

[0025] 表2紫外线照射剂量对受精率、孵化率和单倍体诱导率的影响

[0026]

[0027] 3.热休克开始时间的筛选

[0028] 由于西伯利亚鲟胚胎发育速度是随水温发生变化的，水温越高，发育速度越快，水温越低，发育速度越慢，因此将西伯利亚鲟卵裂间隔(τ0)作为确定热休克开始时间(τs)