O,O-二甲氧基硫代磷酸酯类农药单克隆抗体

摘要

本发明涉及O，O-二甲氧基硫代磷酸酯类农药单克隆抗体及其制备方法，属于生物技术领域。用免疫原“3-[4-(O，O-二甲基硫代磷酰氧基)苯基]-1-丙酸-牛血清白蛋白偶联物”免疫BALB/C鼠，脾细胞和Sp2/0骨髓瘤细胞通过杂交瘤技术制备杂交瘤细胞，获得了稳定分泌抗O，O-二甲氧基硫代磷酸酯类农药的单克隆抗体。专用于识别O，O-二甲氧基硫代磷酸酯类农药单克隆抗体的制备，及其在农产品和农业生产环境中农药残留的高灵敏快速检测。本发明抗体的制备技术简便可行：抗原的整个制备过程无需要特别的仪器设备，容易工厂化规模生产。

权利要求

1.O，O-二甲氧基硫代磷酸酯类农药单克隆抗体，由小鼠杂交瘤细胞株1D12-B5，CCTCCNO：C200906所产生的。

2.一种产生抗O，O-二甲氧基硫代磷酸酯类农药单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，它是小鼠杂交瘤细胞株1D12-B5，CCTCC NO：C200906。

说明书

O，O-二甲氧基硫代磷酸酯类农药单克隆抗体

(一)技术领域

[0001] 本发明涉及O，O-二甲氧基硫代磷酸酯类农药单克隆抗体及其制备方法，属于生物技术领域。专用于农产品和农业生产环境中农药多残留检测，特别适用于大批量样品检测和现场监测。(二)背景技术

[0002] 目前，有机磷农药是我国使用量最大的农药。有机磷农药防治对像多，应用范围广，对防治农作物病、虫、草害，确保农作物丰产丰收起着重要的作用，但有些农药，尤其是高毒、高残留农药确给环境带来严重污染，对人的身体健康也造成严重危害。近年来，农业部陆续公布了一批国家明令禁止使用23种农药，其中包括甲胺磷、对硫磷、甲基对硫磷、久效磷和磷胺等5种高毒有机磷农药。

[0003] 当今世界农残分析向多残留、快速分析发展，要保证高通量的检测方法的准确性，需要有严格的农药残留确证技术。气相色谱质谱联用仪是农药残留分析最广泛使用的方法，但传统的色谱法农药残留分析技术检测成本高、时间长，这就给食品安全监管部门对农产品产前、产中、产后的监督工作带来了许多不便。

[0004] 上世纪70年代末，美国Bruce D.Hammock和他的合作者们开创了农药免疫定量分析技术；80年代后，免疫化学分析技术已成为优先研究、开发和利用的农药残留快速检测技术，美国化学学会将免疫分析方法与GC(气相色谱)、HPLC(高效液相色谱)方法一起列为化学农药残留分析的三大支柱技术，是21世纪最具竞争性和挑战性的超微量检测技术。利用ELISA(酶联免疫吸附分析)方法不仅可以定性而且可以定量检测样品中的农药残留，这种分析方法对仪器设备要求不高，快速简便，一般无需对样品进行复杂的预处理，灵敏度高，特异性强，而且价格便宜，易于标准化、自动化和适于大容量样本分析等优点。已有文献报道了60多种杀菌剂、杀虫剂、除草剂等的ELISA检测方法的建立，其检测水平可达纳克(ng)甚至皮克(pg)。同时检测多个农药的多残留ELISA检测方法，在国外上世纪90年代有陆续报道，在我国近几年才有单位和研究人员重视并从事多残留农药检测技术研究，目前国内尚未见该类方法的研究报道。
(三)发明内容

[0005] 技术问题本发明的目的是提供O，O-二甲氧基硫代磷酸酯类农药单克隆抗体及其制备方法，通过合成免疫抗原，免疫BALB/C鼠，通过杂交瘤技术制备能同时识别这一类农药的单克隆抗体，并用于农产品和农业生产环境中农药残留的高灵敏快速检测。 [0006] 技术方案

[0007] O，O-二甲氧基硫代磷酸酯类农药单克隆抗体，是由杂交瘤细胞1D12-B5产生的。 [0008] 上述O，O-二甲氧基硫代磷酸酯类农药单克隆抗体的制备方法，包括： [0009] 1)抗原制备：

[0010] 以二甲氧基硫代磷酰氯、3-[4羟基]苯丁酸为原料合成了半抗原3-[4-(O，O-二甲基硫代磷酰氧基)苯基]-1-丙酸，再用活泼酯法分别与牛血清白蛋白、卵清蛋白偶联形成免疫原、同源包被原。

[0011] 以3-甲基4-硝基苯酚、溴代丁酸乙酯为原料合成了半抗原3-甲基4-硝基苯基-O-丁酸，再用活泼酯法与卵清蛋白偶联形成异源包被原。

[0012] 2)小鼠免疫：

[0013] 将制备好的3-[4-(O，O-二甲基硫代磷酰氧基)苯基]-1-丙酸-牛血清白蛋白作为免疫原免疫6-8周龄雌性BALB/c鼠，每次每只小鼠的免疫原用量200μg，共免疫五次，首次免疫由等体积的免疫原和佛氏完全佐剂乳化，腹腔注射，以后四次免疫用等体积的佛氏不完全佐剂和免疫原乳化；前两次免疫间隔3周以后三次免疫间隔2周用。 [0014] 从第三次开始，每次免疫后一周，鼠尾静脉采血。以3-[4-(O，O-二甲基硫代磷酰氧基)苯基]-1-丙酸-卵清白蛋白作为包被原，用非竞争间接ELISA法检测抗体的效价。用碳酸盐包被缓冲液稀释包被3-[4-(O，O-二甲基硫代磷酰氧基)苯基]-1-丙酸-卵清白蛋白，96孔酶标板中每孔加入50μL，于4℃冰箱放置过夜或于37℃放置2小时；将酶标板中包被液倒尽，并用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次。

[0015] 明胶可用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液稀释成1％的浓度，96孔酶标板中每孔加入100μL，37℃放置1-2小时；将酶标板中封闭液倒尽，并用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液缓冲液洗涤5次。

[0016] 将小鼠血清用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液稀释，96孔酶标板中每孔加入50μL； 同时用未经免疫的小鼠血清设置阴性对照；37℃放置1小时；将酶标板中反应液倒尽，并用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次。

[0017] 用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体(华美公司，下同)，96孔酶标板中每孔加入50μL，37℃放置1小时；将酶标板中反应液倒尽，并用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液缓冲液洗涤6次。

[0018] 用底物缓冲液现配四甲基联苯胺显色液，96孔酶标板中每孔加入50μL，37℃暗处反应10-30min。

[0019] 96孔酶标板中每孔加入2mol/L硫酸25μL，终止反应。

[0020] 终止显色后的酶标板立即在450nm下测定各孔单波长吸光值。

[0021] 3)细胞融合

[0022] 选经间接非竞争ELISA法检测效价最高的BALB/c小鼠，用3-[4-(O，O-二甲基硫代磷酰氧基)苯基]-1-丙酸直接免疫，三天后取脾脏，脾细胞和对数生长期的Sp2/0骨髓瘤细胞通过杂交瘤技术制备杂交瘤细胞，37℃，5％二氧化碳培养箱培养10-14天后，通过检测融合孔上清筛选杂交瘤细胞；

[0023] 4)杂交瘤筛选：

[0024] 融合孔上清用与筛选小鼠的方法相同，采用间接非竞争ELISA法进行初步筛选，用碳酸盐包被缓冲液稀释包被3-[4-(O，O-二甲基硫代磷酰氧基)苯基]-1-丙酸-卵清白蛋白，96孔酶标板中每孔加入50μL，于4℃冰箱放置过夜或于37℃放置2小时；将酶标板中包被液倒尽，并用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；

[0025] 明胶可用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液稀释成1％的浓度，96孔酶标板中每孔加入100μL，37℃放置1-2小时；将酶标板中封闭液倒尽，并用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液缓冲液洗涤5次；

[0026] 将小鼠血清用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液稀释，96孔酶标板中每孔加入50μL；以未融合细胞的上清作为阴性对照；以免疫小鼠的血清为阳性对照；37℃放置1小时；将酶标板中反应液倒尽，并用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次； [0027] 用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，96孔酶标板中每孔加入50μL，37℃放置1小时；将酶标板中反应液倒尽，并用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液缓冲液洗涤6次；

[0028] 用底物缓冲液现配四甲基联苯胺显色液，96孔酶标板中每孔加入50μL，37℃暗处反应10-30min；

[0029] 96孔酶标板中每孔加入2mol/L硫酸25μL，终止显色；

[0030] 终止显色后的酶标板立即在450nm下测定各孔单波长吸光值。

[0031] 有融合细胞的上清的读数等于或大于阴性对照读数的2.1倍时，这样的融合孔即为阳性孔。

[0032] 为了进一步确定得到阳性孔所分泌抗体是针对有机磷农药，再通过竞争间接ELISA法筛选。用碳酸盐包被缓冲液稀释包被3-甲基4-硝基苯基-O-丁酸-卵清蛋白偶联物，96孔酶标板中每孔加入50μL，于4℃冰箱放置过夜或于37℃放置2小时；将酶标板中包被液倒尽，并用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；

[0033] 明胶可用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液稀释成1％的浓度，96孔酶标板中每孔加入100μL，37℃放置1-2小时；将酶标板中封闭液倒尽，并用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液缓冲液洗涤5次；

[0034] 用细胞培养上清与待测样品和含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液等体积充分混合，后以每孔50μL加到微量分析板中；以未融合细胞的上清作为阴性对照；37℃放置1小时；将酶标板中反应液倒尽，并用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次； [0035] 用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，96孔酶标板中每孔加入50μL，37℃放置1小时；将酶标板中反应液倒尽，并用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液缓冲液洗涤6次；

[0036] 用底物缓冲液现配四甲基联苯胺显色液，96孔酶标板中每孔加入50μL，37℃暗处反应10-30min；

[0037] 96孔酶标板中每孔加入2mol/L硫酸25μL，终止显色。终止显色后的酶标板立即在450nm下测定各孔单波长吸光值，用只加细胞培养上清而不含农药的孔作阳性对照吸光值为A0，加农药的孔吸光值为A，若A＜A0，则说明所制备的抗体能与农药反应，这样的孔即为阳性孔，阳性孔通过有限稀释法进行亚克隆，其杂交瘤细胞分泌的上清即为所制的单克隆抗体。产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞1D12-B5，于2009年2月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉武汉大学邮编：430072，保藏编号为CCTCC NO：C200906。 [0038] 有益效果本发明在半抗原结构筛选等大量前期工作基础上开发了一组具有自主知识产权的ELISA组合(指分别用于免疫原和包被抗原的半抗原组合)，并以此半抗原组合建立了一套O，O-二甲氧基硫代磷酸酯类农药ELISA检测方法。与现有检测技术相比，其优点和积极效果表现在：

[0039] 实用性好：传统的农药分析主要在实验室进行，其前处理过程烦琐，分析速度慢、成本高，使用的大量有机溶剂易造成环境污染，且对实验室的仪器化程度和人员素质要求较高，不能满足农产品贸易对快速、简便、准确、大量检测的需求。而我们提供的ELISA检测方法具有操作简单、快速(以封闭好的微量分析板做检测只需要2～3小时即可)、分析成本低、分析容量大、安全可靠等优点，一般不需贵重仪器，可大量简化甚至省去前处理过程，对使用人员的专业技术水平要求不高，容易普及和推广，特别适用于大批 量样本检测和现场监测。

[0040] 抗原和抗体稳定性好：此法合成的免疫原和包被原具有较好的稳定性，-20℃冰箱至少可以存放5年不影响其免疫原性。杂交瘤细胞冻存于液氮至少保持3年，抗体的稳定性也比较好，纯化的抗体-20℃冰箱至少可以存放2年。

[0041] 检测谱广：能同时识别六种O，O-二甲氧基硫代磷酸酯类有机磷农药，为扩大检测范围提供了有力的理论基础。

[0042]

[0043] 杂交瘤细胞1D12-B5，于2009年2月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉武汉大学邮编：430072，保藏编号为CCTCC NO：C200906。

[0044] 具体实施方式

[0045] 1免疫原的合成方法为：

[0046] (1)免疫半抗原3-[4-(O，O-二甲基硫代磷酰氧基)苯基]-1-丙酸(分子式：C11H15O5PS，结构式： )的合成：称取3-[4羟基]苯丁酸1.06g(约
6.4mmol)和氢氧化钾0.9g(16mmol)置于反应瓶中，加35mL甲醇溶解；搅拌下将O，O-二甲基硫代磷酰氯1.54g(约9.6mmol)缓慢滴加到反应瓶中，加热至65℃，回流12小时后结束反应。先用pH试纸测量反应终体系的pH值，确保体系呈碱性；乙酸乙酯洗涤反应终液3次(50mL×3)，去除非酸有机物；浓盐酸调洗涤后的水相pH值3-4，50mL乙酸乙酯抽提3次(50mL×3)，饱和盐水洗涤乙酸乙酯相(20mL×2)；再用50ml水洗涤乙酸乙酯相。无水硫酸钠干燥乙酸乙酯相过夜，过滤后减压蒸馏得到3.54g固体产物，即为免疫半抗原3-[4-(O，O-二甲基硫代磷酰氧基)苯基]-1-丙酸。

[0047] (2)免疫原“3-[4-(O，O-二甲基硫代磷酰氧基)苯基]-1-丙酸-牛血清白蛋白偶联物”的合成：反应瓶中加入免疫半抗原3-[4-(O，O-二甲基硫代磷酰氧基)苯基]-1-丙酸0.29g和N-羟基琥珀酰亚胺0.138g，再加入N，N-二甲基甲酰胺0.2mL溶解；称取0.309gN，N-二环乙基碳二亚胺，用0.3mLN，N-二甲基甲酰胺溶解，并滴加到反应瓶中；反应在磁力搅拌下室内温度进行7小时。反应终液置4℃冰箱冷却2小时以上，经8000rpm离心5分钟，取上清活泼酯液十分缓慢的加入到2ml 5.3mg/ml的牛血清白蛋白蛋白中，反应在磁力搅拌下室温搅拌4小时。将反应液置透析袋内，于0.2mol/L pH6.8的磷酸缓冲液中4℃搅拌透析，每4小时换一次透析液，共透析60小时。透析结束后，透析袋中的白色乳状液即为免疫原“3-[4-(O，O-二甲基硫代磷酰氧基)苯基]-1-丙酸-牛血清白蛋白偶联物”，其浓度为5mg/ml。将所得免疫原分装于若干1mL离心管中，于-20℃冰箱中存放备用。所合成的免疫原保存期限为3年。

[0048] 2包被抗原的合成方法为：

[0049] (1)同源包被原“3-[4-(O，O-二甲基硫代磷酰氧基)苯基]-1-丙酸卵清蛋白偶联物”的合成：反应瓶中加入同源包被原3-[4-(O，O-二甲基硫代磷酰氧基)苯基]-1-丙酸0.29g和N-羟基琥珀酰亚胺0.138g，再加入N，N-二甲基甲酰胺0.2mL溶解；称取0.309g N，N-二环乙基碳二亚胺，用0.3mL N，N-二甲基甲酰胺溶解，并滴加到反应瓶中；反应在磁力搅拌下室内温度进行7小时。反应终液置4℃冰箱冷却2小时以上，经8000rpm离心5分钟，取上清活泼酯液十分缓慢的加入到2ml 5.3mg/ml的卵清蛋白中，反应在磁力搅拌下室温搅拌4小时。将反应液置透析袋内，于0.2mol/L pH6.8的磷酸缓冲液中4℃搅拌透析，每
4小时换一次透析液，共透析60小时。透析结束后，透析袋中的白色乳状液即为同源包被原“3-[4-(O，O-二甲基硫代磷酰氧基)苯基]-1-丙酸卵清蛋白偶联物”，其浓度为4.87mg/ml。将所得包被原分装于若干1mL离心管中，于-20℃冰箱中存放备用。所合成的免疫原保存期限为3年。

[0050] (2)异源包被半抗原“3-甲基4-硝基苯基-O-丁酸”(分子式：C11H13O5N，结构式： 的合成：239用20mL DMF溶解2.89g(约20mmol)3-甲基4-硝基苯酚，与8.3g(约60mmol)碳酸氢二钾一起放入三口反应瓶中，缓慢搅拌，将反应瓶置于油浴锅中；再将4.28g(约24mmol)溴代丁酸乙酯缓慢加入。温度达到100℃开始计时，保温反应2-2.5小时。反应结束后自然冷却，真空抽滤，旋干溶剂；再用乙酸乙酯溶解，水洗2次(50mL/次)，无水硫酸钠干燥，旋干得中间产物3-甲基4-硝基苯基-O-丁酸乙酯。用5mL四氢呋喃溶解中间产物，搅拌加入50mL氢氧化钠，回流反应3小时。水解反应结束后，调pH＝3.0后用乙酸乙酯萃取三次，1mol/L碳酸氢钠萃取两次；再调pH＝3.0后用乙酸乙酯萃取三次，无水Na2SO4干燥，旋干溶剂得-棕色粉末状产物3-甲基4-硝基苯基-O-丁酸。 [0051] (3)异源包被抗原“3-甲基4-硝基苯基-O-丁酸-卵清蛋白偶联物”的合成：反应瓶中加入异源包被半抗原-甲基4-硝基苯基-O-丁酸0.239g和N-羟基琥珀酰亚胺
0.138g，再加入N，N-二甲基甲酰胺0.2mL溶解；称取0.309g N，N-二环乙基碳二亚胺，用
0.3mL N，N-二甲基甲酰胺溶解，并滴加到反应瓶中；反应在磁力搅拌下室内温度进行7小时。反应终液置4℃冰箱冷却2小时以上，经8000rpm离心5分钟，取上清活泼酯液十分缓慢的加入到2ml 5.3mg/ml的卵清蛋白中，反应在磁力搅拌下室温搅拌4小时。将反应液置透析袋内，于0.2mol/LpH6.8的磷酸缓冲液中4℃搅拌透析，每4小时换一次透析液，共透析
60小时。透析结束后，透析袋中的白色乳状液即为异源包被原“3-甲基4-硝基苯基-O-丁酸-卵清蛋白偶联物”，其浓度为5mg/ml。将所得包被原分装于若干1mL离心管中，于-20℃冰箱中存放备用。所合成的免疫原保存期限为3年。

[0052] 实施例1自来水样品中检测O，O-二甲氧基硫代磷酸酯类(以甲基对硫磷为例)农药残留

[0053] ELISA反应体系主要条件

[0054] “3-甲基4-硝基苯基-O-丁酸-卵清蛋白偶联物”包被物2.5μg/ml在微量分析板中每孔加50μl，单克隆抗体稀释32倍作为工作浓度，1％明胶作封闭物，抗原抗体反应液磷酸盐-吐温缓冲液中甲醇含量为5％、pH值为7.4、离子强度为0.15mol/L，微量分析板中每孔50μl。

[0055] 待测样品准备

[0056] 自来水样品：量取自来水1L，加入甲基对硫磷标准品净重2mg，配制成2ppm的液体 样品。

[0057] 采用ELISA检测方法对以上样品进行检测，操作如下：

[0058] (1)包被

[0059] “3-甲基4-硝基苯基-O-丁酸-卵清蛋白偶联物”作为包被物，2.5μg/mL在微量分析板中每孔加50μL，4℃冰箱过夜，倒净，以含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤3～6次并倒置、在吸水纸上拍干；

[0060] (2)封闭

[0061] 1％明胶作封闭物，微量分析板每孔100μL，37℃反应2小时，倒净，以含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤3～6次并倒置、在吸水纸上拍干；

[0062] (3)加抗体及抗体与待测样品的混合液

[0063] 取待测样品100μL加到900μL反应基质中配制成待测液，稀释16倍的细胞培养上清与待测液和含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液等体积充分混合，以每孔50μL加到微量分析板中，37℃反应1小时，倒净，以含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤3～6次并倒置、在吸水纸上拍干；

[0064] (4)加酶标二抗

[0065] 用pH7.4、0.15mol/L的含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液将商品化的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体稀释20000倍，微量分析板每孔加50μL，37℃反应1小时，倒净，以含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤3～6次并倒置、在吸水纸上拍干。

[0066] (5)显色

[0067] 微量分析板每孔加50μL的四甲基联苯胺底物溶液，37℃显色反应10分钟。 [0068] (6)终止反应并读数

[0069] 加2mol/L的硫酸，微量分析板每孔加25μL终止显色反应，酶联仪上450nm处读出吸光值，Bo＝0.708，待测样品吸光值B＝0.435。

[0070] (7)数据处理