一种抽提牛精子线粒体DNA的方法

摘要

本发明公开了一种抽提牛精子线粒体DNA的方法，该方法采用低渗溶液裂解牛精子。本发明的方法无需昂贵的机器设备，使用常规试剂，操作方法简单易行，解决了从冷冻的牛精子小管中抽提线粒体DNA的难题。

权利要求

1.一种抽提牛精子线粒体DNA的方法，其特征在于：所述方法包括采用低渗溶液裂解牛精子，所述低渗溶液裂解的时间为0.5～24小时，所述低渗溶液裂解的温度为10～

50℃，所述经低渗溶液裂解的牛精子通过以下步骤获得牛精子线粒体DNA：

1)离心弃上清；

2)加入STE悬浮；

3)加入蛋白酶K和10％的SDS消化蛋白质；

4)加入饱和酚、和氯仿/异戊醇以去除蛋白质，离心后取上清；

5)上清加入NaAc混匀，再加入无水乙醇沉淀；

6)离心弃上清，再用乙醇洗涤沉淀；

7)离心后室温风干。

说明书

一种抽提牛精子线粒体DNA的方法

技术领域

[0001] 本发明属于遗传工程领域，具体涉及一种抽提牛精子线粒体DNA的方法。

背景技术

[0002] 线粒体DNA(mtDNA)是指细胞内独立于核基因组外的遗传物质，为一双链环状、大小约为16KB并能自我复制的脱氧核糖核苷酸。线粒体在细胞凋亡、衰老及程序化死亡中发挥有重要作用，在畜牧业，奶牛的产奶量和乳脂量、肉牛的肉质及产犊率等可能都与mtDNA相关(Tamassia M，et al.Evidence of oocyte donorcow effect over oocyte production and embryo development in vitro.Reproduction，2003，126(5)：629～637)，最近还发现mtDNA单倍型与牛体外胚胎生产(IVP)效率有关(Tamassia M，Nuttinck F，Reynier P，et al.In vitro embyro production efficiency incattle and its association with oocyte adenosine triphosphate content，quantity ofmitochondrial DNA，and mitochondrial DNA haplogroup.Biol Reprod，2004，71(2)：697～704)。牛精子线粒体DNA突变影响ATP的产生时(冯雪莹 等，寡精和严重少精患者精子线粒ATPase6基因突变的研究，生殖与避孕，2006，26(6)：336～339)，必将影响精子活力，导致生育障碍，所以很有必要抽提牛精子线粒体DNA对其进行研究。

[0003] 普通的从全血或组织中抽提DNA的方法例如冯凯等介绍的方法(冯凯，刘兴，蒋建新。介绍一种从全血中抽提DNA的方法.第三军医大学学报，2004，26(4)：368～369)，包括PBS洗涤，蛋白酶K和去污剂消化，酚和氯仿纯化，乙醇沉淀，TE溶解。该方法因为使用的去污剂、即SDS不能消化掉精子的细胞膜而裂解精子，并不适用于抽提精子线粒体DNA。

[0004] 精子的线粒体位于尾部中段，为尾部鞭毛的摆动提供能量。冷冻的牛精子小管中含有卵黄甘油等复杂物质，用普通的抽提组织线粒体DNA方法并不可行，且精子的线粒体在微丝的帮助下融合，它与鞭毛共同组成线粒体鞘，进一步增加了抽提精子线粒体DNA的5 8
难度。一个卵母细胞含高达10 到10 的线粒体NDA拷贝，而一个成熟的精子中仅含有100个线粒体DNA拷贝，所以从精子中抽提DNA十分不易。

[0005] 目前没有有效的抽提精子线粒体DNA的方法，因此要想获得大量的DNA，必须首先分离线粒体。目前与此最为接近的是从组织中抽提线粒体DNA，它主要是通过差速离心法分离线粒体(尚涛等，提取分离肺脏线粒体的方法研究，河北医药，2006，28(4)：252-253)，在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器，在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。差速离心只用于分离大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。通过差速离心可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。而且这种离心分离需要超速离心机，机器设备成本巨大，且需要额外的试剂，不适合于推广应用。

[0006] 低渗技术普通应用于细胞显微镜观察，但用于抽提线粒体DNA目前未见有报道。

发明内容

[0007] 本申请的发明人在研究中发现，采用低渗溶液裂解牛精子后，再使用常规抽提线粒体DNA的方法，可以成功地获得牛精子线粒体DNA。

[0008] 因此，本发明的目的就在于提供一种抽提牛精子线粒体DNA的方法。

[0009] 本发明的抽提牛精子线粒体DNA的方法，包括采用低渗溶液裂解牛精子。

[0010] 根据本发明的一个具体实施例，所述低渗溶液优选的是渗透压在0～100Osm的溶液。

[0011] 根据本发明，所述低渗溶液裂解的时间为0.5～24小时。

[0012] 根据本发明，所述低渗溶液裂解的温度为10～50℃。

[0013] 根据本发明，经低渗溶液裂解后的牛精子，进一步采用常规抽提线粒体DNA的步骤即可获得牛精子线粒体DNA，这些步骤包括：

[0014] 1、离心弃上清；

[0015] 2、加入STE悬浮；

[0016] 3、加入蛋白酶K和10％的SDS消化蛋白质；

[0017] 4、加入饱和酚和氯仿/异戊醇以去除蛋白质，离心后取上清；

[0018] 5、上清加入NaAc混匀，再加入无水乙醇沉淀；

[0019] 6、离心弃上清，再用乙醇洗涤沉淀；

[0020] 7、离心后室温风干。

[0021] 本发明的方法无需昂贵的机器设备，使用常规试剂，操作方法简单易行，冷冻的牛精子小管中含有卵黄甘油等复杂物质，用普通的抽提组织线粒体DNA方法并不可行，且精子的线粒体在微丝的帮助下融合，它与鞭毛共同组成线粒体鞘，进一步增加了抽提精子线粒体DNA的难度，本发明解决了从冷冻的牛精子小管中抽提线粒体DNA的难题，具有重要的生物学意义及实际的应用价值。

附图说明

[0022] 图1是渗透压为0Osm溶液裂解牛精子(室温20℃，1h)后抽提牛精子线粒体DNA的电泳结果。

[0023] 图2是渗透压为25Osm溶液裂解牛精子(室温20℃，1h)后抽提牛精子线粒体DNA的电泳结果。

[0024] 图3是渗透压为50Osm溶液裂解牛精子(室温20℃，1h)后抽提牛精子线粒体DNA的电泳结果。

[0025] 图4是渗透压为75Osm溶液裂解牛精子(室温20℃，1h)后抽提牛精子线粒体DNA的电泳结果。

[0026] 图5是渗透压为100Osm溶液裂解牛精子(室温20℃，1h)后抽提牛精子线粒体DNA的电泳结果。

[0027] 图6是渗透压为125Osm溶液裂解牛精子(室温20℃，1h)后抽提牛精子线粒体DNA的电泳结果。

[0028] 图7是渗透压为150Osm溶液裂解牛精子(室温20℃，1h)后抽提牛精子线粒体DNA的电泳结果。

[0029] 图8是渗透压为50Osm溶液不同裂解温度下(1h)的抽提牛精子线粒体DNA的电泳结果。

[0030] 图9是渗透压为50Osm溶液不同裂解时间下(室温20℃)的抽提牛精子线粒体DNA的电泳结果。

[0031] 图10是牛精子mtDNA的NlaIII酶切后电泳分析结果(1％琼脂糖凝胶电泳，TAE缓冲液，pH 8.0，电压150V，40分钟)。

具体实施方式

[0032] 以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

[0033] 以下实施例中，使用的牛精子购自光明乳业股份有限公司。

[0034] STE配方：50Mm Tris，pH7.5，1mM EDTA，pH8.0，0.1M NaCl。

[0035] 蛋白酶K：购自CALBIOCHEM公司。

[0036] 以下实施例中，如非特别说明，所用试剂均购自TAKARA公司。

[0037] 实施例1、低渗溶液浓度的确定

[0038] 为摸索裂解精子最佳的渗透压，将溶液(320Osm)(正常生理盐水的渗透压是320Osm，低于320Osm称为低渗溶液)稀释为不同的渗透压，分别在显微镜下观察，若精子破裂，尾巴伸直，标记为“+”，若精子没有破裂标记为“-”，观察结果如表1所示。

[0039] 表1、合适的渗透压的确定

[0040]

[0041] 由表1的结果可知，在不同渗透压下牛精子表现状态不同，牛精子在0～100Osm可以破裂，而在＞100Osm则没有破裂，由此确定适合用于裂解牛精子的渗透压为0～100Osm。

[0042] 实施例2、牛精子线粒体DNA的抽提

[0043] 首先取储存冷冻精液的小管，用温水复苏，然后按照以下步骤抽提牛精子线粒体DNA：

[0044] 1)复苏的精液于2000rpm离心10分钟后弃上清；

[0045] 2)分别加入1ml渗透压依次为0Osm、25Osm、50Osm、75Osm、100Osm、125Osm、150Osm的低渗溶液，上下颠倒数次混匀，于室温20℃静置1小时以裂解精子，然后8000rpm离心5分钟后弃上清；

[0046] 3)沉淀加入320μl STE悬浮，用移液器吹打混匀；

[0047] 4)悬浮液中加入5μl蛋白酶K(20mg/ml)和10μl 10％的SDS，在振荡器上充分混匀后放入37℃水浴过夜；

[0048] 5)反应液中加入200μl饱和酚和200μl氯仿/异戊醇充分混匀，13000rpm离心10分钟，取上清；

[0049] 6)上清液先加入40μl NaAc混匀后，再加入800μl预冷的无水乙醇，于-20℃冰箱静置2小时，然后13000rpm离心10分钟，再加入800μl 80％乙醇洗涤一次；

[0050] 7)离心后室温风干(约1小时)，加入20μl双蒸水溶解备用。

[0051] 实施例3、牛精子线粒体DNA的检测

[0052] 3.1、引物设计

[0053] 针对牛线粒体DNA设计特异的引物如下：

[0054] P1：5`-CTGCAGTCTCACCATCAACC-3`

[0055] P2：5`-GTGTAGATGCTTGCATGTGTAAGT-3`

[0056] 目的片段长1094bp。

[0057] 3.2、PCR扩增

[0058] 以实施例2抽提的牛精子线粒体DNA为模板进行PCR扩增：

[0059] 反应体系(25μl)：模板1μl，引物(10μM)1μl，ExTaq酶0.2μl，Buffer2.5μl，dNTP(2.5mM)2μl，ddH2O 17.3μl。

[0060] 反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min；58℃复性1min，72℃延伸2min，循环32次；72℃，再延伸10min。

[0061] 将所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1～7所示。

[0062] 由图1～7的结果可知，经过渗透压为0～100Osm溶液裂解后，可以容易地抽提到牛精子线粒体DNA，而125Osm及150Osm溶液不能裂解牛精子，因此得不到牛精子线粒体DNA。

[0063] 3.3、限制酶酶切鉴定

[0064] 通过限制性内切酶NlaIII对PCR产物进行酶切，NlaIII能够特异性识别牛精子线粒体DNA中的碱基序列CATG，并在序列的两端打开磷酸二脂键产生粘性末端。

[0065] 酶切条件：buffer 2μl，NlaIII 0.2μl，PCR产物5μl，双蒸水12.8μl，反应体系共20μl，37°水浴8个小时。

[0066] 将所得酶切产物进行电泳，1％琼脂糖凝胶，TAE缓冲液，pH 8.0，电压150V，40分钟，结果如图10所示。

[0067] 由图10的结果可知，酶切后各片段的大小加起来与步骤3.2扩增的PCR片段的大小相符，进一步证明扩增牛精子线粒体DNA成功。

[0068] 实施例4、温度和时间对低渗溶液裂解牛精子抽提线粒体DNA的影响[0069] 为了进一步摸索温度和时间对低渗溶液裂解牛精子抽提线粒体DNA的影响进行以下实验：

[0070] 4.1、温度

[0071] 首先复苏精子，然后使用渗透压为50Osm溶液在不同温度下(80℃、65℃、50℃、35℃、10℃、4℃)裂解牛精子1小时，按照实施例2所述的步骤抽提牛精子线粒体DNA，按照实施例3所述的方法进行牛精子线粒体DNA的检测，结果如图8所示。

[0072] 由图8的结果可知，在10～50℃裂解的牛精子可以抽提得到线粒体DNA。

[0073] 4.2、时间

[0074] 首先复苏精子，然后使用渗透压为50Osm溶液在室温20℃下裂解牛精子(5分钟、30分钟、24小时、48小时)，按照实施例2所述的步骤抽提牛精子线粒体DNA，按照实施例3所述方法进行牛精子线粒体DNA的检测，结果如图9所示。

[0075] 由图9的结果可知，在室温下裂解30分钟～24小时的牛精子可以抽提得到线粒体DNA。

[0076] 由图8和图9的结果可以看出，低渗溶液裂解牛精子的最佳条件是10～50℃静置30分钟～24小时。