一种组织工程化生物活性种植体表面处理方法

摘要

一种组织工程化生物活性种植体表面处理方法包括如下步骤：(1)从自体髂骨获取骨髓基质干细胞，或从拔除的新鲜健康牙齿获取牙周膜干细胞；(2)将骨髓基质干细胞或牙周膜干细胞放入加入有α-MEM培养基的培养皿中，在骨髓基质干细胞或牙周膜干细胞中添加促进细胞外基质分泌因子，形成骨髓基质干细胞聚集体或牙周膜干细胞聚集体；(3)用骨髓基质干细胞聚集体或牙周膜干细胞聚集体包裹种植体；(4)包裹种植体放置在培养基中；(5)在培养基中添加维生素C和地塞米松促进细胞外基质分泌，使骨髓基质干细胞或牙周膜干细胞聚集体与种植体形成具有生物活性的组织工程化种植体。解决骨质疏松症、糖尿病以及放疗后修复患者对于种植体成功率低的问题。

权利要求

1.一种组织工程化生物活性种植体表面处理方法，其特征是：包括如下步骤：

1）从拔除的新鲜健康牙齿获取牙周膜干细胞PDLSCs；

2）将牙周膜干细胞PDLSCs放入加入有α-MEM培养基的培养皿中，在牙周膜干细胞PDLSCs的培养皿中添加促进细胞外基质分泌因子，进行牙周膜干细胞的体外复层化生长，形成牙周膜干细胞聚集体；

3）用牙周膜干细胞聚集体包裹种植体；

4）包裹种植体放置在培养基中；

5）在培养基中添加维生素C和地塞米松促进细胞外基质分泌，使牙周膜干细胞聚集体与种植体形成具有生物活性的组织工程化种植体；

所述的干细胞聚集体是将牙周膜干细胞分别铺满培养皿后，使用诱导液促进细胞外基质ECM分泌，细胞复层化生长，形成的膜状细胞层。

2.根据权利要求1所述的一种组织工程化生物活性种植体表面处理方法，其特征在于：拔除后的牙齿经0.01mol/LPBS冲洗后，无菌条件下，用锐利的手术刀片刮取根中1/3区3

域的牙周组织；将组织块切割成约1mm 的小块,并放置在含15%的α-MEM培养基中,在

37℃、5％CO2和饱和湿度条件下培养5～8天，直至有细胞从组织块边缘爬出；细胞生长达

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80%汇合时，用胰酶消化传代，采用稀释法，以1×10 个细胞接种到100mm 培养皿获得纯化的多克隆牙周膜干细胞。

3.根据权利要求1所述的一种组织工程化生物活性种植体表面处理方法，其特征在于：所述的生物活性的组织工程化种植体是：将膜状干细胞聚集体裹附于干燥无菌的常规种植体上，静置于37℃、5％CO2孵箱中30分钟，待两者复合紧密后，将复合体放入4℃的诱导液中1小时，利用温差促进膜状干细胞聚集体、种植体两者进一步紧密复合。

4.根据权利要求1所述的一种组织工程化生物活性种植体表面处理方法，其特征在于：所述的复合体的体外培养是将构建好的干细胞复合体放入孵箱内静置30分钟，使其两者初步结合，将干细胞复合体放入4℃诱导液中1小时，利用温差效应促进细胞聚集体收缩，进一步增强两者结合强度，最后将干细胞复合体放入孵箱内，通过温控器调节孵箱的温度在37℃，5％的CO2浓度培养3周，促进细胞分泌基质与种植体结合。

5.根据权利要求3或4所述的一种组织工程化生物活性种植体表面处理方法，其特征在于：所述的诱导液是维生素C、地塞米松和α-MEM培养基的混合液。

说明书

一种组织工程化生物活性种植体表面处理方法

技术领域

[0001] 本发明涉及颅颌面种植体医疗方法，特别是一种组织工程化生物活性种植体表面处理方法。

背景技术

[0002] 具有多向分化及组织再生能力的多能干细胞，作为组织工程的种子细胞，在促进组织修复，治疗系统性疾病等方面取得了良好的效果，逐渐得到广泛应用和开发。细胞聚集体技术是组织工程中利用种子细胞构建再生组织的一种新型技术，利用该项技术可以在适宜的支架材料上复合大量的种子细胞，体外构建组织工程化组织。目前现有的颅颌面种植体主要包括钛、钛合金以及锆瓷材料，通过表面物理(酸蚀喷砂)、化学(微弧氧化)以及生物涂层(HA)等处理加工而成，多用于常规的口内牙列缺损，颅颌面缺损的种植修复。一般经过2-3个月的无负重愈合后，植入种植体均能获得骨结合。但是，种植体骨结合的成功与否涉及到宿主和植入体两个方面，单纯的对植入体表面进行物理或化学性修饰并不能解决宿主植入区骨组织血管化差、易感染的问题。对于临床常见的患有糖尿病，骨质疏松症以及放疗后患者，由于全身或局部因素，导致植入区骨组织血管化差、易感染等问题，最终难以获得骨结合，种植体失败率较高。因此，现有的单纯进行材料表面物理、化学处理的种植体，难以适合于每位患者，而且对于希望在放疗区植入种植体进行种植体支持的赝复体修复的患者而言，更难以实现种植体骨结合的目的。目前临床上针对此类特殊人群，为促进种植区骨结合而进行关于联合组织工程技术进行具有生物活性种植体加工技术的研制尚未见报道。

发明内容

[0003] 本发明的目的是提供一种组织工程化生物活性种植体表面处理方法，为特殊患者提代种植体加工，使得种植体能够在特殊的植入区获得骨结合，解决种植体置入宿主植入区骨组织易血管化和骨结合的问题，为后期种植义齿修复以及颌面部缺损修复奠定基础。

[0004] 本发明的目的是这样实现的，一种组织工程化生物活性种植体表面处理方法，其特征是：包括如下步骤：

[0005] (1)从自体髂骨获取骨髓基质干细胞BMMSc，或从拔除的新鲜健康牙齿获取牙周膜干细胞PDLSCs；

[0006] (2)将骨髓基质干细胞BMMSc或牙周膜干细胞PDLSCs放入加入有α-MEM培养基的培养皿中，在骨髓基质干细胞BMMSc或牙周膜干细胞PDLSCs的培养皿中添加促进细胞外基质分泌因子，进行骨髓基质干细胞或牙周膜干细胞的体外复层化生长，形成骨髓基质干细胞聚集体或牙周膜干细胞聚集体；

[0007] (3)用骨髓基质干细胞聚集体或牙周膜干细胞聚集体包裹种植体；

[0008] (4)包裹种植体放置在培养基中；

[0009] (5)在培养基中添加维生素C和地塞米松促进细胞外基质分泌，使骨髓基质干细胞聚集体或牙周膜干细胞聚集体与种植体形成具有生物活性的组织工程化种植体。

[0010] 所述骨髓基质干细胞BMMSc的获取是从自体髂骨嵴处抽取自体骨髓，将骨髓与α-MEM混匀，离心去除上层脂肪滴及上清，以PBS重新悬浮细胞后将其悬液平铺于淋巴细胞分离液上，再次离心后吸取中间层的白膜层，即单核细胞层，用PBS缓冲液洗涤2次，离6 2
心后弃去上清，用α-MEM 10％FBS重新吹悬；按2.0×10/ml浓度接种于10cm 培养皿，在
37℃、5％CO2和饱和湿度条件下培养；24h后半量换液，换液前轻轻摇晃，使未贴壁细胞悬浮，倒掉一半培养液，之后重新换入含有10％FBS的α-MEM；间隔24h后再次半量换液以清除未贴壁细胞；两次半量换液后，细胞隔日洗涤、全量换液，逐渐获得纯化的骨髓基质干细胞。

[0011] 所述牙周膜干细胞的获取是选取因正畸治疗需要拔除、没有牙体、牙周组织炎症和畸形的第三磨牙，拔除后的牙齿经0.01mol/L PBS冲洗后，无菌条件下，用锐利的手术3
刀片刮取根中1/3区域的牙周组织；将组织块切割成约1mm 的小块，并放置在含15％的α-MEM培养基中，在37℃、5％CO2和饱和湿度条件下培养5～8天，直至有细胞从组织块
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边缘爬出；细胞生长达80％汇合时，用胰酶消化传代，采用稀释法，以1×10 个细胞接种到
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100mm 培养皿获得纯化的多克隆牙周膜干细胞。

[0012] 所述干细胞聚集体是将骨髓基质干细胞或牙周膜干细胞分别铺满培养皿后，使用诱导液促进细胞外基质(ECM)分泌，细胞复层化生长，形成的膜状细胞层。

[0013] 所述生物活性的组织工程化种植体是：将膜状干细胞聚集体裹附于干燥无菌的常规种植体上，静置于37℃、5％CO2孵箱中30分钟，待两者复合紧密后，将复合体放入4℃添加维生素C、地塞米松和α-MEM培养基的诱导液中1小时，利用温差促进膜状干细胞聚集体、种植体两者进一步紧密复合。

[0014] 所述的复合体的体外培养是将构建好的干细胞复合体放入孵箱内静置30分钟，使其两者初步结合，将干细胞复合体放入4℃诱导液中1小时，利用温差效应促进细胞聚集体收缩，进一步增强两者结合强度，最后将干细胞复合体放入孵箱内，通过温控器调节孵箱的温度在37℃，5％的CO2浓度培养3周，促进细胞分泌基质与种植体结合。

[0015] 所述的诱导液是维生素C、地塞米松和α-MEM培养基的混合液。

[0016] 本发明的有益效果是：由于本发明从自体髂骨获取骨髓基质干细胞BMMSc，或从拔除的新鲜健康牙齿获取牙周膜干细胞PDLSCs；对骨髓基质干细胞或牙周膜干细胞的体外复层化生长，形成骨髓基质干细胞聚集体或牙周膜干细胞聚集体，用骨髓基质干细胞聚集体或牙周膜干细胞聚集体包裹种植体然后；进行培养形成具有生物活性的组织工程化种植体。这种生物活性的组织工程化种植体适用于由于糖尿病、放疗以及骨质疏松症引起的植入区骨组织愈合能力差、血管化程度差、易感染的患者，它能促进种植体在特殊的植入区获得骨结合，进一步扩大种植体的适用范围，使更多的患者能够享受到种植技术带来的好处，拟突破骨质疏松症、糖尿病以及放疗后修复患者对于种植体使用的限制，解决对于这些患者种植体成功率低的问题。

附图说明

[0017] 下面结合实施例附图对本发明做进一步说明。

[0018] 图1是干细胞聚集体体外构建示意图；

[0019] 图2是干细胞种植体的体外构建示意图；

[0020] 图3是干细胞种植体复合物的体外培养示意图。

[0021] 图中：1、培养皿；2、α-MEM培养基；3、干细胞；4、分泌基质的因子；5、细胞基质；6、多细胞聚集体；7、种植体；8、干细胞复合体；9、诱导液；10、孵箱；11、温控器。

具体实施方式

[0022] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，应理解，下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明实施的范围。

[0023] 本发明组织工程化生物活性种植体表面处理方法，包括如下步骤：

[0024] (1)从自体髂骨获取骨髓基质干细胞BMMSc，或从拔除的新鲜健康牙齿获取牙周膜干细胞PDLSCs；

[0025] (2)将骨髓基质干细胞BMMSc或牙周膜干细胞PDLSCs放入加入有α-MEM培养基2的培养皿1中，在骨髓基质干细胞BMMSc或牙周膜干细胞PDLSCs的培养皿1中添加促进细胞外分泌基质的因子4，进行骨髓基质干细胞或牙周膜干细胞的体外复层化生长，形成骨髓基质干细胞聚集体或牙周膜干细胞聚集体；

[0026] (3)用骨髓基质干细胞聚集体或牙周膜干细胞聚集体包裹种植体7；

[0027] (4)包裹种植体7放置在培养基中；

[0028] (5)在α-MEM培养基2中添加维生素C和地塞米松促进细胞外基质分泌，使骨髓基质干细胞聚集体或牙周膜干细胞聚集体与种植体形成具有生物活性的组织工程化种植体。

[0029] 如图1所示，给出干细胞聚集体体外构建示意图。通过提取纯化的原代干细胞3(骨髓基质干细胞BMMSc或牙周膜干细胞PDLSCs)放入加入有α-MEM培养基2的培养皿
1中，在α-MEM培养基2的培养皿1中，干细胞3(骨髓基质干细胞BMMSc或牙周膜干细胞PDLSCs)体外进行扩增，干细胞3(骨髓基质干细胞BMMSc或牙周膜干细胞PDLSCs)约5天铺满整个培养皿1底部时，开始添加促进细胞基质大量分泌的维生素C，使其大量分泌细胞基质5(ECM)，在2天时成为具有可操作性的多细胞聚集体6。

[0030] 图2是干细胞种植体的体外构建示意图。首先将培养好的多细胞聚集体6根据要加工的种植体外形，将种植体7平放在细胞聚集体表面，将细胞聚集体按照种植体外形裹附其上，构建种植体干细胞复合体8。

[0031] 图3是干细胞种植体复合物的体外培养示意图。将构建好的干细胞复合体8放入孵箱10内静置30分钟，使其两者初步结合，将干细胞复合体8放入4℃诱导液9(添加维生素C、地塞米松和α-MEM培养基)中1小时，利用温差效应促进细胞聚集体收缩，进一步增强两者结合强度，最后将干细胞复合体8放入孵箱10内，通过温控器11调节孵箱10的温度在37℃，5％的CO2浓度培养3周，促进细胞分泌基质与种植体结合，待用。

[0032] 本发明中干细胞3(骨髓基质干细胞(BMMSc)或牙周膜干细胞(PDLSC)的获得可通过下面方法分别得到。

[0033] 骨髓基质干细胞(BMSc)的获取

[0034] 骨髓基质干细胞BMMSc的获取是从自体髂骨嵴处抽取自体骨髓，将骨髓与α-MEM培养基混匀，用离心机以1500rpm×5min去除上层脂肪滴及上清，以PBS缓冲液重新悬浮细胞后将其悬液平铺于淋巴细胞分离液上，吸取中间层的白膜层，即单核细胞层，用PBS洗涤6
2次，用离心机以1500rpm×5min弃去上清，用α-MEM培养基重新吹悬；按2.0×10/ml浓
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度接种于10cm 培养皿，在37℃、5％CO2和饱和湿度条件下培养；干细胞培养24h后半量换液，换液前轻轻摇晃，使未贴壁细胞悬浮，倒掉一半培养液，之后重新换入α-MEM培养基；
间隔24h后再次半量换液以清除未贴壁细胞；两次半量换液后，细胞隔日洗涤、全量换液，逐渐获得纯化的骨髓基质干细胞。

[0035] 牙周膜干细胞(PDLSC)的获取

[0036] 选取因正畸治疗需要拔除、没有牙体、牙周组织炎症和畸形的第三磨牙，拔除后的牙齿经0.01mol/L PBS冲洗后，无菌条件下，用锐利的手术刀片刮取根中1/3区域的牙周组3
织；将组织块切割成约1mm 的小块，并放置在α-MEM培养基中，在37℃、5％CO2和饱和湿度条件下培养5～8天，直至有细胞从组织块边缘爬出；细胞生长达80％汇合时，用胰酶消
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化传代，采用有限稀释法，以1×10 个细胞接种到100mm 培养皿获得纯化的多克隆牙周膜干细胞。

[0037] 干细胞(MSc)聚集体的获取：

[0038] 所述干细胞聚集体是将骨髓基质干细胞或牙周膜干细胞分别铺满培养皿后，使用维生素C、地塞米松和α-MEM培养基构成的的细胞诱导液促进细胞外基质(ECM)分泌，细胞复层化生长，形成的膜状细胞层。

[0039] 将膜状干细胞聚集体裹附于干燥无菌的常规种植体上，静置于37℃、5％CO2孵箱中30分钟，待两者复合紧密后，将复合体放入4℃添加维生素C、地塞米松和α-MEM培养基的诱导液中1小时，利用温差促进膜状干细胞聚集体、种植体两者进一步紧密复合形成生物活性的组织工程化种植体。