产生ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或其内酰胺的重组细胞

摘要

本发明涉及产生ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或其内酰胺的重组细胞。具体地，本发明涉及一种细胞，该细胞与其野生型相比通过如下方式进行基因工程修饰：使得该细胞能够比其野生型从羧酸或羧酸酯产生更多的ω-氨基羧酸、更多的ω-氨基羧酸酯或者更多的从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺。此外，本发明还涉及一种转基因细胞的制备方法，可通过该方法获得的细胞；ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生的内酰胺的制备方法，可通过该方法获得的ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生的内酰胺；基于ω-氨基羧酸或者基于内酰胺的聚酰胺的制备方法，以及可通过该方法获得的聚酰胺。

权利要求

1.一种微生物，该微生物相对于其野生型以如下方式进行基因工程修饰：使得其能够比其野生型由羧酸或羧酸酯生产更多的ω-氨基羧酸、更多的ω-氨基羧酸酯或者更多的从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺，其中，该微生物与其野生型相比具有下列酶EI和酶EIII或者酶EI，酶 EII和酶EIII的增强活性：i)酶 EI，其将羧酸或者羧酸酯催化转换成相应的ω-羟基羧酸或者ω-羟基羧酸酯，该酶 EI 选自下列烷烃单加氧酶：alkBGT 编码的来自恶臭假单胞菌GPo1的烷烃单加氧酶和源于热带假丝酵母的细胞色素-P450-单加氧酶；

ii)酶 EII，其将ω-羟基羧酸或者ω-羟基羧酸酯催化转换成相应的ω-氧代羧酸或者ω-氧代羧酸酯，该酶 EII 选自alkJ 基因编码的醇脱氢酶； iii)酶 EIII，其将ω-氧代羧酸或者ω-氧代羧酸酯催化转换成相应的ω-氨基羧酸或者ω-氨基羧酸酯，该酶 EIII 选自ω-转氨酶。

2.根据权利要求 1 所述的微生物，该微生物具有所有酶 EI、EII 和 EIII 的增强活性。

3.根据权利要求 1～2 中任一项所述的微生物，其中酶 EI 是经过 alkBGT 编码的来自恶臭假单胞菌 GPo1 的烷烃单加氧酶。

4.根据权利要求 1～3 中任一项所述的微生物，其中酶EII经来自恶臭假单胞菌 GPo1 的 alkJ 基因编码。

5.根据权利要求1～4 中任一项所述的微生物，其中酶 EIII 是来自紫色色杆菌 DSM30191 的ω-转氨酶 CV2025。

6.根据上述权利要求中任一项所述的微生物，在微生物中增强了酶 EIV 的表达，该酶将ω-氨基羧酸酯催化转化成相应的ω-氨基羧酸。

7.根据权利要求 6 所述的微生物，其中酶 EIV 是来自荧光假单胞菌的脂肪酶 LipA（Q76D26），所述脂肪酶 LipA（Q76D26）是由所述微生物分泌的。

8.根据上述权利要求中任一项所述的微生物，在微生物中增强了酶 EV 的表达，该酶将ω-氨基羧酸催化转化成相应的内酰胺。

9.根据权利要求 8 所述的微生物，其中酶 EV是由所述微生物分泌的。

10.根据上述权利要求中任一项所述的微生物，该微生物是转基因大肠杆菌微生物、转基因谷氨酸棒状杆菌微生物或者转基因恶臭假单胞菌微生物。

11.一种转基因微生物的制备方法，包括在微生物中增强下列酶EI和酶EIII或者酶EI，酶 EII和酶EIII的活性的方法步骤：i)酶 EI，其将羧酸或者羧酸酯催化转换成相应的ω-羟基羧酸或者ω-羟基羧酸酯，该酶 EI 选自下列烷烃单加氧酶：alkBGT 编码的来自恶臭假单胞菌GPo1的烷烃单加氧酶和源于热带假丝酵母的细胞色素-P450-单加氧酶；

ii)酶 EII，其将ω-羟基羧酸或者ω-羟基羧酸酯催化转换成相应的ω-氧代羧酸或者ω-氧代羧酸酯，该酶 EII 选自alkJ 基因编码的醇脱氢酶； iv)酶 EIII，其将ω-氧代羧酸或者ω-氧代羧酸酯催化转换成相应的ω-氨基羧酸或者ω-氨基羧酸酯，该酶 EIII 选自ω-转氨酶。

12.根据权利要求 11 所述的方法，除了增强酶 EI、EII 或 EIII 的活性之外，也增强酶 EIV 的活性，该酶EIV将ω-氨基羧酸酯催化转化成相应的ω-氨基羧酸；和/或增强酶 EV 的活性，该酶EV将ω-氨基羧酸催化转化成相应的内酰胺，这通过增强这些酶的表达来增强，和酶 EIV 和/或者 EV是由所述微生物分泌的。

13.一种可通过权利要求 11 或 12 获得的转基因微生物。

14.一种用于制备ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺的方法，包括下列方法步骤：I)在使得微生物能够从羧酸或者从羧酸酯形成ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺的条件下，使权利要求1至 10 或 13之一的微生物与含有羧酸或者羧酸酯的培养基接触，或者与邻接含有羧酸或羧酸酯的有机相的培养基接触；

II)视需要分离出所形成的ω-氨基羧酸、所形成的ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺。

15.根据权利要求 14 所述的方法，在额外的方法步骤中使用常规化学方法将方法步骤 I）中形成的ω-氨基羧酸酯转化成ω-氨基羧酸。

16.根据权利要求 14 或 15 所述的方法，所述微生物是转基因大肠杆菌微生物、转基因谷氨酸棒状杆菌微生物或者转基因恶臭假单胞菌微生物。

17.根据权利要求 14～16 中任一项所述的方法，在方法步骤 I）中使用的培养基含有氨基酸，这些氨基酸在通过转氨酶将ω-氧代羧酸或者ω-氧代羧酸酯催化转化成相应ω-氨基羧酸或ω-氨基羧酸酯的过程中起到氨基供体的作用。

18.根据权利要求 14～17 中任一项所述的方法，所述方法在两相系统中进行，包括A)水相，以及B)有机相，

在方法步骤 I）中在水相中通过微生物形成ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺，并在有机相中使得所形成的ω-氨基羧酸、所形成的ω-氨基羧酸酯或者所形成的从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺富集。

19.根据权利要求 14～18 中任一项所述的方法，通过至少两个步骤的提纯方法来分离所形成的ω-氨基羧酸、所形成的ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺，包括a)提取步骤：其中从培养基中提取ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺，以及 b)提纯步骤：采用蒸馏法或者其它提取方法，对方法步骤 a）中获得的提取物进行进一步提纯，获得纯度至少为 99.8％ 的ω-氨基羧酸相、ω-氨基羧酸酯相或者内酰胺相。

20.根据权利要求 19 所述的方法，方法步骤 a) 中的提取是反应萃取。

21.根据权利要求 14～20 中任一项所述的方法，所述羧酸是月桂酸，或者所述羧酸酯是月桂酸酯，且在方法步骤 II）中将月桂酸或月桂酸酯转化成月桂内酰胺。

22.一种基于ω-氨基羧酸制备聚酰胺的方法，包括下列方法步骤：

（α1）通过权利要求 14～21 中任一项所述的方法制备 ω-氨基羧酸，（α2）聚合该ω-氨基羧酸而获得聚酰胺。

23.一种基于内酰胺制备聚酰胺的方法，包括下列方法步骤：

（β1）通过权利要求 14～21 中任一项所述的方法制备内酰胺；

（β2）开环聚合或者缩聚月桂内酰胺而获得聚酰胺。

说明书

产生ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或其内酰胺的重组细胞

技术领域

[0001] 本发明涉及相对于其野生型转基因的细胞；转基因细胞的制备方法，以及可通过该方法获得的细胞；ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生的内酰胺的制备方法，以及可通过该方法获得的ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生的内酰胺；基于ω-氨基羧酸或者内酰胺的聚酰胺的制备方法，以及可通过该方法获得的聚酰胺。

背景技术

[0002] 聚酰胺是是其重复单元(单体)具有酰胺基作为特征的聚合物。“聚酰胺”这一名称通常作为合成工程使用的热塑性塑料的名称，并且以此将该物质类型区别于具有类似化学结构的蛋白质。几乎所有重要的聚酰胺均从伯胺衍生而来，也就是在其重复单元内均会出现官能团-CO-NH-。此外也存在源于仲胺(-CO-NR-，R＝有机基团)的聚酰胺。尤其可将氨基羧酸、内酰胺和/或二胺和二元羧酸作为聚酰胺的单体。

[0003] 基于内酰胺制备聚酰胺的方法尤为重要。例如，可通过开环聚合ε-己内酰胺来获得工业上常用的产品“聚酰胺6”，而通过开环聚合月桂内酰胺则可获得工业上同样重要的“聚酰胺12”。内酰胺的共聚物也有很大的工业意义，例如ε-己内酰胺和月桂内酰胺的共聚物(“聚酰胺6/12”)。

[0004] ε-己内酰胺的制备通常是让环己酮与硫酸氢盐或者羟胺盐酸盐进行反应形成环己酮肟，通过Beckmann重排法将其转换成ε-己内酰胺，通常使用浓硫酸作为催化剂。通常通过环己烷与空气氧的催化氧化反应来制备环己酮，通过苯的加氢反应获得环己烷。 [0005] 月桂内酰胺的制备特别费事。其工业规模的制备方法为：首先使丁二烯进行三聚反应形成环十二碳三烯。接着对环十二碳三烯进行加氢反应形成环十二烷，然后对以此得到的环十二烷氧化得到环十二酮。然后将以此获得的环十二酮与羟胺进行反应形成环十二酮肟，然后再利用Beckmann重排法将其转换成月桂内酰胺。

[0006] 这些由现有技术已知的利用Beckmann重排法由酮肟制备内酰胺的方法的缺点在于：会形成大量的必须加以处置的盐类副产物，例如硫酸钠。因此在现有技术条件下，也有人对没有这些缺点的其它内酰胺制备方法进行了描述。例如专利EP-A-0 748 797就描述了一种用二腈制备内酰胺的方法，即对二腈进行加氢反应形成氨基腈，然后通过环化水解使得氨基腈转变成内酰胺。按照该发明所述，使用例如酸性沸石、硅酸盐和非沸石分子筛的分子筛、金属磷酸盐和金属氧化物或者混合金属氧化物作为环化水解的催化剂。但是该方法的主要缺点在于：通过环化水解使氨基腈转变的选择性很小，因此会形成大量的副产物。除此之外，按照现有技术描述的这种内酰胺制备方法，要使用裂解汽油或石油获得的苯或者丁二烯之类的碳氢化合物，因此源自于不可再生的原料。因此从生态角度来看，基于这样制备的内酰胺制备聚酰胺的方法存在缺点。

发明内容

[0007] 本发明的任务在于，克服现有技术的缺点。

[0008] 本发明的任务尤其在于阐述一种可以用尽可能少的方法步骤，并且在副产物尽可能少的情况下形成内酰胺尤其是月桂内酰胺的方法。

[0009] 本发明的另一项任务就是阐述一种能够使用可再生原料制备内酰胺尤其是月桂内酰胺的方法。

[0010] 有助于解决上述任务的是一种细胞，该细胞相比于其野生型以如下方式进行基因工程修饰：使得该细胞能够比其野生型由羧酸或羧酸酯产生更多的ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯，或者产生更多从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺。可以使用这种细胞以发酵方法制备由羧酸或羧酸酯(例如月桂酸或月桂酸酯)来制备ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯，或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺。

[0011] “使得该细胞能够比其野生型由羧酸或羧酸酯产生更多的ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯，或者产生更多从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺”这一表述也涉及这种情况，即转基因细胞的野生型根本不能形成ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯，或者不能形成从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺，至少不能形成可检出数量的这些化合物，且只有经过转基因(gentechnischen )之后，才能形成可检出数量的这些成分。

[0012] 所谓“野生型”细胞，尤其指其基因组(Genom)处在自然进化状态的细胞。这一概念既可用于整个细胞，也可用于单个的基因。因此“野生型”这一概念 并不包括那些人类利用重组方法至少部分改变了其基因序列的细胞或者基因。

[0013] 按照本发明优选的是，对转基因细胞进行如下方式的基因工程修饰，使其能够在限定的时间间隔之内，优选在2小时之内，更优选在8小时之内，且最优选在24小时之内，形成为野生型细胞的至少2倍之多、尤其至少10倍、此外优选至少100倍、此外更优选至少1000倍以及最好优选至少10000倍的ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺。例如可通过下述方式测定形成产物的增加量：在相同条件下(相同的细胞密度，相同的培养基( )，相同的培养条件)，将本发明所述的细胞与野生型细胞在适当的培养基中培养一定的时间，然后测定培养基内的目标产物含量(ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺)。

[0014] 本发明所述的细胞可以是原核生物或真核生物。其可以是哺乳动物细胞(如人的细胞)、植物细胞或者如酵母、真菌或细菌之类的微生物，其中微生物是尤其优选的，且细菌和酵母是最为优选的。

[0015] 适合作为细菌、酵母或真菌的尤其是Deutschen Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH(德国微生物与细胞培养菌种保藏中心)(DSMZ)作为细菌、酵母或真菌菌株保存的那些细菌、酵母或真菌。本发明所述的适用细菌属于下列网站上列出的种类

[0016] http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm

[0017] 本发明所述的适用酵母属于下列网站上列出的种类

[0018] http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm

[0019] 本发明所述的适用真菌属于下列网站上列出的种类

[0020] http://www.dsmz.de/species/fungi.htm

[0021] 本发明所述特别适用的细胞来自于棒状杆菌属(Corynebac terium)、短杆菌属(Brevibacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维氏酵母属(Kluveromyces)、糖酵母属(Saccharomyces)、埃希氏菌属(Escherichia)、发酵单孢菌属(Zymomonas)、耶氏酵母属(Yarrowia)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、劳尔氏菌属(Ralstonia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia) 以及梭菌属(Clostridium)，其中特别适用的是大肠杆菌(Escherichiacoli)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，最为适用的是大肠杆菌(Escherichia coli)。

[0022] 按照本发明所述细胞的一种优选实施方案，该细胞与其野生型相比，具有至少一种下述酶的增强活性：

[0023] i)酶EI，其将羧酸或者羧酸酯催化转换成相应的ω-羟基羧酸或者ω-羟基羧酸酯；

[0024] ii)酶EII，其将ω-羟基羧酸或者ω-羟基羧酸酯催化转换成相应的ω-氧代羧酸或者ω-氧代羧酸酯；

[0025] iii)酶EIII，其将ω-氧代羧酸或者ω-氧代羧酸酯催化转换成相应的ω-氨基羧酸或者ω-氨基羧酸酯。

[0026] “酶的增强活性”这一概念，例如就上述酶EI及随后实施方案中所使用的酶EII等等而言，优选理解为细胞内的活性增强。

[0027] 下述用来提高细胞内酶活性的实施方案既适用于提高酶EI的活性，也适用于任选地能提高其活性的所有随后提及的酶。

[0028] 原则上可以提高酶活性的方式为：提高用来编码酶的一个或多个基因序列的拷贝数、使用强启动子，或者使用针对相应的酶以增强活性进行编码的基因或者等位基因和视需要这些措施的组合。例如可通过转化、转导、接合作用，或者将这些方法与一种载体结合起来产生本发明所述的转基因细胞，所述载体含有所需的基因、该基因的等位基因或者其部分和含有能够表达该基因的载体。尤其可将基因或者等位基因整合入细胞染色体，或者整合在染色体外复制的载体之中，从而实现异源表达。

[0029] 专利DE-A-100 31 999以丙酮酸羧化酶为例，概述了增强细胞内酶活性的可能方法，本发明将该文献以参考的形式引入，因此该专利关于细胞内酶活性增强的可能方法的公开内容构成本发明公开的一部分。

[0030] 可借助一维及二维蛋白质凝胶分离法，然后使用相应的分析软件来光学鉴定凝胶内的蛋白质浓度，检测上述以及下述所有酶或基因的表达。如果仅仅以增强基因表达为基础来增强酶活性，就能以简单的方式，通过比较野生型和转基因细胞之间的一维或二维蛋白质分离结果，定量测定酶活性的增强水平。制备棒状杆菌的蛋白质凝胶以及鉴定蛋白质的常见方法是Hermann等人 (Electrophoresis，22：1712.23(2001))所描述的方法。同样也可以使用待检蛋白质的特异性抗体进行Western-Blot-Hybridisierung(Western印迹杂交)(Sambrook等人，Molecular Cloning：a laboratory manual，(分子克隆：实验室手册)第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，美国纽约Cold Spring Harbor，1989)，然后使用相应的浓度测定软件进行光学分析(Lohaus和Meyer(1989)Biospektrum杂志第5期第32-39页；Lottspeich(1999)，Angewandte Chemie(应用化学)第111期第2630-2647页)，从而分析出蛋白质浓度。可以利用DNA条带转移分析(DNA-Band-Shift-Assays)(也称作凝胶阻滞分析)来测定DNA结合蛋白的活性(Wilson等人(2001)Journal of Bacteriology(细菌学杂志)第183期第2151-2155页)。通过报道基因分析法所述的各种方法，可以很好地检测DNA结合蛋白对其它基因表达的影响(Sambrook等人，Molecular Cloning：a laboratory manual，第2版.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.USA，1989)。可以根据各种所述的方法测定细胞内酶活性(Donahue等人(2000)Journal of Bacteriology(细菌学杂志)第182卷第19期第5624-5627页；Ray等人(2000)Journal ofBacteriology(细菌学杂志)第182卷第8期第2277-2284页；Freedberg等人(1973)Journal of Bacteriology(细菌学杂志)第115卷第3期第816-823页)。如果在下述实施方案中没有指明某种酶活性的具体测定方法，则优选利用Hermann等人在2001年Electophoresis(电泳技术杂志)第22期第1712-23页、Lohaus等人在1998年Biospektrum杂志第5期第32-39页、Lottspeich在
1999年Angewandte Chemie(应用化学杂志)第111期第2630-2647页以及Wilson等人在
2001年Journal of Bacteriology(细菌学杂志)第183期第2151-2155页上所描述的方法，来测定酶活性的增强水平，也可测定酶活性的减弱程度。

[0031] 如果通过内源基因突变来增强酶活性，则要么根据经典方法以无定向方式产生此类突变(例如通过紫外辐射或者能引起突变的化学药剂)，或者利用诸如删除、插入、和/或核苷酸交换之类的基因工程方法来有目的地实现。通过这些突变方法可获得转基因细胞。特别优选的酶突变体尤其也可以是那些不可以反馈抑制的，或者与野生型酶相比反馈抑制能力有所减少的酶。

[0032] 如果以增强酶表达水平的方式来增强酶活性，则可以例如增大相应基因的拷贝数，或者使得结构基因上游的启动子和调节区(Regulationsregion)发生突变。植入在结构基因上游的表达盒以相同方式发挥作用。通过可诱导的启动子还可以在任何时刻提高表达水平。此外，也可以将所谓“增强子”分配给酶基因作为调节序列，这些增强子可改善RNA聚合酶与DNA之间的相互作用，因此同样也可增强基因表达。采用延长m-RNA寿命的措施同样也可改善表达水平。此外，阻止酶蛋白分解同样也可增强酶活性。基因或基因构建体要么存在于具有不同拷贝数的质粒之中，或者整合在染色体内并在其中扩增。备选地，还可以通过改变培养基组成以及培养进程的方式，达到相关基因的过度表达。专业人士可在下述文献中查阅相关说明：Martin等人(1987年Bio/Technology(生物/技术杂志)第5期第137-146页)、Guerrero等人(1994年Gene(基因杂志)第138期第35-41页)、Tsuchiya和Morinaga(1988年Bio/Technolog(生物/技术杂志)第6期第428-430页)、Eikmanns等人(1991年Gene(基因杂志)第102期第93-98页)、EP-A-0 472 869、US 4,601,893、Schwarzer和Pühler(1991年Bio/Technolog(生物/技术杂志)第9期第84-87页)、Reinscheid等人(1994年Applied and Environmental Microbiology(应用与环境微生物学杂志)第60期第126-132页)、LaBarre等人(1993年Journal of Bacteriology(细菌学杂志)第175期第1001-1007页)、WO-A-96/15246、Malumbres等人(1993Gene(基因杂志)第134期第15-24页)、JP-A-10-229891、Jensen和Hammer(1998年Biotechnology andBioengineering(生物技术与生物工程)第58期第191-195页)以及已知的遗传学与分子生物学教科书。上述措施也可以与突变一样产生转基因细胞。

[0033] 例如可以使用附加体质粒来增强各个基因的表达水平。适合作为质粒的尤其是在棒状杆菌中复制的那些质粒。大量已知的质粒载体例如pZ1(Menkel等人，1989年Applied and Environmental Microbiology(应用与环境微生物学)第64期第549-554页)、pEKEx1(Eiknanns等人，1991年Gene(基因杂志)第107期第69-74页)或者pHS2-1(Sonnen等人，1991年Gene(基因杂志)第107期第69-74页)均基于隐蔽性质粒pHM1519、pBL1或者pGA1。同样也可使用其它质粒载体，例如基于pCG4(US 4,489,160)或者pNG2(Serwold-Davis等人，1990年FEMS Microbiology Letters(FEMS微生 物学快报)第66期第119-124页)或者pAG1(US 5,158,891)的那些质粒。

[0034] 此外合适的还有，借助其可通过整合在染色体之中来用于基因扩增方法的质粒载体，例如Reinscheid等人(1994年Applied and EnvironmentalMicrobiology(应用与环境微生物学杂志)第60期第126-132页)所描述的用来复制或扩增hom-thrB-操纵子的方法。这种方法可将完整的基因克隆在一种质粒载体之中，该质粒载体可以在宿主(典型的有大肠杆菌)之中复制，但是不可以在谷氨酸棒状杆菌之中复制。可以作为载体使用的例如有pSUP301(Simon等人，1983年Bio/Technology(生物/技术杂志)第1期第784-791页)、pK18mob或者pK19mob( 等人，1994年Gene(基因杂志)第145期第69-73页 )、pGEM-T(Promiga Corporation，Madison，Wisconsin，USA)、pCR2.1-TOPO(Shuman，1994年Journal of Biological Chemistry(生物化学杂志)第269期第32678-84页)、 Blunt(Invitrogen，Groningen，Niederlande)、pEM1(Schrumpf等人，Journal of Bacteriology(细菌学杂志)第173期第4510-4516页)或者pBGS8(Spratt等人，
1986年Gene(基因杂志)第41期第337-342页)。随后通过接合或者转化作用，将含有待扩增基因的质粒载体转移到谷氨酸棒状杆菌的所需菌株之中。例如 等人在1994年Applied and Environmental Microbiology(应用与环境微生物学杂志)第
60期第756-759页中就描述了这种接合方法。例如Thierbach等人在1988年Applied Microbiology and Biotechnology(应用微生物学与生物技术杂志)第29期第356-362页、Dunican和Shivnan在1989年Bio/Technology(生物/技术杂志)第7期第1067-1070页以及Tauch等人在1994年FEMS Microbiology Letters(FEMS微生物学快报)第123期第
343-347页中描述了相关的转化方法。利用某种“交换(cross-over)”事件进行同源重组之后，所形成的菌株将包含相关基因的至少两个拷贝。

[0035] 上述及下述实施方案中使用的“酶Ex相对于其野生型的增强活性”这一说法，优选理解成各酶Ex的活性增强到至少2倍、尤其至少10倍、此外优选至少100倍、此外更优选至少1000倍且最好优选至少10000倍。此外，本发明所述的具有“相对于其野生型增强了酶Ex活性”的细胞也包括其野生型没有或者至少检测不出酶Ex活性、且只有在例如通过过度表达增强酶活性之后才能检测出这种酶Ex活性的细胞。就此而言，“过度表达”或者下述实施方案 中使用的“增强过量表达”也包括这种情况，即原始细胞(例如野生型细胞)没有或者至少没有可检测表达，且只有通过重组方法才诱导酶Ex的可检测表达。 [0036] 此外，根据本发明优选的是，所述细胞具有酶EI和EII、酶EI和EIII、酶EII和EIII的增强活性，或者具有所有酶EI、EII和EIII的增强活性。

[0037] 此外，就本发明所述细胞的上述优选实施方案而言，

[0038] -酶EI是烷烃单加氧酶或二甲苯单加氧酶，或者，优选和

[0039] -酶EII是，或者优选是，烷烃单加氧酶、醇脱氢酶或醇氧化酶，或者，优选和 [0040] -酶EIII是ω-转氨酶。

[0041] 优选的酶EI是，尤其是优选的烷烃单加氧酶是，源于恶臭假单胞菌-GPOl的经过alkBGT基因编码的烷烃单加氧酶。例如van Beilen等人在2002年Journal of Bacteriology，第184卷第6期第1733-1742页发表的“Functional Analysis of Alkane Hydroxylases from Gram-Negativeand Gram-Positive Bacteria”一文中就描述了alkBGT基因序列的分离方法。此外可以作为烷烃单加氧酶使用的还有细胞色素-P450-单加氧酶，尤其是源于假丝酵母属例如热带假丝酵母(Candida tropicalis)或者源于植物例如鹰嘴豆(Cicer arietinum L.)的细胞色素-P450-单加氧酶。例如专利WO-A-00/20566就公开了源于热带假丝酵母的合适细胞色素-P450-单加氧酶的基因序列，关于源于鹰嘴豆的合适细胞色素-P450-单加氧酶的基因序列例如可查阅Barz等人在2000年Plant Science(植物科学杂志)第155卷第101-108页上发表的文章“Cloning and characterization of eight cytochromeP450 cDNAs from chickpea(Cicer arietinum L.)cell suspensioncultures(鹰嘴豆(Cicer arietinum L.)细胞悬浮培养物的八个细胞色素P450cDNA的克隆与分析)”。关于alkB基因的其它同系物也可以查阅van Beilen等人在2003年“Oil&Gas Science and Technology(石油与天然气科学技术)”第58卷第4期第427-440页上发表的文章。适用于二甲苯单加氧酶的基因例如是xylM或xylA基因，其中包含这两种基因的质粒具有基因库登录号M37480。

[0042] 优选的酶EII尤其是醇脱氢酶例如是经过alkJ基因编码的醇脱氢酶(EC1.1.99-2)，尤其是源于恶臭假单胞菌GPo1经过alkJ基因编码的醇脱氢酶。关于源于恶臭假单胞菌GPo1、泊库岛食烷菌(Alcanivorax borkumensis，)、副百日咳博德特氏杆菌(Alcanivorax borkumensis，)、支气管败血性博德特氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)或者源于脱氮玫瑰杆菌(Roseobacter denitrificans)经过alkJ基因编码的醇脱氢酶，例如可查阅KEGG基因数据库。

[0043] 适用的ω-转氨酶例如有专利US-A-2007/0092957中以序列号248、250、252和254表示的那些ω-转氨酶。

[0044] 优选的酶EIII是，尤其是优选的ω-转氨酶是，源于紫色色杆菌(Chromobac terium violaceum)DSM30191的ω-转氨酶(Kaulmann等人，2007；Substrate spectrum ofω-transaminase from Chromobacteriumviolaceum DSM30191 and its potential for biocatalysis(紫色色杆菌DSM30191ω-转氨酶的底物范围及其生物分析学潜力)，Enzyme andMicrobial Technology(酶和微生物技术杂志)第41卷第628-637页)，其基因序列编码为SEQ.-ID.-No.01。

[0045] 有利的是使用可从植物中分离出的ω-转氨酶作为酶EIII。这里优选选用源自下述植物的ω-转氨酶；拟南芥(Arabidopsis thaliana)、燕麦(Avenasativa)、甜菜(beta vulgaris)、大豆(Glycine max)、大麦(Hordeumvulgare)、百脉根(Lotus japonicus)、番茄(Solanum lycopersicum)、木薯(Manihot esculenta)、水稻(Oryza sativa)、小麦(Traeticumaestivum)、玉米(Zea mays)、菠菜(Spinacia oleracea)、斑叶疆南星(Arum maculatum)、多年生山靛(Mercurialis perennis)以及荨麻(Urtica dioica)，其中特别优选的是拟南芥。适合作为ω-转氨酶的尤其是经过核酸编码的酶，所述核酸具有与SEQ.-ID.-No.39序列90％、优选为95％、尤其优选为99％、最特别优选为100％的同一性( )。这里可利用已知的方法测定相对于SEQ.-ID-No.39的核苷酸同一性。通常可在考虑特殊要求的情况下使用具有相关算法的特别计算机程序。优选的同一性测定方法首先在待比较序列之间产生最大的一致性。用于确定同一性的计算机程序包括(但并不仅限于此)GCG程序包，包含

[0046] -GAP(Deveroy，J.等人，1984年Nucleic Acid Research(核酸研 究杂志)第12期第387页，Genetics Computer Group University ofWisconsin，Medicine(Wi)(威斯康辛大学遗传学计算机集团，医疗工程(Wi))，以及

[0047] -BLASTP、BLASTN和 FASTA(Altschul，S. 等 人，1990 年 Journal ofMolecular Biology(分子生物学杂志)第215期第403-410页)。BLAST程序可由National Center For Biotechnology Information(国家生物技术信息中心)(NCBI)及其它来源获得(BLAST Handbuch，Altschul S.等人，NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894；Altschul S.等人)。 [0048] 同样也可使用已知的Smith-Waterman算法来确定核苷酸同一性。 [0049] 优选的核苷酸比较参数包括下列：

[0050] -Needleman和Wunsch算法，Journal of Molecular Biology(分子生物学杂志)48(1970)，第443-453页

[0051] -比较矩阵

[0052] 匹配＝+10

[0053] 错配＝0

[0054] 空位罚分＝50

[0055] 空位长度罚分＝3

[0056] GAP程序同样也适合与上述参数一起使用。上述参数是核苷酸序列比较过程中的默认参数。

[0057] 此外还适用源于β-Ala子群(Untergruppe)的酶：丙酮酸转氨酶。其中包括例如源于恶臭假单胞菌W619(gi：119860707，gi：119855857，gi：119856278)、恶臭假单胞菌KT2440(gi：24984391)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PA01(gi 15595330，gi：15600506，gi 15595418，gi 9951072)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)(gi：3319731)、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)MA 4680(gi：29831094，gi：
29829154)以及源于紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)ATCC12472(gi 34102747)的转氨酶。上述转氨酶的氨基酸序列在SEQ.-ID.-No.19～SEQ.-ID.-No.30序列之中给出。

[0058] 对于打算使用本发明所述细胞由羧酸酯出发来制备ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者基于ω-氨基羧酸的内酰胺的情况而言，如果除了增强酶EI、EII和EIII 中的至少一种酶的活性之外，尤其是除了酶EI和EIII或者EI、EII和EIII的增强活性之外，本发明所述的细胞还具有酶EIV的增强活性，其中该酶EIV将ω-氨基羧酸酯催化转换成相应的ω-氨基羧酸酯，则更为有益；所述的酶EIV优选是细胞所分泌的酯酶。通过细胞分泌酯酶的优点在于：在细胞之外才断裂酯键。以这种方式，由于ω-氨基羧酸酯具有比ω-氨基羧酸更好的膜渗透性，能保证有充分的目标产物离开细胞并转移到细胞周围的培养基之中。 [0059] 本发明所述的优选酯酶尤其是脂肪酶，作为合适脂肪酶的实例提及源自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluoreszenz)HU380的脂肪酶LipA(ACC CodeQ76D26，Kojima和Shimizu在2003年Journal of Bioscience andBioengineering(生物学与生物工程杂志)第96卷第3期第219-226页上发表的文章“Purification and Characterization of the Lipase fromPseudomonas fluorescens HU380(荧光假单胞菌HU380脂肪酶的净化与性质)”)。为了保证分泌酯酶，可以按照专业人士已知的方式，赋予其保证进行分泌的相应信号序列。当例如上述来自荧光假单胞菌HU380的脂肪酶LipA在大肠杆菌中过度表达时，就可以使其具有铜绿假单胞菌细胞表面上自然出现的酯酶EstA的信号序列(Becker等人在2005年FEBS Letters(FEBS快讯)第579卷第1177-1182页上发表的文章“A generic system for theEscherichia coli cell-surface display of lipolytic enzymes(大肠杆菌细胞表面显示脂肪分解酶的通用系统)”)。其它适用的酶是南极假丝酵母(C.antarctica)、米黑毛霉(M.miehei)以及洋葱假单胞菌(P.cepacia)的脂肪酶(Vaysse等人，2002年Enzyme and Microbial Technology(酶与微生物技术杂志)第31卷第648-655页)。也可以按照传统方式分裂所分泌的ω-氨基羧酸酯，以便获得ω-氨基羧酸，例如可通过氢氧化物(例如氢氧化钠)水溶液将ω-氨基羧酸酯皂化即水解的方式。 [0060] 按照本发明所述，如果除了酶EI、EII和EIII中至少一种酶的增强活性之外，优选除了酶EI和EIII或者EI、EII和EIII的增强活性以及视需要除了上述酶EIV的增强活性之外，本发明所述的细胞也具有酶EV的增强活性，其中酶EV将ω-氨基羧酸催化转换成相应的内酰胺，则较为有益；如果从细胞分泌这种酶EV，也较为有益。以这种方式可以将直接由细胞形成的ω-氨基羧酸或者在细胞外分裂ω-氨基羧酸酯才产生的ω-氨基羧酸转移到相应的内酰胺之中，从而便于在视 需要提纯目标产物。

[0061] 按照本发明所述细胞的另一种特殊实施方案，该细胞除了具有一种或多种酶EI、EII或EIII的增强活性以及任选地酶EIV和/或EV的增强活性之外，也具有酶EVI的增强活性，其中酶EVI将α-酮羧酸催化转换成氨基酸，这种酶EVI优选是氨基酸脱氢酶。这种细胞修饰方式的优点在于：如果使用氨基酸作为NH2基团的供体，即在通过转氨酶(EIII)介导ω-氧代羧酸或者ω-氧代羧酸酯反应形成相应的ω-氨基羧酸、相应的ω-氨基羧酸酯或者相应的ω-氨基羧酸酯的过程中所需的基团，则可以再生这些氨基酸。作为氨基酸脱氢酶的优选是枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的丙氨酸脱氢酶(EC No.1.4.1.1；基因ID：936557)，用基因序列SEQ.-ID.-No.02对其进行编码。其它适用的氨基酸脱氢酶有丝氨酸脱氢酶、天冬氨酸脱氢酶、苯丙氨酸脱氢酶以及谷氨酸脱氢酶。

[0062] 有助于解决开头所述任务的还有转基因细胞制备方法，包括增强细胞内至少一种下列酶的活性的方法步骤；

[0063] i)酶EI，其将羧酸或者羧酸酯催化转换成相应的ω-羟基羧酸或者ω-羟基羧酸酯；

[0064] ii)酶EII其将ω-羟基羧酸或者ω-羟基羧酸酯催化转换成相应的ω-氧代羧酸或者ω-氧代羧酸酯，或者

[0065] iii)酶EIII，其将ω-氧代羧酸或者ω-氧代羧酸酯催化转换成相应的ω-氨基羧酸或者ω-氨基羧酸酯，

[0066] 其中优选通过前述方法来增强酶活性。

[0067] 按照上述方法的一种特殊实施方案，在该方法的过程中除了增强酶EI、EII和/或EIII的活性之外，也增强酶EIV的活性，该酶EIV将ω-氨基羧酸酯催化转换成相应的ω-氨基羧酸；和/或增强酶EV的活性，该酶EV将ω-氨基羧酸催化转换成相应的内酰胺，方法是增强这些酶的表达水平；其中优选从细胞分泌所述的酶EIV和/或者EV。

[0068] 有助于解决开头所述任务的还有可通过上述方法获得的转基因细胞。 [0069] 有助于解决开头所述细胞的还有用于制备ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺的方法，包括下列方法步骤：

[0070] I)在能够使得细胞从羧酸或者从羧酸酯形成ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺的条件下，使本发明所述的细胞与含有羧酸 或者羧酸酯的培养基接触，或者与邻接含有羧酸或羧酸酯的有机相的培养基接触； [0071] II)视需要分离出所形成的ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺。

[0072] 在本发明所述方法的方法步骤I)中，首先让细胞与含有羧酸或者羧酸酯的培养基接触，或者与邻接含有羧酸或羧酸酯的有机相的培养基接触，且在能够使得细胞从羧酸或羧酸酯形成ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺的条件下进行接触。

[0073] 可以采用批次法(batch-Verfahren)(批次培养(Satzkultivierung))、进料批次法(fed-batch-Verfahren)(回流法(Zulaufverfahren))或者重复进料批次法(repeated-fed-batch-Verfahren)(重复回流法(repetitives Zulaufverfahren))，以连续或不连续方式，使得本发明所述的转基因细胞与培养基进行接触、培养，以便产生ω-氨基羧酸或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺。也可以考虑使用GB-A-1009370所述的半连续法。在Chmiel的教科 书(“Bioprozesstechnik 1.Einführung in dieBioverfahrenstechnik(生物过程工程初探)”(斯图加特Gustav Fischer出版社1991年出版))或者Storhas的教科书(“Bioreaktoren undperiphere Einrichtungen(生物反应器与外围设备)”，布伦斯维克/威斯巴登Vieweg出版社1994年出版)中有关于已知培养方法的综述。

[0074] 所使用的培养基必须以恰当方式满足相应菌株的要求。有关各种微生物培养基的描述可参阅美国细菌学协会(der American Society forBacteriology)的“Manual of Methods for General Bacteriolog(通用细菌学方法手册)”(Washington D.C.，USA，1981)。

[0075] 除了羧酸或羧酸酯之外，可以作为碳源使用的碳水化合物例如还有葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素、油和脂肪(例如豆油，葵花籽油，花生油及椰子油)、脂肪酸(例如棕榈酸，硬脂酸及亚油酸)、醇类(例如丙三醇和甲醇)、烃类(例如甲烷)、氨基酸类(例如L-谷氨酸或者L-缬氨酸)或者有机酸(例如醋酸)。可以单独使用这些物质，或者作为混合物使用。特别优选使用碳水化合物，尤其是单糖、寡糖或者多糖，例如US 6,01,494和US 6,136,576所述的那些，C5-糖或者丙三醇。

[0076] 可以作为氮源使用的含氮有机化合物例如有蛋白胨、酵母提取物、肉浸膏、麦芽浸膏、玉米浆、大豆粉、尿素或者无机化合物，例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵以及硝酸铵。可以单独使用氮源，或者作为混合物使用。

[0077] 可以作为磷源使用的有磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或者相应的含钠盐类。培养基还必须含有生长所需的其它金属盐类，例如硫酸镁或者硫酸铁。除了上述物质之外，最后还可以使用必需生长物质如氨基酸和维生素。此外，还可以将适当的前体加入培养基之中。可以将所述物质以一次性批料形式加入培养基之中，或者在培养过程中以适当的方式加入。

[0078] 以适当的方式使用碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水，或者使用酸性化合物如磷酸或硫酸来控制培养基的pH值。可以使用消泡剂(例如脂肪酸聚乙二醇酯)来控制泡沫形成。可以在培养基中添加适当的选择性作用物质(例如抗生素)，以维持质粒的稳定性。可将氧气或者含氧混合气(例如空气)通入培养基之中，以便维持好氧条件。培养基温度通常为20℃～45℃，优选为25℃～40℃。

[0079] 按照本发明所述的ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺制备方法的一种特别优选的实施方案，使用源于大肠杆菌细胞的重组细胞作为本发明所述的细胞，根据Riesenberg等人在1990年ApplMicrobiol and Biotechnololgy(应用微生物与生物技术杂志)第34卷第1期第77-82页上发表的文章“High cell density fermentation ofrecombinan t Escherichia coli expressing human interferon alpha1(表达人干扰素alpha I的大肠杆菌的高细胞密度发酵)”所述，使用含有氨比西林、氯霉素及卡那霉素的无机盐培养基作为培养基。

[0080] 优选在能够使得细胞从羧酸或羧酸酯形成ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺的条件下，在方法步骤I)中使得本发明所述的细胞与培养基接触。可作为羧酸或羧酸酯使用的是碳原子数为6～20、优选为6～15、尤其优选为6～12的羧酸，且月桂酸特别优选作为羧酸。可作为羧酸酯使用的是上述羧酸的甲酯或乙酯，且月桂酸甲酯特别优选作为羧酸酯。

[0081] 可以考虑在方法步骤I)中采用不同的方法来制备ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺。

[0082] 按照本发明所述方法的一种实施方案，首先在培养基中培养用于产生生物 质的细胞，所述培养基不含羧酸或羧酸酯，尤其不含上述的优选羧酸或羧酸酯。只有在获得一定的生物质之后，才将羧酸或羧酸酯加入到培养基之中，或者使得细胞与含有羧酸或羧酸酯的新培养基接触。就此而言，在形成ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺的过程中，羧酸或羧酸酯的含量优选为1～200g/l，特别优选为20～200g/l。

[0083] 按照本发明所述方法的另一种实施方案，在两相系统内执行该方法，所述两相系统包括

[0084] A)水相，以及

[0085] B)有机相，

[0086] 在方法步骤I)中在水相中通过细胞形成ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺，然后在有机相中使得所形成的ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺富集。以这种方式可以在原位提取所形成的ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺。

[0087] 即使对于本发明所述方法的这种实施方案而言，可能有益的是首先在培养基中培养用来产生生物质的细胞，所述培养基不含羧酸或羧酸酯，尤其不含上述的优选羧酸或羧酸酯。只有在获得一定的生物质之后，才将细胞悬浮液作为水相A)与有机相B)接触，其中特别地，有机相B)的羧酸或羧酸酯含量优选为1～200g/l，特别优选为20～200g/l。如果作为羧酸或羧酸酯使用的底物对于所使用的细胞而言没有毒性，例如月桂酸甲酯，那么有机相的这些羧酸或羧酸酯含量可以明显高一些。在这种情况下，可以使用纯羧酸或纯羧酸酯(例如月桂酸甲酯)作为有机相。

[0088] 可以作为有机相使用的是中等链长的链烷烃，优选是logP值大于4(起沫少)的链烷烃，或者使用物理上类似的芳族化合物或芳族化合物酯，或者优选如以上实施方案所述，使用月桂酸酯，尤其是月桂酸甲酯、BEHP(双(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯)或者长链脂肪酸酯(生物柴油)。

[0089] 此外，本发明优选的是，至少在形成ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺的过程中，使得方法步骤I)中所用的培养基含有氨基团供体(例如氨或氨离子)或者氨基酸，尤其是丙氨酸或天冬氨酸，这些物质在通过转氨酶将ω-氧代羧酸或者ω-氧代羧酸酯催化转换成相应ω-氨基羧 酸或者ω-氨基羧酸酯的过程中起到氨基供体的作用。

[0090] 在本发明所述方法的方法步骤II)中，视需要可分离出所形成的ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺，且优选采用至少两个步骤的提纯法进行分离，包括

[0091] a)提取步骤：从培养基中提取ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺，以及

[0092] b)提纯步骤：采用蒸馏法或者选择性结晶法，对方法步骤a)中获得的提取物进一步提纯，获得纯度至少为99.8％的ω-氨基羧酸相、ω-氨基羧酸酯相或者内酰胺相。 [0093] 方法步骤a)中的提取操作尤其可以配置为所谓“原位”提取，其中同时执行本发明所述的ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺制备方法的方法步骤I)和II)。以上已经对这种“原位”提取操作进行过描述。

[0094] 例如可以采用蒸馏或结晶法，在方法步骤II)中进行精细提纯。

[0095] 按照本发明所述的ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺制备方法的一种特殊实施方案，在额外的方法步骤中使用常规化学方法将方法步骤I)中形成的ω-氨基羧酸酯转变成ω-氨基羧酸；优先选用的常规化学方法是皂化反应，其中利用碱的水溶液尤其是氢氧化物的水溶液，优选使用氢氧化钠水溶液将ω-氨基羧酸酯转换成ω-氨基羧酸。

[0096] 这种方法优选用于由月桂酸酯优选月桂酸甲酯来制备ω-氨基月桂酸； [0097] 有助于解决开头所述任务的还有可通过上述方法获得的ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺；且所述的内酰胺优选是按照本发明所述方法的方法步骤I)使用月桂酸或月桂酸酯作为羧酸或羧酸酯来制备从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺时所获得的月桂内酰胺，所述的ω-氨基羧酸优选是ω-氨基月桂酸，且ω-氨基羧酸酯优选是ω-氨基月桂酸甲酯。

[0098] 有助于解决开头所述任务的还有制备基于ω-氨基羧酸的聚酰胺的方法，包括下列方法步骤；

[0099] (α1)通过采用上述某一种制备ω-氨基羧酸的方法，尤其是上述由月桂酸或月桂酸酯制备ω-氨基羧酸的方法，制备ω-氨基羧酸；

[0100] (α2)聚合ω-氨基羧酸，获得聚酰胺。

[0101] 按照本发明所述用于制备基于ω-氨基羧酸的聚酰胺的的方法的方法步骤(α2)，将方法步骤(α1)中获得的ω-氨基羧酸、尤其是将方法步骤(α1)中获得的ω-氨基月桂酸在聚合反应中转化为聚酰胺，视需要也可使用各种ω-氨基羧酸组成的混合物，其中至少一种ω-氨基羧酸、视需要所有ω-氨基羧酸均可采用本发明所述的ω-氨基羧酸制备方法进行制备。

[0102] 可以采用已知的方法用ω-氨基羧酸来制备聚酰胺，例如L.Notarbartolo、Ind.Plast Mod.10(1958)2第44页、JP 01-074224、JP 01-051433、JP63286428、JP58080324或者JP60179425所述的方法。

[0103] 有助于解决开头所述任务的还有制备基于内酰胺的聚酰胺的方法，包括下列方法步骤；

[0104] (β1)制备内酰胺，其采用上述制备从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺的方法，尤其是采用上述用月桂酸或月桂酸酯制备月桂内酰胺的方法进行；

[0105] (β2)开环聚合或者缩聚月桂内酰胺获得聚酰胺。

[0106] 按照本发明所述用于制备基于内酰胺的聚酰胺的方法步骤(β2)，以开环聚合或者通过缩聚反应将方法步骤(β1)中获得的内酰胺，尤其是将方法步骤(β1)中获得的月桂内酰胺转变成聚酰胺，视需要也可使用各种内酰胺组成的混合物，尤其是月桂内酰胺与ε-己内酰胺组成的混合物，其中的至少一种内酰胺、视需要所有内酰胺均可采用本发明所述的制备从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺的方法进行制备。

[0107] 可采用已知的方法用内酰胺制备聚酰胺，例如DE-A-14 95 198、DE-A-25 58480、EP-A-0 129 196或者1977年纽约Interscience杂志第424-467页、尤其是第444-446页上的文章“Polymerization Processes”所述的方法。

[0108] 可通过上述方法获得的聚酰胺也有助于解决开头所述的任务。其中特别优选的是，聚酰胺的重量百分比的至少10％、特别优选至少25％、更优选至少50％、最优选至少75％基于月桂酸、月桂酸酯或者月桂内酰胺，它们采用本发明所述制备月桂酸、月桂酸酯或来自月桂酸或月桂酸酯的月桂内酰胺的方法来获得。

附图说明

[0109] 以下将根据非限制性附图和实施例，对本发明进行说明。

[0110] 附图1示意性示出用来将alk基因染色体整合入大肠杆菌之中的重组质粒(tnp：转座酶基因；bla：氨比西林抗性基因，oriT RP4：移动区；I和O标记微转座子Tn5的“反向重复”)。

[0111] 附图2示意性示出在控制阿拉伯糖可诱导启动子情况下表达转氨酶和丙氨酸脱氢酶的重组质粒(bla：氨比西林抗性基因；CV2025：青紫色色杆菌ω-转氨酶的基因；ald：枯草杆菌丙氨酸脱氢酶的基因；araC：转录调节因子)。

[0112] 附图3示意性示出用来表达大肠杆菌的LipA的重组质粒以及细胞表面上的酶(colE1，ColE1：复制起点；estA*，estA：用丙氨酸相对于丝氨酸进行氨基酸替换的基因(Codon #38)，cat：氯霉素抗性基因；phoA：针对碱性磷酸酶前导序列进行编码的基因片段)。

[0113] 附图4示出由酶分析确定紫色色杆菌转氨酶的活性，其中通过来自紫色色杆菌的ω-转氨酶转化12-氧代月桂酸甲酯。通过光度计测定以两次测定法(活性1，活性2)测定活性。使用不含协同底物L-丙氨酸的批次(o.Cos)、含有热灭活酶的批次(非活性)、以及大肠杆菌表达培养基与空载体组成的批次(空载体)，类似于ω-TA进行提纯，作为阴性对照。

[0114] 附图5示出在基准测量开始之时(上)(参比物质12-氨基月桂酸甲酯，10.2分钟时达到峰值)以及使用提纯后的转氨酶进行培养2小时之后(下)(经过2小时后的转化率，10.2分钟时达到峰值)，底物12-氨基月桂酸甲酯的色谱图。

[0115] 附图6示出经过24小时酶分析之后(上)(经过24小时后的转化率，10.2分钟时达到峰值)以及底物增加之后(对照组，下)(经过24小时后的转化率，参比物质增加，10.2分钟时达到峰值)，底物12-氨基月桂酸甲酯的色谱图。

[0116] 附图7示出将酶进行热灭活之后(上)(对比：热灭活蛋白质，经过24小时后的转化率。没有产物可检出)以及经过0小时之后(下)(对比：经过0小时后的转化率。没有产物可检出)，底物12-氨基月桂酸甲酯的色谱图。

[0117] 附图8示出用于作为alkBGTS扩增模板的起始质粒pGEc47。

[0118] 附图9示出所使用的引物以及由此而得到的PCR产物alkBFG和alkT。 [0119] 附图10示出用于合成羟基月桂酸甲酯和氧代月桂酸甲酯的重组载体pBT10。 [0120] 附图11示出标准物12-氧代月桂酸甲酯的GC-色谱图。

[0121] 附图12示出标准物12-羟基月桂酸甲酯的GC-色谱图。

[0122] 附图13示出月桂酸甲酯生物反应器内静息细胞生物转化作用产生的有机相的色谱图，时刻0分钟。

[0123] 附图14示出月桂酸甲酯生物反应器内静息细胞生物转化作用产生的有机相的色谱图，时刻150分钟。

[0124] 附图15示出含AT3G22200的pGJ3130的表达载体。

[0125] 附图16示出通过耦合酶分析检测酶活性(非活性，热灭活蛋白质；o.Cos.，没有添加丙氨酸；akt，提纯后的活性酶)。

[0126] 附图17示出通过HPLC检测异源表达的蛋白质AT3G22200。上：10.8分钟时经过20分钟培养后的产物；下：10.8分钟时的参比物质。

[0127] 附图18示出表达含转氨酶基因ppta5(pPPTA5)的载体pET-21a(+)的载体卡。 [0128] 附图19示出含转氨酶基因psta(pPSTA)的表达载体pET-21a(+)的载体卡。 [0129] 附图20示出5mM 12-氧代月桂酸甲酯与转氨酶PPTA5的胺化反应。为了进行分析，由所得的中性和酸性提取物的色谱图，将12-氧代月桂酸甲酯和12-氨基月桂酸甲酯的峰面积相加进行分析，然后计算进料物或产物的百分比含量。

[0130] 附图21示出5mM 12-氧代月桂酸甲酯与转氨酶PSTA的胺化反应。为了进行分析，由所得的中性和酸性提取物的色谱图，将12-氧代月桂酸甲酯和12-氨基月桂酸甲酯的峰面积相加，然后计算进料物或产物的百分比含量。

具体实施方式

[0131] 实施例

[0132] A.将月桂酸或月桂酸甲酯转换成月桂内酰胺

[0133] 给大肠杆菌补充所需的单加氧酶、醇脱氢酶、ω-转氨酶、丙氨酸脱氢酶以及脂肪酶，将月桂酸或者月桂酸甲酯转换成月桂内酰胺。在大肠杆菌中过度表达这些酶，各个酶的表达水平取决于各个反应的动力学，必须使其彼此最优匹配。通过添加适量诱导物调整表达水平。使用正辛烷诱导表达单加氧酶和醇脱氢酶，使用阿拉伯糖诱导转氨酶和丙氨酸脱氢酶，使用IPTG诱导脂肪酶。

[0134] A1.克隆各个酶

[0135] 羟基化与成醛反应

[0136] 使用来自恶臭假单胞菌GPo1的烷烃羟化酶系alkBGT进行月桂酸或月桂酸甲酯的羟基化反应。通过醇脱氢酶alkJ催化第二个成醛步骤。

[0137] 在大肠杆菌中通过插入到微转座子Tn5之中的方式，将这些反应所需的基因alkBGJT染色体整合入大肠杆菌的基因组之中(de Lorenzo等人，1990年JBacteriol杂志第172卷第11期第6568-6572页和第6557-6567页；1999年 Appl and Environm.Microbiol.(应用与环境微生物学杂志)第5619-5623页)。应在控制alkB启动子和正调节子alkS的情况下来表达基因。借助Panke等人1999年在上述杂志上描述的可移动质粒pUT-Km，将Tn5-alkBGFJST-构建体转移到大肠杆菌靶标生物体上。

[0138] 在alkBFGHJKL操纵子之外组织alkST基因座与表达相关的调节因子alKS，然后在恶臭假单胞菌的基因组中反向排列。在克隆到载有转座子的质粒之中时保持基因的排列。依次将片段alkST和alkBFGJ整合到该质粒之中。

[0139] 在恶臭假单胞菌中也就是在操纵子alkBFGHJKL中组织待克隆的基因alkB(SEQ.-ID.-No.03)、alkG(SEQ.-ID.-No.04)和alkJ(SEQ.-ID.-No.05)，但是将其与针对醛脱氢酶进行编码的基因alkH分开。该酶可能会重新分解所需的中间产物，也就是月桂酸的醛，因此必须将其隔离在alkBGJ基因的克隆过程之外。

[0140] 为了简化alkB和alkG的克隆操作，将基因alkF与alkB和alkG一起进行扩增、克隆。AlkF对于待催化的反应而言无关紧要。在两个分开的PCR批次中扩增基因alkBFG和alkJ，然后通过SOE-PCR将其相互融合(Horton等人，1989年Gene(基因杂志)第77卷第61-68页)。作为目标DNA的是恶臭假单胞菌GPo1的OCT质粒。

[0141] A2.克隆策略：

[0142] 使用alkT上游的NotI切位点对片段alkST＝4077bp(SEQ.-ID.-No.06(alkS)和SEQ.-ID.-No.07(alkT))进行PCR扩增：

[0143] 引物

[0144] alkT-正向-NotI(SEQ.-ID.-No.08)

[0145] 5’ACGTAGCGGCCGCCTAATCAGGTAATTTTATAC

[0146] alkS-反向(SEQ.-ID.-No.09)

[0147] 5’GAGCGAGCTATCTGGT

[0148] 将PCR片段克隆到载有转座子的载体pUT-Km之中。为此可在Tn5之内利用NotI切开载体，然后采用平末端(blund-end)连接反应将其与alkST片段连接在一起。重组质粒的名称为pUT-Km-alkST。

[0149] A3.利用SOE-PCR技术合成alkBFGJ构建体：

[0150] 合成片段1：alkBFG+alkB上游启动子及5’-末端的NotI切位点(产物 大小；1409bp)：

[0151] 引物

[0152] alkBFG-正向-NotI(SEQ.-ID.-No.10)

[0153] 5’TCGTAGCGGCCGCCCAGCAGACGACGGAGCAA

[0154] al kBFG-反向-SOE(SEQ.-ID.-No.11)

[0155] 5’ATTTTATCTTCTCGAGGCTTTTCCTCGTAGAGCACAT

[0156] 利用与5’-末端上的a lkG和3’-末端上的Not I-切位点互补的末端合成片段3、alkJ(产物大小：1723bp)；

[0157] 引物

[0158] alkJ-正向-SOE(SEQ.-ID.-No.12)

[0159] 5’TGCTCTAACGAGGAAAAGCCTCGAGAAGATAAAATGTA

[0160] alkJ-反向-NotI(SEQ.-ID.-No.13)

[0161] 5’ATTGACGCGGCCGCTTACATGCAGACAGCTATCA

[0162] 通过SOE-PCR将两个单一片段相互融合。(需要3个分开的PCR反应)。使用NotI切割、连接重组质粒pUT-Km-alkST和alkBFGJ构建体。在大肠杆菌HB101之中转化新的重组质粒pUT-Km-alkBGJST(见附图1)，然后通过接合质粒转移转移到大肠杆菌JM101上。 [0163] A4.胺化反应与氨基供体再生

[0164] 利用重组质粒pBAD-CV2025-ald转化载有Tn5：alkBGJST的大肠杆菌菌株JM101，用于进行胺化反应形成ω-氨基月桂酸酯，并且再生氨基供体。该质粒基于载体pBAD30(Guzman等人在1995年Bacteriol杂志第177卷第14期第4121-4130页上发表的文章“Tight Regulation，Modulation，and High-LevelExpression by Vectors Containing the Arabinose PBAD Promotor”)。pBAD-CV2025-ald载有来自紫色色杆菌DSM30191的转氨酶CV2025的基因(SEQ：-ID.No.01；Kaulmann等人在2007年Enzyme and MicrobialTechnology(酶与微生物技术杂志)第41卷第628-637页发表的文章)并且载有针对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.Subtilis)的丙氨酸脱氢酶进行编码的基因ald(SEQ.-ID.-No.02；NP_391071)。这些基因受到阿拉伯糖可诱导的启动子的控制。 [0165] A5.克隆策略

[0166] 利用紫色色杆菌DSM30191的染色体DNA对转氨酶基因进行PCR扩增(产物大小：1415bp)：

[0167] 引物

[0168] CV2025-正向-SacII(SEQ.-ID.-No.14)

[0169] 5’CGAGGAGCTCAGGAGGATCCAAGCATGCAGAAGCAACGTACG

[0170] CV2025-反向-KpnI(SEQ.-ID.-No.15)

[0171] 5’GTCATGTACCCCTAAGCCAGCCCGCGCGCCT

[0172] 正向引物除了含有XbaI切位点之外，还含有可用于克隆到载体pBAD30之中的核糖体结合位点。通过切位点SacI和KpnI连接到载体pBAD30之中。重组载体的名称为pBAD-CV2025。

[0173] 利用枯草芽孢杆菌的染色体DNA(NP_391071)对丙氨酸脱氢酶基因ald进行PCR扩增(产物大小：1171bp)。

[0174] 引物

[0175] AlaDH-正向-XbaI(SEQ.-ID.-No.16)

[0176] 5’ACCTATCTAGAAGGAGGACGCATATGATCATAGGGGTTCCT

[0177] AlaDH-反向-PstI(SEQ.-ID.-No.17)

[0178] 5’AACCTCTGCAGTTAAGCACCCGCCAC

[0179] 为了克隆到重组载体pBAD-CV2025之中，正向引物除了含有XbaI切位点之外，还含有核糖体结合位点。通过切位点XbaI和PstI克隆到载体之中。所得到的质粒的名称为pBAD-CV2025-ald(参见附图2)。

[0180] A6.针对密码子优化表达的来自紫色色杆菌DSM 30191的ω-转氨酶基因备选地克隆到大肠杆菌中

[0181] Geneart公司已针对大肠杆菌密码子的使用优化合成了ω-转氨酶的编码基因(SEQ.-ID.-No.42)并且已经将其克隆到载体pGA 15(Geneart)之中。已在基因合成过程中在侧面植入基因合成切位点SacI和KpnI，并且在使用SacI和KpnI进行消解之后，将其克隆到之前利用SacI和KpnI进行了线性化处理的载体pGA15之中。使用限制性核酸内切酶SacI和KpnI消解所得到的载体，提纯片段(转氨酶)，然后连接到表达载体paCYCDuet-1(Novagen)之中。采用限制性分析法检查正确的质粒。所得到的载体称作paCYCDuet-1::ω转氨酶。

[0182] A7.通过6xHis-Tag提纯异源表达蛋白质

[0183] 将载体(paCYCDuet-1::ω转氨酶)转化到大肠杆菌XL1blue之中后，在温度为28℃的条件下，在含有抗生素氨比西林(100μg/ml)的双份YT培养基(dYT)中培养所的转化菌株，直到密度OD600nm＝0.3-0.4。在控制Plac启动子的情况下使用IPTG(最终浓度
1mM)诱发表达。溶解细菌表达培养基；将50ml培养基以2360x g离心分离，然后将其重新悬浮于含有5mM EDTA、300mM NaCl和1mg/ml溶菌酶的5ml磷酸钠缓冲液(pH 8)之中，在室温下培养1小时。以2360x g将溶解产物离心分离10分钟，然后通过ProtinoNi-TED 2000填充柱(根据制造商说明；Macherey-Nagel，Düren)提纯上清液。利用Bradford测定蛋白质浓度。

[0184] A8.采用偶联分析检测酶活性

[0185] 以偶联分析测定活性，在第二步骤中使作为转氨酶反应副产物出现的丙酮酸继续反应，将NADH氧化成NAD+。在340nm光度计中测定NADH浓度的下降率(原理：测定消光系数下降程度)，将浓度下降率作为活性评估尺度。

[0186]

[0187] 加入5μl 12-ODME(50mg/ml)开始进行分析。在340nm及室温条件下每分钟测定一次，连续测定最多20分钟。使用灭活蛋白质及不含协同底物的批次进行对比。附图4可以看出使用光度计测定的消光率变化。

[0188] A9.通过HPLC检测异源表达的蛋白质

[0189]

[0190] 在室温条件下培养4小时之后，使用1Vol.MeOH终止反应

[0191] 使用邻苯二甲醛(oPA)衍化批次进行HPLC分析，然后从中取250μl进行分析。使用50mM NaAC pH 4∶乙腈4∶1(v∶v)作为流动相A。

[0192] 流动相B是含有5％50mM NaAC pH 4的乙腈。梯度在4分钟内从30％B变为60％B，在2分钟内从60％B变为100％B。流速为1.2ml/分钟。

[0193] 通过Agilent Zorbax RP18色谱柱(Agilent Technologies，USA)进行分离。 [0194] 色谱柱温度为40℃。

[0195] 附图5和6所示12-氧代月桂酸甲酯的标准以及下降程度。热灭活酶作为阴性对照(附图7)。

[0196] A6.酯分解

[0197] 使用来自荧光假单胞菌的脂肪酶LipA(Q76D26)(Kojima&Shimizu，2003年J.of Bioscience and Bioengin.(生物科学与生物工程杂志)第96卷第3期第219-226页)将ω-氨基月桂酸甲酯分解成ω-氨基月桂酸。使用含有荧光假单胞菌染色体DNA的引物LipA-SfiI-up和LipA-SfiI-down扩增基因，然后通过SfiI切位点将其克隆到载体pEST100之中。重组质粒的名称为pEST-lipA(参见附图3)。

[0198] 通过克隆将lipA(SEQ.-ID.-No.18)融合在来自铜绿假单胞菌的碱性磷酸酶phoA的信号序列和酯酶EstA的自动转运域上，从而可通过细胞质膜转移脂肪酶，并且在大肠杆菌的细胞表面上显示出来。相关操作方法可参阅Becker等人在2005年FEBS Letters(FEBS快讯)第579期第1177-1182页上发表的文章“A generic system for the Escherichia coli cell-surfacedisplay of lipolytic enzymes(大肠杆菌细胞表面显示脂肪分解酶的通用系统)”。在控制Plac启动子的情况下使用IPTG(最终浓度1mM)诱发表达(产物大小：1894bp)。

[0199] 引物

[0200] 引物lipA-Sfi-up(SEQ.-ID.-No.19)

[0201] 5’AACAAAAGGGCCGCAATGGCCATGGGTGTGTATGACTAC

[0202] 引物lipA-Sfi-down(SEQ.-ID.-No.20)

[0203] 5’TACAGGGGCCACCACGGCCTCAGGCGATCACAATTCC

[0204] B利用恶臭假单胞菌GPo1的AlkBGT烷烃羟化酶系从月桂酸甲酯出发合成12-羟基月桂酸甲酯和12-氧代月桂酸甲酯

[0205] B1.构建alkBGT表达载体

[0206] 从pCOM出发

[0207] 从pCOM系(Smits等人，2001 Plasmid 64：16-24)制备构建体pBT10(附图10，SEQ.-ID.-No.31)，该构建体含有氧化成醛所需的恶臭假单胞菌的烷烃羟化酶(AlkB)、红素氧还蛋白(AlkG)及红素氧还蛋白还原酶(AlkT)这三种成分。将alkBFG基因序列置于alkB启动子的控制之下和将alkT基因置于alkS启动子的控制之下，来表达这三种基因。 [0208] B2.克隆策略

[0209] 为了简化alkB和alkG的克隆操作，将基因alkF与alkB和alkG一起进行扩增、克隆。AlkF对于待催化的反应而言无关紧要。

[0210] 利用alkB的上游NdeI切位点以及alkG的下游SalI切位点，对片段alkBFG＝2524bp(参见SEQ.-ID.-No.03(alkB)和SEQ.-ID.-No.04(alkG))进行PCR扩增： [0211] 引物：alkBFG正向(SEQ.-ID.-No.32)

[0212] AAGGGAATTCCATATGCTTGAGAAACACAGAGTTC

[0213] 引物：alkBFG反向(SEQ.-ID.-No.33)

[0214] AAAATTCGCGTCGACAAGCGCTGAATGGGTATCGG

[0215] PCR扩增片段alkT(2958bp)(参见Seq.ID.-No.07(alkT))

[0216] 引物alkT正向(SEQ.-ID.-No.34)

[0217] TGAGACAGTGGCTGTTAGAG

[0218] 引物alkT反向(SEQ.-ID.-No.35)

[0219] TAATAACCGCTCGAGAACGCTTACCGCCAACACAG

[0220] 利用PCR扩增片段alkBFG和alkT。使用质粒pGEc47(附图12)作为模 板(Eggink等人在1987年J.Biol.Chem.第262期第17712-17718页上发表的文章)。

[0221] 利用亚克隆载体 HCKan(Lucigen Corporation)进行克隆。需要这一附加步骤，因为直接克隆不会成功。为此将市面上能买到的、已经过线性化处理且配有平头末端的载体 HCKan(Lucigen)与相应的平头末端PCR产物(附图9)连接起来。 [0222] 接着使用限制性酶NdeI和SalI切割alkBFG片段，然后使用亚克隆载体的限制性酶PacI和XhoI切割alkT片段。在琼脂糖凝胶(1％)中分离这些片段，从凝胶中将其切除，然后使用凝胶提取试剂盒将其分离出。依次将片段连接到载体pCOM10之中(Smits，T.H.M.，Seeger，M.A.，Witholt，B.&vanBeilen，J.B.(2001)Plasmid 46.16-24)。在第一个步骤中通过切位点NdeI和SalI将alkBFG置于pCOM10之中，然后在第二步骤中通过切位点PacI和XhoI进行克隆。

[0223] 首先在大肠杆菌DH5α中转化重组质粒。在含有卡那霉素的LB培养基上选择载有质粒的克隆。通过酶切分析和排序控制从中分离出的质粒。质粒名称为pBT10(附图10)。 [0224] B3.在生物反应器中将月桂酸甲酯生物转化成羟基月桂酸甲酯和12-氧代月桂酸甲酯

[0225] 为了生物转化，在42℃条件下热激2分钟，将质粒pBT10转化成为化学感受态大肠杆菌菌株W3110。在30℃条件下以180rpm转速在M9培养基中培养一夜大肠杆菌W3110-pBT10，收获合成羟基月桂酸甲酯和12-氧代月桂酸甲酯。在含有0.5％葡萄糖的M9培养基中吸收生物质，直至达到OD450＝0.2。生长4小时之后使用双环丙基酮诱发表达，然后继续培养4小时。重新离心分离出细胞，将细胞团块重新悬浮于KPi缓冲液(50mM，pH7.4)之中，然后放入生物反应器之中。将生物质浓度调整到约为1.8gCDW/L。一边猛烈搅拌(1500转/分钟)，一边按照1∶3比例将底物月桂酸甲酯加入到细胞悬浮液之中(100ml细胞悬浮液，50ml月桂酸甲酯)。保持30℃恒温。

[0226] 对反应批次进行色谱分析，检测产物羟基月桂酸甲酯和12-氧代月桂酸甲酯的形成情况。经过0分钟后从反应批次的有机相中取样作为阴性对照(附图13)，经过150分钟后(附图14)从反应批次的有机相中取样，然后使用GC (Thermo Trace GC Ultra)进行分析。将Varian Inc.FactorFourTM VF-5m作为色谱柱，长度：30m，膜厚：0.25μm，内径：0.25mm。

[0227] 分析条件：

[0228] 炉温 80-280℃

[0229] 斜坡 15℃/分钟

[0230] 分流比 15

[0231] 进样量 1μl

[0232] 载流 1.5ml/分钟

[0233] PTV进样器 80-280℃，斜坡为15℃/s

[0234] 检测器基本温度：320℃

[0235] 通过注入纯物质显示12-氧代月桂酸甲酯(附图11)和12-羟基月桂酸甲酯(附图12)的检测。

[0236] C将12-氧代月桂酸甲酯转化成12-氨基月桂酸甲酯

[0237] C1： 、表达拟南芥的转氨酶

[0238] 对拟南芥的已知转氨酶进行分析。分析结果令人惊奇：4-氨基丁酸转氨酶(at3g22200，SEQ.-ID.-No.38)展现出异源表达蛋白质相对于12-氧代十二烷酸甲酯的活性约为14U/mg。利用HPLC确认产物12-氨基十二烷酸甲酯。

[0239] 如果没有其它说明，所有方法均根据Sambrook，J.，Fritsch.，E.F.，&Maniatis，T(1989).Molecular cloning，第2版，纽约：冷泉港实验室出版社所描述的程序进行。 [0240] 拟南芥的4-氨基丁酸转氨酶(at3g22200)

[0241] 按照制造商QIAGEN GmbH(Hilden)的说明，利用RNeasy Mini Kit从一种完整的开花拟南芥植物中分离出RNA。然后根据制造商的说明，利用RTSkript Kit(USB Europe GmbH，Staufen)合成cDNA。按照制造商(Thermo FisherScientific Inc.Waltham USA)的说明，利用Nanodrop测定RNA质量/数量。

[0242] 拟南芥cDNA的PCR以嵌入切位点

[0243] 使用下列引物将编码为SEQ.-ID.-No.39的4-氨基丁酸转氨酶的DNA克隆到已消解了NaeI、BamHI的载体之中。

[0244] 正向引物嵌入蛋白酶切位点和NaeI，SEQ.-ID.-No.36

[0245] GCCGGCGAGAACCTGTACTTTCAGATGGCAAGTAAGTATGCCACTTG

[0246] 反向引物嵌入BamHI，SEQ.-ID.-No.37

[0247] GGATCCTCACTTCTTGTGCTGAGCCTTG

[0248] 根据下列程序进行PCR：

[0249]

[0250] 使用 Extract II Kit(Macherey-Nagel，德国，根据制造商说明)提纯得到的PCR产物。

[0251] 表达异源蛋白质

[0252] 使用上述PCR产物，通过标准分子生物学方法制备载体pGJ3130(附图15，SEQ.-ID.-No.43)，然后在大肠杆菌XL1blue中进行转化。在28℃条件下，在含有抗生素氨比西林(100μg/ml)并且加入了0.5mM IPTG的双份YT培养基(dYT)中培养转化后的大肠杆菌菌株，直至密度达到OD600nm＝0.3-0.4。

[0253] 通过6xHis-Tag提纯异源表达蛋白质

[0254] 溶解细菌表达培养基；将50ml培养基以2360x g离心分离，然后将其重新悬浮于含有5mM EDTA、300mM NaCl和1mg/ml溶菌酶的5ml磷酸钠缓冲液(pH 8)之中，在室温下培养1小时。以2360x g将溶解物离心分离10分钟，然后通过Protino Ni-TED 2000填充柱(根据制造商说明；Macherey-Nagel，Düren)提纯上清液。利用Bradford测定蛋白质浓度。

[0255] 采用偶联分析检测酶活性

[0256] 以偶联分析测定活性，在第二步骤中使作为转氨酶反应副产物出现的丙酮酸继续反应，将NADH氧化成NAD+。在340nm光度计中测定NADH浓度的下降率(原理：测定消光系数下降程度)，将浓度下降率作为活性评估尺度。

[0257]批次
50mM 磷酸钠pH 7.5
50mM L-丙氨酸
100μM 磷酸吡哆醛
250μg 12-氧代十二烷酸甲酯
1.25mM NADH
10U 乳酸脱氢酶
10μg 异源表达的蛋白质
使用H2O二次蒸馏 补充至1ml

[0258] 加入5μl 12-ODME(50mg/ml)开始进行分析。在340nm及室温条件下每分钟测定一次，连续测定最多20分钟。使用灭活蛋白质及不含协同底物的批次进行对比。附图16可以看出使用光度计测定的消光率变化。

[0259] 通过HPLC检测异源表达的蛋白质

[0260]批次
50mM 磷酸钠pH 7.5
50mM L-丙氨酸
100μM 磷酸吡哆醛
250μg 12-氧代十二烷酸甲酯
50μg 异源表达的蛋白质
使用H2O二次蒸馏 补充至500μl

[0261] 在室温条件下培养4小时之后，使用1Vol.MeOH终止反应

[0262] 使用邻苯二甲醛(oPA)衍化批次进行HPLC分析，然后从中取250μl进行分析。使用50mM NaAC pH 4∶乙腈4∶1(v∶v)作为流动相A。

[0263] 流动相B是含有5％50mM NaAC pH 4的乙腈。梯度在4分钟内从30％B变为60％B，在2分钟内从60％B变为100％B。流速为1.2ml/分钟。

[0264] 通过Agilent Zorbax RP18色谱柱(Agilent Technologies，USA)进行分离。色谱柱温度为40℃。附图17(上)示出12-氨基月桂酸甲酯形成情况。附图17下方示出参比试样。

[0265] D将12-氧代月桂酸甲酯与来自假单胞菌属的PPTA5和PSTA进行胺化反应[0266] D1.克隆PPTA5和PSTA

[0267] 使用大肠杆菌BL21(DE3)/PPTA5和大肠杆菌BL21(DE3)/PSTA菌株进行12-氧代月桂酸甲酯的胺化反应。按照如下所述构建这些菌株。选择表达载体pET-21a(+)(Novagen)来克隆两个转氨酶基因。针对ppta5基因(SEQ.-ID.-No.40)构建引物，这些引物应可在末端将限制性切位点NdeI和XhoI添加到基因上；引物PPTA5_NdeI：

[0268] GGAATTCCATATGAGCGTCAACAACCCGCAAACCCG(SEQ.-ID.-No.44) 和 引 物 PPTA5_XhoI：CCGCTCGAGTTATCGAATCGCCTCAAGGGTCAGGTCC(SEQ.-ID.-No.45)。 对 于 psta 基 因(SEQ.-ID.-No.41)，在末端添加含有NdeI和BamHI的引物；引物PSTA_NdeI： [0269] GGAATTCCATATGAGCGATTCGCAAACCCTGCACTGGC(SEQ.-ID.-No.46) 和 引 物 PSTA_BamHI：CGCGGATCCTCAGCCCAGCACATCCTTGGCTGTCG(SEQ.-ID.-No.47)

[0270] 在PCR过程中使用这些引物。然后使用限制性酶NdeI和XhoI或者NdeI和BamHI限制提纯后的PCR产物以及载体pET-21a(+)。使用虾的碱性磷酸酶对剪切的载体进行去磷酸化处理。使用T4 DNA连接酶与感受态表达菌株大肠杆菌XL1-Blue进行连接之后，使用NdeI和XhoI剪切的载体和ppta5基因以及使用NdeI和BamHI剪切的载体和psta基因进行转化。培育一些克隆之后，利用下列限制酶切分析法与凝胶电泳分析法分离出质粒。通过序列分析确认所获得的克隆物(pPPTA5或pPSTA)的转氨酶序列。附图18示出表达载体的质粒卡(Plasmidkarte)。

[0271] D2.表达PPTA5和PSTA

[0272] 将载体pPPTA5和pPSTA转化成感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞进行表达。将每一个单菌落在5ml LB-Amp-培养基(氨比西林浓度为100μg/ml)中进行接种，并且在37℃条件下振摇一夜。接着在1％的200ml LB-Amp-培养基中进行接种，在37℃条件下振摇，在OD600达到0.5之后，使用0.5mM IPTG诱导基因表达。在30℃条件下振摇20小时之后，收获细胞，并且在-20℃条件下存放。

[0273] 为了分解大肠杆菌BL21(DE3)/pPPTA5和大肠杆菌BL21(DE3)/pPSTA菌株，使用pH值为7.2的100mM Tris-HCl缓冲液分别将0.4g细胞处理成25％的细胞悬浮液，同时使用超声波(Bandelin Sonoplus HD2070；探针MS73； 50％强度)将其处理90秒钟各两次。经过离心分离之后抽取上清液。将所获得的提取物用于12-氧代月桂酸甲酯的转化反应。
400μl-批次含有5mM 12-氧代月桂酸甲酯，溶于N，N-二甲基甲酰胺、500mM DL-丙氨酸、
1mM吡哆醛-5’-磷酸盐以及80μl提取物溶于pH值为7.0的10mM Kpi-缓冲液之中。在
25℃温度下振摇。经过一定时间之后，分别取样20μl，使用1μl 1％的NaOH溶液将一部分调整到碱性pH范围，然后加入100μl醋酸乙酯充分振摇。对有机相进行气相色谱分析(Perkin Elmer公司的气相色谱仪，配有火焰离子探测器的Clarus 500)。为此使用Optima
5-色谱柱(0.25μm，30m，0.25mm，Macherey-Nagel)与下列程序：

[0274] 80℃

[0275] 25℃/分钟 180℃

[0276] 5℃/分钟 215℃

[0277] 20℃/分钟 280℃

[0278] 12-氧代月桂酸甲酯和12-氨基月桂酸甲酯的保留时间为7.2或7.7分钟。 [0279] 附图20和21示出转化结果。为了评估，由中性和酸性提取物的色谱图，将12-氧代月桂酸甲酯和12-氨基月桂酸甲酯的峰面积相加，然后计算进料物或产物的百分比含量。 [0280] 序列表

[0281] <110>Evonik Degussa GmbH

[0282] <120>生产ω-氨基羧酸或其内酰胺的，

[0283] 重组细胞

[0284] <130>200700667

[0285] <160>47

[0286] <170>PatentIn版本3.4

[0287] <210>1

[0288] <211>1380

[0289] <212>DNA

[0290] <213>紫色色杆菌

[0291] <400>1

[0292] atgcagaagc aacgtacgac cagccaatgg cgcgaactgg atgccgccca tcacctgcat 60 [0293] ccgttcaccg ataccgcatc gctgaaccag gcgggcgcgc gcgtgatgac gcgcggagag 120 [0294] ggcgtctacc tgtgggattc ggaaggcaac aagatcatcg acggcatggc cggactgtgg 180 [0295] tgcgtgaacg tcggctacgg ccgcaaggac tttgccgaag cggcgcgccg gcagatggaa 240 [0296] gagctgccgt tctacaacac cttcttcaag accacccatc cggcggtggt cgagctgtcc 300 [0297] agcctgctgg ctgaagtgac gccggccggt ttcgaccgcg tgttctatac caattccggt 360 [0298] tccgaatcgg tggacaccat gatccgcatg gtgcgccgct actgggacgt gcagggcaag 420 [0299] ccggagaaga agacgctgat cggccgctgg aacggctatc acggctccac catcggcggc 480 [0300] gccagcctgg gcggcatgaa gtacatgcac gagcagggcg acttgccgat tccgggcatg 540 [0301] gcccacatcg agcagccttg gtggtacaag cacggcaagg acatgacgcc ggacgagttc 600 [0302] ggcgtggtgg ccgcgcgctg gctggaagag aagattctgg aaatcggcgc cgacaaggtg 660 [0303] gccgccttcg tcggcgaacc catccagggc gccggcggcg tgatcgtccc gccggccacc 720 [0304] tactggccgg aaatcgagcg catttgccgc aagtacgacg tgctgctggt ggccgacgaa 780 [0305] gtgatctgcg gcttcgggcg taccggcgaa tggttcggcc atcagcattt cggcttccag 840 [0306] cccgacctgt tcaccgccgc caagggcctg tcctccggct atctgccgat aggcgcggtc 900 [0307] tttgtcggca agcgcgtggc cgaaggcctg atcgccggcg gcgacttcaa ccacggcttc 960 [0308] acctactccg gccacccggt ctgcgccgcc gtcgcccacg ccaacgtggc ggcgctgcgc 1020 [0309] gacgagggca tcgtccagcg cgtcaaggac gacatcggcc cgtacatgca aaagcgctgg 1080 [0310] cgtgaaacct tcagccgttt cgagcatgtg gacgacgtgc gcggcgtcgg catggtgcag 1140 [0311] gcgttcaccc tggtgaagaa caaggcgaag cgcgagctgt tccccgattt cggcgagatc 1200 [0312] ggcacgctgt gccgcgacat cttcttccgc aacaacctga tcatgcgggc atgcggcgac 1260 [0313] cacatcgtgt cggcgccgcc gctggtgatg acgcgggcgg aagtggacga gatgctggcg 1320 [0314] gtggcggaac gctgtctgga ggaattcgag cagacgctga aggcgcgcgg gctggcttag 1380 [0315] <210>2

[0316] <211>1137

[0317] <212>DNA

[0318] <213>枯草芽孢杆菌

[0319] <400>2

[0320] atgatcatag gggttcctaa agagataaaa aacaatgaaa accgtgtcgc attaacaccc 60 [0321] gggggcgttt ctcagctcat ttcaaacggc caccgggtgc tggttgaaac aggcgcgggc 120 [0322] cttggaagcg gatttgaaaa tgaagcctat gagtcagcag gagcggaaat cattgctgat 180 [0323] ccgaagcagg tctgggacgc cgaaatggtc atgaaagtaa aagaaccgct gccggaagaa 240 [0324] tatgtttatt ttcgcaaagg acttgtgctg tttacgtacc ttcatttagc agctgagcct 300 [0325] gagcttgcac aggccttgaa ggataaagga gtaactgcca tcgcatatga aacggtcagt 360 [0326] gaaggccgga cattgcctct tctgacgcca atgtcagagg ttgcgggcag aatggcagcg 420 [0327] caaatcggcg ctcaattctt agaaaagcct aaaggcggaa aaggcattct gcttgccggg 480 [0328] gtgcctggcg tttcccgcgg aaaagtaaca attatcggag gaggcgttgt cgggacaaac 540 [0329] gcggcgaaaa tggctgtcgg cctcggtgca gatgtgacga tcattgactt aaacgcagac 600 [0330] cgcttgcgcc agcttgatga catcttcggc catcagatta aaacgttaat ttctaatccg 660 [0331] gtcaatattg ctgatgctgt ggcggaagcg gatctcctca tttgcgcggt attaattccg 720 [0332] ggtgctaaag ctccgactct tgtcactgag gaaatggtaa aacaaatgaa acccggttca 780 [0333] gttattgttg atgtagcgat cgaccaaggc ggcatcgtcg aaactgtcga ccatatcaca 840 [0334] acacatgatc agccaacata tgaaaaacac ggggttgtgc attatgctgt agcgaacatg 900 [0335] ccaggcgcag tccctcgtac atcaacaatc gccctgacta acgttactgt tccatacgcg 960 [0336] ctgcaaatcg cgaacaaagg ggcagtaaaa gcgctcgcag acaatacggc actgagagcg 1020 [0337] ggtttaaaca ccgcaaacgg acacgtgacc tatgaagctg tagcaagaga tctaggctat 1080 [0338] gagtatgttc ctgccgagaa agctttacag gatgaatcat ctgtggcggg tgcttaa 1137 [0339] <210>3

[0340] <211>1206

[0341] <212>DNA

[0342] <213>恶臭假单胞菌

[0343] <400>3

[0344] atgcttgaga aacacagagt tctggattcc gctccagagt acgtagataa aaagaaatat 60 [0345] ctctggatac tatcaacttt gtggccggct actccgatga tcggaatctg gcttgcaaat 120 [0346] gaaactggtt gggggatttt ttatgggctg gtattgctcg tatggtacgg cgcacttcca 180 [0347] ttgcttgatg cgatgtttgg tgaggacttt aataatccgc ctgaagaagt ggtgccgaaa 240 [0348] ctagagaagg agcggtacta tcgagttttg acatatctaa cagttcctat gcattacgct 300 [0349] gcattaattg tgtcagcatg gtgggtcgga actcagccaa tgtcttggct tgaaattggt 360 [0350] gcgcttgcct tgtcactggg tatcgtgaac ggactagcgc tcaatacagg acacgaactc 420 [0351] ggtcacaaga aggagacttt tgatcgttgg atggccaaaa ttgtgttggc tgtcgtaggg 480 [0352] tacggtcact tctttattga gcataataag ggtcatcacc gtgatgtcgc tacaccgatg 540 [0353] gatcctgcaa catcccggat gggagaaagc atttataagt tttcaatccg tgagatccca 600 [0354] ggagcattta ttcgtgcttg ggggcttgag gaacaacgcc tttcgcgccg tggccaaagc 660 [0355] gtttggagtt tcgataatga aatcctccaa ccaatgatca tcacagttat tctttacgcc 720 [0356] gttctccttg ccttgtttgg acctaagatg ctggtgttcc tgccgattca aatggctttc 780 [0357] ggttggtggc agctgaccag tgcgaactat attgaacatt acggcttgct ccgtcaaaaa 840 [0358] atggaggacg gtcgatatga gcatcaaaag ccgcaccatt cttggaatag taatcacatc 900 [0359] gtctctaatc tagtgctgtt ccaccttcag cggcactcgg atcaccacgc gcatccaaca 960 [0360] cgttcttatc agtcacttcg ggattttccc ggcctgccgg ctcttccgac gggttaccct 1020 [0361] ggtgcatttt tgatggcgat gattcctcag tggtttagat cagttatgga tcccaaggta 1080 [0362] gtagattggg ctggtggtga ccttaataag atccaaattg atgattcgat gcgagaaacc 1140 [0363] tatttgaaaa aatttggcac tagtagtgct ggtcatagtt cgagtacctc tgcggtagca 1200 [0364] tcgtag

[0365] 1206

[0366] <210>4

[0367] <211>519

[0368] <212>DNA

[0369] <213>恶臭假单胞菌

[0370] <400>4

[0371] atggctagct ataaatgccc ggattgtaat tatgtttatg atgagagtgc gggtaatgtg 60 [0372] catgaggggt tttctccagg tacgccttgg caccttattc ctgaggattg gtgctgcccc 120 [0373] gattgcgccg ttcgagacaa gcttgacttc atgttaattg agagcggcgt aggtgaaaag 180 [0374] ggcgtcacct caacccatac ttcgccaaat ttatccgagg ttagtggcac aagtttaact 240 [0375] gctgaagcag tggttgcgcc gacaagctta gagaaattgc ctagtgccga cgttaaaggc 300 [0376] caagatctat ataaaactca acctccaagg tctgatgccc aaggcgggaa agcatacttg 360 [0377] aagtggatat gtattacttg tggccatata tatgatgagg cgttgggcga tgaggccgag 420 [0378] ggttttactc caggtactcg ctttgaggat attcctgatg actggtgctg tccggattgc 480 [0379] ggggctacga aagaagacta tgtgctctac gaggaaaag 519 [0380] <210>5

[0381] <211>1677

[0382] <212>DNA

[0383] <213>恶臭假单胞菌

[0384] <400>5

[0385] atgtacgact atataatcgt tggtgctgga tctgcaggat gtgtgcttgc taatcgtctt 60 [0386] tcggccgacc cctctaaaag agtttgttta cttgaagctg ggccgcgaga tacgaatccg 120 [0387] ctaattcata tgccgttagg tattgctttg ctttcaaata gtaaaaagtt gaattgggct 180 [0388] tttcaaactg cgccacagca aaatctcaac ggccggagcc ttttctggcc acgaggaaaa 240 [0389] acgttaggtg gttcaagctc aatcaacgca atggtctata tccgagggca tgaagacgat 300 [0390] taccacgcat gggagcaggc ggccggccgc tactggggtt ggtaccgggc tcttgagttg 360 [0391] ttcaaaaggc ttgaatgcaa ccagcgattc gataagtccg agcaccatgg ggttgacgga 420 [0392] gaattagctg ttagtgattt aaaatatatc aatccgctta gcaaagcatt cgtgcaagcc 480 [0393] ggcatggagg ccaatattaa tttcaacgga gatttcaacg gcgagtacca ggacggcgta 540 [0394] gggttctatc aagtaaccca aaaaaatgga caacgctgga gctcggcgcg tgcattcttg 600 [0395] cacggtgtac tttccagacc aaatctagac atcattactg atgcgcatgc atcaaaaatt 660 [0396] ctttttgaag accgtaaggc ggttggtgttt cttatataa agaaaaatat gcaccatcaa 720 [0397] gtcaagacaa cgagtggtgg tgaagtactt cttagtcttg gcgcagtcgg cacgcctcac 780 [0398] cttctaatgc tttctggtgt tggggctgca gccgagctta aggaacatgg tgtttctcta 840 [0399] gtccatgatc ttcctgaggt ggggaaaaat cttcaagatc atttggacat cacattgatg 900 [0400] tgcgcagcaa attcgagaga gccgataggt gttgctcttt ctttcatccc tcgtggtgtc 960 [0401] tcgggtttgt tttcatatgt gtttaagcgc gaggggtttc tcactagtaa cgtggcagag 1020 [0402] tcgggtggtt ttgtaaaaag ttctcctgat cgtgatcggc ccaatttgca gtttcatttc 1080 [0403] cttccaactt atcttaaaga tcacggtcga aaaatagcgg gtggttatgg ttatacgcta 1140 [0404] catatatgtg atcttttgcc taagagccga ggcagaattg gcctaaaaag cgccaatcca 1200 [0405] ttacagccgc ctttaattga cccgaactat cttagcgatc atgaagatat taaaaccatg 1260 [0406] attgcgggta ttaagatagg gcgcgctatt ttgcaggccc catcgatggc gaagcatttt 1320 [0407] aagcatgaag tagtaccggg ccaggctgtt aaaactgatg atgaaataat cgaagatatt 1380 [0408] cgtaggcgag ctgagactat ataccatccg gtaggtactt gtaggatggg taaagatcca 1440 [0409] gcgtcagttg ttgatccgtg cctgaagatc cgtgggttgg caaatattag agtcgttgat 1500 [0410] gcgtcaatta tgccgcactt ggtcgcgggt aacacaaacg ctccaactat tatgattgca 1560 [0411] gaaaatgcgg cagaaataat tatgcggaat cttgatgtgg aagcattaga ggctagcgct 1620 [0412] gagtttgctc gcgagggtgc agagctagag ttggccatga tagctgtctg catgtaa 1677 [0413] <210>6

[0414] <211>2649

[0415] <212>DNA

[0416] <213>恶臭假单胞菌

[0417] <400>6

[0418] atgaaaataa taataaataa tgatttcccg gtcgctaagg tcggagcgga tcaaattacg 60 [0419] actctagtaa gtgccaaagt tcatagttgc atatatcggc caagattgag tatcgcggat 120 [0420] ggagccgctc ccagagtatg cctttacaga gccccacctg gatatgggaa aaccgttgct 180 [0421] cttgcgttcg agtggctacg ccacagaaca gccggacgtc ctgcagtgtg gctttcttta 240 [0422] agagccagtt cttacagtga atttgatatc tgcgcagaga ttattgagca gcttgaaact 300 [0423] ttcgaaatgg taaaattcag ccgtgtgaga gagggtgtga gcaagcctgc gctcttgcga 360 [0424] gaccttgcat ctagtctttg gcagagcacc tcgaataacg agatagaaac gctagtttgt 420 [0425] ttggataata ttaatcatga cttagacttg ccgttgttgc acgcacttat ggagtttatg 480 [0426] ttaaatacac caaaaaatat caggtttgca gttgcaggca atacaataaa agggttctcg 540 [0427] cagcttaaac ttgcaggcgc tatgcgggag tacaccgaga aagacttggc ctttagcgca 600 [0428] gaagaggcgg tggcgttagc ggaggcagag tctgttcttg gagttcctga agaacagata 660 [0429] gagaccttgg tgcaagaagt tgaggggtgg cctgctcttg tagttttttt gttaaagcgt 720 [0430] gagttgccgg ccaagcatat ttcagcagta gttgaagtag acaattactt tagggatgaa 780 [0431] atatttgagg cgattcccga gcgctatcgt gtttttcttg caaattcttc attgctcgat 840 [0432] ttcgtgacgc ctgatcaata caattatgta ttcaaatgcg tcaatggggt ctcatgtatt 900 [0433] aagtatttaa gcactaatta catgttgctt cgccatgtga gcggtgagcc agcgcagttt 960 [0434] acactgcatc cagtactgcg taattttcta cgagaaatta cttggactga aaatcctgct 1020 [0435] aaaagatcct acctgcttaa gcgtgcagct ttctggcatt ggcgtagagg tgaataccag 1080 [0436] tatgcaatac gaatatccct acgggcgaat gactgtcgct gggcagtcag catgtctgag 1140 [0437] agaataattt tagatttgtc atttcgtcag ggcgaaatag atgcgctgag acagtggctg 1200 [0438] ttagagctgc cgaagcaggc ctggcaccaa aaacccatag tgcttattag ttacgcgtgg 1260 [0439] gtattgtatt tcagtcagca aggcgcgcga gcagagaagt taattaaaga cctatcttca 1320 [0440] caatccgata aaaaaaataa atggcaagaa aaggaatggc tgcagcttgt gcttgcaata 1380 [0441] ggtaaagcaa ccaaagatga aatgctttcg agtgaggagc tctgtaataa gtggattagt 1440 [0442] ttatttgggg attcaaacgc agttggaaaa ggggccgcgc taacctgttt ggcttttatt 1500 [0443] tttgccagtg agtatagatt tgcagagttg gagaaggtgc tggctcaggc ccaagccgtg 1560 [0444] aataaatttg caaaacaaaa ttttgctttt ggttggctgt atgtcgcgag gtttcaacaa 1620 [0445] gccctagcaa gcggaaaaat gggctgggcg aggcagatta taactcaagc acgcacagac 1680 [0446] agtcgcgcgc agatgatgga atccgagttt acttcgaaaa tgtttgacgc tctagagctt 1740 [0447] gagttacatt atgaattgcg ctgcttggac acctcagaag aaaagctctc caaaatttta 1800 [0448] gagttcattt ccaatcacgg ggtgacagac gtgttttttt ccgtatgccg tgctgtgtca 1860 [0449] gcttggcggc ttggaaggag tgacctaaat ggctccattg agatattgga gtgggcgaag 1920 [0450] gcgcatgcgg ttgaaaaaaa tctaccaaga ttggaagtta tgagccaaat tgagatctat 1980 [0451] cagcgcttag tctgtcaagg cataacgggc ataaataatt taaaaactct tgaagatcat 2040 [0452] aagattttct ccggacagca ctcagccccc ctaaaagcac gcctgctgct tgttcaatca 2100 [0453] ctagtgcttt cccgagatcg gaactttcat agtgccgcgc acagagcgtt attggctatt 2160 [0454] cagcaagccc gtaaaattaa cgcgggccag ctggaagtcc gtggattatt gtgtttggcc 2220 [0455] ggagcgcagg caggtgccgg tgatttaaaa aaggctcagc ttaacattgt ttatgcagtg 2280 [0456] gagatagcaa aacagcttca atgctttcaa acagttcttg atgaagtatg tttaattgag 2340 [0457] cgaataatac cggcttcatg tgaagccttc acagcagtta atttagatca agcgattggg 2400 [0458] gcttttagtc ttccgcgaat agttgagatt ggaaagtccg cagagaataa agctgacgct 2460 [0459] ttattgacac ggaagcagat tgctgtcttg aggcttgtaa aagaggggtg ctcaaacaaa 2520 [0460] caaatagcaa caaatatgca tgtcaccgaa gatgctataa agtggcatat gaggaaaata 2580 [0461] tttgccacct tgaatgtagt gaatcgcacg caagcaacaa ttgaagctga gcgtcaagga 2640 [0462] attatctaa

[0463] 2649

[0464] <210>7

[0465] <211>1158

[0466] <212>DNA

[0467] <213>恶臭假单胞菌

[0468] <400>7

[0469] atggcaatcg ttgttgttgg cgctggtaca gctggagtaa atgctgcgtt ctggcttcgt 60 [0470] caatatggtt ataaagggga aattaggatt tttagcaggg agtctgtggc gccttatcag 120 [0471] cggcctcctc tatccaaggc ttttctgaca agtgagattg cagaatccgc agtgccatta 180 [0472] aagccagaag gtttttatac gaataacaat attaccattt cgttaaatac accgattgta 240 [0473] tcaatcgacg tggggcgtaa gatagtttct tctaaagatg gaaaagaata cgcgtatgaa 300 [0474] aaattgattc ttgcaacacc tgctagcgca cgtaggttaa cctgcgaggg gtctgaactg 360 [0475] tctggggtct gctatttacg cagtatggaa gacgccaaaa atttacgtag gaaacttgtg 420 [0476] gagagtgcgt ctgttgttgt gttgggcggc ggagtaatcg ggcttgaagt cgcctcagct 480 [0477] gcggtgggct tagggaagag ggtcacagtg atagaagcca ccccgcgtgt aatggcgcgc 540 [0478] gtggttacgc cggcagcagc aaacttagtc agagcccgcc tggaggctga aggaattgag 600 [0479] ttcaagctga atgcgaaatt aacgtctata aagggcagga atggccatgt tgaacaatgc 660 [0480] gtacttgaaa gtggagaaga aattcaggcg gatctgattg tagttggaat cggtgctatc 720 [0481] ccagagctag agctggcaac tgaggcggcc cttgaagtga gtaatggtgt tgtggtcgat 780 [0482] gatcagatgt gtacatcgga tacaagtata tatgcaatcg gcgactgcgc aatggctaga 840 [0483] aatccttttt ggggaacgat ggtacgttta gagacaattc ataatgcggt tacacacgct 900 [0484] caaattgtcg caagtagcat ctgtggcaca tcaacaccag caccaacccc accacggttc 960 [0485] tggtctgatc ttaaagggat ggcgctgcaa ggacttggtg ctctaaagga ctacgataaa 1020 [0486] ctcgttgttg caattaataa cgaaactctt gaactagaag tccttgcgta caagcaggag 1080 [0487] cgactgattg caactgagac aataaatttg cctaaacgtc aaggtgcgct tgcagggagt 1140 [0488] ataaaattac ctgattag

[0489] 1158

[0490] <210>8

[0491] <211>33

[0492] <212>DNA

[0493] <213>人工序列

[0494] <220>

[0495] <223>引物

[0496] <400>8

[0497] acgtagcggc cgcctaatca ggtaatttta tac 33 [0498] <210>9

[0499] <211>16

[0500] <212>DNA

[0501] <213>人工序列

[0502] <220>

[0503] <223>引物

[0504] <400>9

[0505] gagcgagcta tctggt

[0506] 16

[0507] <210>10

[0508] <211>32

[0509] <212>DNA

[0510] <213>人工序列

[0511] <220>

[0512] <223>引物

[0513] <400>10

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[1361] Leu Pro His Val Ile Asp Ile Arg Asn Cys Gly Leu Ala Gly Ala Val [1362] 370 375 380

[1363] Gln Ile Ala Pro Ser Gly Gly Asp Ala Ile Val Arg Pro Tyr Glu Ala [1364] 385 390 395 400 [1365] Ala Met Ala Leu Trp Arg Lys Gly Phe Tyr Val Arg Tyr Gly Gly Asp [1366] 405 410 415 [1367] Ala Leu Gln Phe Gly Pro Pro Phe Thr Ala Thr Pro Gln Glu Leu Asp [1368] 420 425 430 [1369] Ser Leu Phe Asp Ala Val Gly Glu Thr Leu Ala Lys Leu Ala

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[1544] ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 10020 [1545] cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 10080 [1546] caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 10140 [1547] ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg 10200 [1548] taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 10260 [1549] taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 10320 [1550] cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg 10380 [1551] tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt 10440 [1552] gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt 10500 [1553] catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa 10560 [1554] atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatcga ttggtcggtc 10620 [1555] atttcgaacc ccagagtccc gctcagaaga actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc 10680 [1556] gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc 10740 [1557] caagctcttc agcaatatca cgggtagcca acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac 10800 [1558] ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa agcggccatt ttccaccatg atattcggca 10860 [1559] agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc 10920 [1560] tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga 10980 [1561] caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga 11040 [1562] atgggcaggt agccggatca agcgtatgca gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata 11100 [1563] ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata 11160 [1564] gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg 11220 [1565] tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca 11280 [1566] ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc cctgcgctga cagccggaac acggcggcat 11340 [1567] cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg 11400 [1568] ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct 11460 [1569] cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt 11520 [1570] ttactttgca gggcttccc

[1571] 11539

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[1581] <211>35

[1582] <212>DNA

[1583] <213>人工

[1584] <220>

[1585] <223>引物

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[1587] aaaattcgcg tcgacaagcg ctgaatgggt atcgg 35 [1588] <210>34

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[1593] <223>引物

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[1612] gccggcgaga acctgtactt tcagatggca agtaagtatg ccacttg 47 [1613] <210>37

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[1615] <212>DNA

[1616] <213>人工

[1617] <220>

[1618] <223>引物

[1619] <400>37

[1620] ggatcctcac ttcttgtgct gagccttg

[1621] 28

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[1623] <211>446

[1624] <212>PRT

[1625] <213>拟南芥

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[1627] Met Val Val Ile Asn Ser Leu Arg Arg Leu Ala Arg Thr Thr Gln Val [1628] 1 5 10 15 [1629] His Leu His Ser Lys Tyr Ala Thr Cys Met Ser Gly Asn Ser Thr Ser [1630] 20 25 30 [1631] Arg Arg Ile Phe Thr Thr Glu Ala Ala Pro Glu Lys Gly Asn Glu Pro [1632] 35 40 45

[1633] Arg Leu Val Ser Ala Ala Val Glu Gln Leu Asn Thr Leu Pro Phe Tyr [1634] 50 55 60

[1635] His Ser Phe Trp Asn Arg Thr Thr Lys Pro Ser Leu Asp Leu Ala Lys [1636] 65 70 75 80 [1637] Val Leu Leu Glu Met Phe Thr Ala Asn Lys Met Ala Lys Ala Phe Phe [1638] 85 90 95 [1639] Thr Ser Gly Gly Ser Asp Ala Asn Asp Thr Gln Val Lys Leu Val Trp [1640] 100 105 110 [1641] Tyr Tyr Asn Asn Ala Leu Gly Arg Pro Glu Lys Lys Lys Phe Ile Ala [1642] 115 120 125

[1643] Arg Lys Lys Ser Tyr His Gly Ser Thr Leu Ile Ser Ala Ser Leu Ser [1644] 130 135 140

[1645] Gly Leu Pro Pro Leu His Gln Asn Phe Asp Leu Pro Ala Pro Phe Val [1646] 145 150 155 160 [1647] Leu His Thr Asp Cys Pro His Tyr Trp Arg Phe His Leu Pro Gly Glu [1648] 165 170 175 [1649] Thr Glu Glu Glu Phe Ser Thr Arg Leu Ala Lys Asn Leu Glu Asp Leu [1650] 180 185 190 [1651] Ile Ile Lys Glu Gly Pro Glu Thr Ile Gly Ala Phe Ile Ala Glu Pro [1652] 195 200 205

[1653] Val Met Gly Ala Gly Gly Val Ile Pro Pro Pro Ala Thr Tyr Phe Glu [1654] 210 215 220

[1655] Lys Val Gln Ala Val Val Lys Lys Tyr Asp Ile Leu Phe Ile Ala Asp [1656] 225 230 235 240 [1657] Glu Val Ile Cys Ala Phe Gly Arg Leu Gly Thr Met Phe Gly Cys Asp [1658] 245 250 255 [1659] Lys Tyr Asn Ile Lys Pro Asp Leu Val Thr Leu Ala Lys Ala Leu Ser [1660] 260 265 270 [1661] Ser Ala Tyr Met Pro Ile Gly Ala Ile Leu Met Ser Gln Glu Val Ala [1662] 275 280 285

[1663] Asp Val Ile Asn Ser His Ser Ser Lys Leu Gly Val Phe Ser His Gly [1664] 290 295 300

[1665] Phe Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Ser Cys Ala Val Ala Ile Glu Ala [1666] 305 310 315 320 [1667] Leu Lys Ile Tyr Lys Glu Arg Asn Ile Pro Glu Tyr Val Ala Lys Val [1668] 325 330 335 [1669] Ala Pro Arg Phe Gln Asp Gly Val Lys Ala Phe Ala Ser Gly Ser Pro [1670] 340 345 350 [1671] Ile Ile Gly Glu Thr Arg Gly Thr Gly Leu Ile Leu Gly Thr Glu Phe [1672] 355 360 365

[1673] Val Asp Asn Lys Ser Pro Asn Glu Pro Phe Pro Pro Glu Trp Gly Val [1674] 370 375 380

[1675] Gly Ala Phe Phe Gly Ala Glu Cys Gln Lys His Gly Met Leu Val Arg [1676] 385 390 395 400 [1677] Val Ala Gly Asp Gly Ile Leu Met Ser Pro Pro Leu Ile Ile Ser Pro [1678] 405 410 415 [1679] Glu Glu Ile Asp Glu Leu Ile Ser Ile Tyr Gly Lys Ala Leu Lys Ala [1680] 420 425 430 [1681] Thr Glu Glu Lys Val Lys Glu Leu Lys Ala Gln His Lys Lys

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[1683] <210>39

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[1685] <212>DNA

[1686] <213>拟南芥

[1687] <400>39

[1688] atggtcgtta tcaacagtct ccgacgcttg gcgcgtacca ctcaggttca tttgcacagt 60 [1689] aagtatgcca cttgcatgtc tgggaactcc acttccagga ggattttcac tactgaggca 120 [1690] gcacctgaga agaaaaacac tgttgggtct aaagggcatg atatgcttgc accttttact 180 [1691] gctggatggc agagtgctga tttagatccc ttggtcattg caaagtctga gggaagttat 240 [1692] gtgtatgatg atactgggaa aaaatatctt gactctctcg ctggtttatg gtgtactgcc 300 [1693] ttaggaggaa atgagccaag gcttgtttct gccgctgttg aacagttgaa caccttgccg 360 [1694] ttttatcact ccttttggaa ccgtactact aaaccttctc tggatcttgc taaggttctt 420 [1695] ttagagatgt tcacggccaa caaaatggcc aaagcatttt ttacaagcgg tggatcagat 480 [1696] gccaacgata cccaggtcaa gctggtttgg tattacaata acgcacttgg aaggcccgag 540 [1697] aagaaaaagt ttatcgcgag aaagaaatcg taccatggct ccactctaat atcagcaagt 600 [1698] ttgtccggcc ttcccccgct acaccaaaat tttgatttac ctgcaccatt tgtgttgcac 660 [1699] acagattgcc ctcattattg gcgttttcat cttccaggcg aaacggaaga ggagttctca 720 [1700] accagattag ccaagaattt agaggatcta atcatcaaag aaggaccaga aactattggt 780 [1701] gcttttatag ctgaaccagt catgggtgct gggggtgtga tacctccacc tgctacctac 840 [1702] tttgaaaagg ttcaagctgt tgttaagaaa tatgatatct tgttcattgc tgatgaggtg 900 [1703] atatgtgcat ttggaaggct cgggacaatg tttggctgtg acaaatacaa cattaagcca 960 [1704] gatcttgtga ccttagctaa ggcactgtct tcagcatata tgccgattgg agccattctt 1020 [1705] atgagccaag aagtggcaga tgtcataaat tctcatagca gcaagctagg cgttttctcc 1080 [1706] catggattta cttattctgg tcatccagtt tcgtgtgctg tagcaattga agcgttaaag 1140 [1707] atatacaagg agaggaacat accagagtat gtcgccaaag ttgccccaag gtttcaagat 1200 [1708] ggagttaaag cgtttgcctc tggtagtcct attattggag agacaagagg aacaggtttg 1260 [1709] attcttggga ctgagtttgt agacaataaa tctccgaacg aaccatttcc accagaatgg 1320 [1710] ggtgttggcg cattctttgg agccgagtgc cagaagcacg ggatgttagt ccgtgttgca 1380 [1711] ggtgatggca ttttgatgtc tccaccgctc attatctcac ctgaagagat tgatgagttg 1440 [1712] atttctatct atgggaaagc attgaaggca acggaagaga aggtaaaaga actcaaggct 1500 [1713] cagcacaaga agtga

[1714] 1515

[1715] <210>40

[1716] <211>1362

[1717] <212>DNA

[1718] <213>假单胞菌属

[1719] <400>40

[1720] atgagcgtca acaacccgca aacccgtgaa tggcaaaccc tgagcgggga gcaccatctc 60 [1721] gcacctttca gtgactacaa gcagctgaag gagaaggggc cgcgcatcat caccaaggcc 120 [1722] cagggggtgc atttgtggga cagcgagggg cacaagatcc tcgacggcat ggcgggcctg 180 [1723] tggtgcgtgg cggtgggtta cggccgtgaa gagctggttc aggcagcaga aaagcagatg 240 [1724] cgcgagctgc cgtactacaa cctgttcttc cagacggccc acccgcctgc actggaactg 300 [1725] gccaaggcca ttaccgatgt ggcgcccgag ggcatgaccc atgtgttctt caccggctcc 360 [1726] ggctccgaag gcaacgacac cgtgctgcgc atggtgcgcc actactgggc gttgaagggc 420 [1727] aagccgcaca agcagaccat catcggccgt atcaacggct accacggctc caccttcgcc 480 [1728] ggtgcttgcc tgggcggcat gagcggcatg cacgagcagg gcggcctgcc gatcccgggc 540 [1729] atcgtgcaca tcccgcagcc gtactggttc ggcgaaggcg gtgacatgac cccggatgcg 600 [1730] ttcggtatct gggcggccga acagctggag aagaaaatcc tcgaagtcgg cgaagacaac 660 [1731] gtcgccgcct tcatcgccga gcctatccag ggcgcaggcg gcgtgatcat cccgccggaa 720 [1732] acctactggc cgaaggtgaa ggagattctc gccaagtacg acatcctgtt cgttgccgac 780 [1733] gaagtcatct gtggtttcgg ccgtaccggc gagtggttcg gctctgatta ctacgacctc 840 [1734] aagcccgacc tgatgaccat cgccaagggc ctgacctccg gttacatccc catgggcggt 900 [1735] gtgatcgtgc gtgacaaagt ggccaaggtg atcagcgaag gcggtgactt caaccacggc 960 [1736] ttcacctatt cgggccaccc ggtagcggcg gcggtgggcc tggaaaacct gcgcatcctg 1020 [1737] cgcgacgagc aaattgtcga gaaggcgcgt actgaagcgg caccgtattt gcaaaagcgt 1080 [1738] ttgcgtgagc tgcaggacca cccgctggtg ggtgaagtgc gcggccttgg catgcttggc 1140 [1739] gcgatcgagc tggtgaaaga caaggccacc cgcagccgtt acgagggcaa gggcgtgggc 1200 [1740] atgatctgcc gcaccttctg cttcgaaaac ggcctgatca tgcgtgcggt gggtgacacc 1260 [1741] atgatcatcg cgccgccgct ggtcatcagc catgcggaaa tcgacgaact ggtggaaaag 1320 [1742] gcacgcaaat gcctcgacct gacccttgag gcgattcgat aa 1362 [1743] <210>41

[1744] <211>1359

[1745] <212>DNA

[1746] <213>假单胞菌属

[1747] <400>41

[1748] atgagcgatt cgcaaaccct gcactggcaa gcgctgagcc gcgaccatca tctgccgccg 60 [1749] ttcaccgatt acaaggcgct gaacgccaaa ggcacgcgca tcatcaccaa ggcgtcaggc 120 [1750] gtctacctgt gggacagcga aggccacaag atcctcgacg ccatggccgg gctctggtgc 180 [1751] gtcaacctgg gctatggccg cgaggagctg gtcgaggccg cgaccaggca gatgcgcgag 240 [1752] ctgccgtact acaacctgtt cttccagacc gcccacccgc cggccgtggc gctggccaag 300 [1753] gcgattgccg acatcgcgcc ggccgggatg aaccatgtgt tcttcaccgg ctccggctcg 360 [1754] gaggccaacg acaccgtgct gcgcatggtg cgccattact gggcgatcaa gggccagccg 420 [1755] gcgaagaagg tggtcatcgg ccgctggaat ggctatcacg gctcgaccat cgctggcgca 480 [1756] agcctcggtg gcatgaaggc catgcacgag cagggcgacg gcccgatccc cggcatcgag 540 [1757] catatcgacc agccctactg gttcggcgag ggtggcgaca tgagcccgga agagttcggc 600 [1758] gtgcgcatcg ccgaccagct ggagcagaag atccttgagg tcggcgagga caaggtcgcc660

[1759] gccttcatcg ccgaacctat ccagggcgcc ggcggcgtga tcatcccgcc cgagagctac 720 [1760] tggccgcggg tcaaggaaat cctcgcgcgc tacgacattc tcttcatcgc cgacgaggtc 780 [1761] atctgcggct tcggccgtac cggtgagtgg ttcggcagcg actactacgg cctcgagccg 840 [1762] gacctgatgc cgatcgccaa gggcctgacc tctggctaca tccccatggg cggcgtagtg 900 [1763] gtgcgcgacg aagtggtgca cacgctcaac gagggcggcg agttctacca cggcttcacc 960 [1764] tactcggggc accccgtggc cgccgcggtg gcgctggaga acatccgcat cctgcgcgag 1020 [1765] gagaagatcg tcgagcgggt gaagacgaag acggcaccct atttgcagtc ccgttggcag 1080 [1766] gaactgctcg agcatccgct ggtaggcgag gcgcgcggcg tcggcctgct tggtgcgctg 1140 [1767] gagttggtga agaacaagaa gacccgcgaa cgctttgccg atcccggtgt gggcatgctc 1200 [1768] tgtcgcgagc actgcttccg caacggcctg gtgatgcgtg cggttggcga caccatgatc 1260 [1769] atttcgccgc cgctggtgat cagcgaagag cagatcgacg agctggttgg caaggtgcgg 1320 [1770] ttgtgcctcg acgccacggc caaggatgtg ctgggctga 1359 [1771] <210>42

[1772] <211>1380

[1773] <212>DNA

[1774] <213>人工

[1775] <220>

[1776] <223>在大肠杆菌中用于表达的密码子优化基因

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[1778] atgcagaaac agcgtaccac ctctcagtgg cgtgaactgg atgcggcgca tcatctgcat 60 [1779] ccgtttaccg ataccgcgag cctgaatcag gcgggtgcgc gtgtgatgac ccgtggcgaa 120 [1780] ggcgtgtatc tgtgggatag cgaaggcaac aaaattattg atggcatggc gggcctgtgg 180 [1781] tgcgtgaacg tgggctatgg ccgtaaagat tttgcggaag cggcgcgtcg tcagatggaa 240 [1782] gaactgccgt tttataacac cttctttaaa accacccatc cggcggtggt ggaactgagc 300 [1783] agcctgctgg ccgaagttac cccggcaggt tttgatcgtg tgttttatac caacagcggc 360 [1784] agcgaaagcg tggataccat gattcgtatg gtgcgtcgtt attgggatgt gcagggcaaa 420 [1785] ccggaaaaaa aaaccctgat tggccgttgg aacggctatc acggcagcac cattggcggt 480 [1786] gcgagcctgg gcggcatgaa atatatgcat gaacagggcg atctgccgat tccgggcatg 540 [1787] gcgcatattg aacagccgtg gtggtataaa catggcaaag atatgacccc ggatgaattt 600 [1788] ggcgtggttg cggcgcgttg gctggaagaa aaaattctgg aaatcggcgc ggataaagtg 660 [1789] gcggcgtttg tgggcgaacc gattcagggt gcgggcggtg tgattgttcc gccggcaacc 720 [1790] tattggccgg aaattgaacg tatttgccgc aaatatgatg tgctgctggt tgcggatgaa 780 [1791] gtgatttgcg gctttggccg taccggcgaa tggtttggcc atcagcattt tggctttcag 840 [1792] ccggacctgt ttaccgcggc gaaaggcctg agcagcggct atctgccgat tggcgcggtg 900 [1793] tttgtgggca aacgtgttgc ggaaggtctg attgcgggcg gtgattttaa ccatggcttt 960 [1794] acctatagcg gccatccggt gtgtgcggcg gtggcgcatg cgaatgttgc ggcgctgcgt 1020 [1795] gatgaaggca ttgtgcagcg tgtgaaagat gatattggcc cgtatatgca gaaacgttgg 1080 [1796] cgtgaaacct ttagccgttt tgaacatgtg gatgatgtgc gtggcgtggg catggtgcag 1140 [1797] gcgtttaccc tggtgaaaaa caaagcgaaa cgtgaactgt ttccggattt tggcgaaatt 1200 [1798] ggcaccctgt gccgcgatat tttttttcgc aacaacctga ttatgcgtgc gtgcggcgat 1260 [1799] cacattgtgt ctgcaccgcc gctggttatg acccgtgcgg aagtggatga aatgctggcc 1320 [1800] gtggcggaac gttgcctgga agaatttgaa cagaccctga aagcgcgtgg cctggcctaa 1380 [1801] <210>43

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[1803] <212>DNA

[1804] <213>人工

[1805] <220>

[1806] <223>载体

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