抗H5N1来源的禽流感病毒核蛋白NP的单克隆抗体及其应用

摘要

本发明公开了特异性抗禽流感病毒核蛋白(NP)的单克隆抗体，所述抗体来源于保藏号为CCTCC NO：C200810、CCTCC NO：C200811或CCTCC NO：C200812的杂交瘤细胞株。所述单克隆抗体特异性和灵敏度高。本发明还公开了检测禽流感病毒的试剂盒。

权利要求

1.一种特异性抗禽流感病毒核蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体由以下的杂交瘤细胞株产生：保藏号为CCTCC-C200812的杂交瘤细胞株。

2.权利要求1所述的单克隆抗体的用途，其特征在于，用于制备检测禽流感病毒的试剂或试剂盒。

3.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述的杂交瘤细胞株是：保藏号为CCTCC-C200812的杂交瘤细胞株。

4.一种检测禽流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有权利要求1所述的单克隆抗体。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有：固相载体，所述的固相载体上包被有第一抗体，该第一抗体是权利要求1所述的单克隆抗体。

6.如权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还含有：第二抗体，该第二抗体是抗禽流感病毒核蛋白的多克隆抗体。

7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还含有：酶联免疫检测试剂。

8.体外非诊断或治疗性地检测禽流感病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)将待测样品加样于包被有第一抗体的固相载体，从而使待测样品中的禽流感病毒核蛋白与固相载体上的第一抗体结合，形成带有“核蛋白-第一抗体”二元复合物的固相载体；所述的第一抗体是权利要求1所述的单克隆抗体；

(b)将第二抗体加样于(a)获得的固相载体，从而形成带有“第二抗体-核蛋白-第一抗体”三元复合物的固相载体；所述的第二抗体是抗禽流感病毒核蛋白的多克隆抗体；且所述的第二抗体携带一标记物；

(c)检测三元复合物中的标记物，确定待检测样品中禽流感病毒核蛋白的存在与否以或存在的量，从而确定禽流感病毒的存在与否；

或者，包括以下步骤：

(a1)将待测样品包被于固相载体；

(a2)将检测抗体加样于(a1)的固相载体，从而使待测样品中的禽流感病毒核蛋白与固相载体上的检测抗体结合，形成带有“核蛋白-检测抗体”二元复合物的固相载体”；所述的检测抗体是权利要求1所述的单克隆抗体，且所述的检测抗体携带一标记物；

(a3)检测二元复合物中的标记物，确定待检测样品中禽流感病毒核蛋白的存在与否以或存在的量，从而确定禽流感病毒的存在与否。

说明书

抗H5N1来源的禽流感病毒核蛋白NP的单克隆抗体及其应

用

技术领域

[0001] 本发明属于免疫学领域，更具体的，本发明涉及抗H5N1来源的禽流感病毒核蛋白NP的单克隆抗体及其应用。

背景技术

[0002] 流感一般具有高致病性，高传染性，传播迅速，死亡率高的特点，对它的诊断主要针对禽类和人类。一般都有临床、流行病学诊断、病理学与病原学诊断、血清学诊断与其他检测技术。禽流感的床症状因感染禽的种类、年龄、并发感染情况及新感染毒株的毒力等不同而表现不一致。其病理变化因感染病毒株毒力的高低、病程的长短及种类也不尽相同，而且无特征性性状和剖检变化。所以，流感的诊断一直依赖于病原的分离鉴定和血清学诊断。这些诊断方法局限于实验室诊断，有如下缺点：(1)操作危险，容易发生污染和感染，只能在专业实验室由专业人员来操作；(2)耗时长，工序多，一般都需要10小时以上；(3)仪器繁杂，成本高，而且需要专业人员才能分析结果和数据并作出诊断报告；这对疾病的诊断和病例的筛出极为不便。尤其当大规模的A型流感爆发之际，需要对易感人群和禽类进行大规模筛查，需要快速有效的得到结果，以上方法耗时长，方法复杂又存在地域局限，很不利于疾病的大规模筛查和诊断。

[0003] 根据病毒抗原特性及其基因特性的不同，流感病毒分为甲、乙、丙三型(即A，B，C型)。甲型抗原变异性最强，感染人类和其他动物，引起中、重度疾病，侵袭所有年龄组人群，常引起世界性大流行。乙型变异性较弱，仅感染人类，一般引起轻微的疾病，主要侵袭儿童，可引起局部爆发。丙型抗原性比较稳定，仅引起婴幼儿感染和成人散发病例。 [0004] 甲型流感病毒根据H和N抗原不同，又分为许多亚型，H可分为15个亚型(H1～H15)，N有9个亚型(N1～N9)。其中仅H1N1、H2N2、H3N2主要感染人类，其它许多亚型的自然宿主是多种禽类和动物。所以本领域通常所称禽流感属于甲型流感。其中对禽类危害最大的为H5、H7和H9亚型毒株。一般情 况下，禽流感病毒不会感染鸟类和猪以外的动物。但1997年香港首次报道发生18例H5N1人禽流感感染病例，其中6例死亡，引起全球广泛关注。1997年以后，世界上又先后几次发生了禽流感病毒感染人的事件。具有高致病性的H5N1、H7N7、H9N2、等禽流感病毒，一旦发生变异而具有人与人的传播能力，会导致人间禽流感流行，预示着禽流感病毒对人类已具有很大的潜在威胁。

[0005] 禽流感病毒为球形约为100nm，RNA型，由三部分组成，其核心部分由单链负RNA和包于其外的核蛋白(NP)组成。其病毒RNA片段5长约115Kb，编码病毒核衣壳蛋白(NP)，它是一种单体磷酸化的多肽，是构成病毒核衣壳的主要蛋白成分，与基因组RNA一起构成核酸核蛋白体(RNP)，然后与RNA聚合酶共同构成病毒的核心成分。NP蛋白具有型特异性，是流感病毒划分A、B、C型的主要依据，同时，在病毒基因组的转录和复制以及决定宿主特异性方面都有重要作用。由于NP是细胞毒性T淋巴细胞识别的主要抗原，所以人们一直期望它所诱导的免疫保护性能给动物提供保护，然而NP的单克隆抗体却不能给动物提供被动保护，并且用体外合成的NP来免疫动物时，也只能产生较微弱的保护能力。AIV核蛋白(NP)为构成病毒核衣壳的主要蛋白成分，其结构高度保守、变异率很低、具有群和型的特异性，是流感病毒型分类和诊断的基础，也是禽流感病毒(A型流感)诊断的重要依据。 [0006] 由于禽流感(A型)的爆发会构成对人类健康的巨大威胁，也会引起养殖业和农业的巨大损失，因此一旦出现流感感染事件就会在社会上引起人们的巨大恐慌。但流感当中相当一部分属于B型和C型，真正的A型流感只占少数。因此为了更加准确及时的对流感进行诊断，对维护人类健康和社会稳定意义重大。目前市场上仅有少数产品能特异性的诊断区分A，B，C型，其质量和稳定性均不太可靠。对于流感这种爆发率高，死亡率高的疾病，准确有效的诊断产品有巨大的市场需求。

[0007] 因此，本领域有必要通过筛选获得识别效果良好的禽流感病毒NP蛋白特异性单克隆抗体，以更准确地鉴定禽流感病毒，为临床诊断、治疗争取时间。

发明内容

[0008] 本发明的目的在于提供一类特异性抗禽流感病毒核蛋白(NP)的单克隆抗体。 [0009] 本发明的另一目的在于提供特异性抗禽流感病毒的检测试剂盒。

[0010] 在本发明的第一方面，提供一种特异性抗禽流感病毒核蛋白(NP)的单克隆抗体，所述的单克隆抗体由选自下组的杂交瘤细胞株产生：

[0011] 保藏号为CCTCC-C200812的杂交瘤细胞株(S-200-23)；

[0012] 保藏号为CCTCC-C200811的杂交瘤细胞株(S-171-9)；或

[0013] 保藏号为CCTCC-C200810的杂交瘤细胞株(S-290-3)。

[0014] 在另一优选例中，保藏号为CCTCC-C200812的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的重链可变区基因。

[0015] 在另一优选例中，保藏号为CCTCC-C200812的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的重链前导序列。

[0016] 在本发明的第二方面，提供所述的单克隆抗体的用途，用于制备检测禽流感病毒的试剂或试剂盒。

[0017] 在本发明的第三方面，提供一种杂交瘤细胞株，所述的杂交瘤细胞株选自： [0018] 保藏号为CCTCC-C200812的杂交瘤细胞株；

[0019] 保藏号为CCTCC-C200811的杂交瘤细胞株；或

[0020] 保藏号为CCTCC-C200810的杂交瘤细胞株。

[0021] 在本发明的第四方面，提供一种检测禽流感病毒的试剂盒，所述的试剂盒含有所述的一个或多个单克隆抗体。

[0022] 在另一优选例中，所述的试剂盒含有：

[0023] 固相载体，所述的固相载体上包被有至少一种第一抗体，该第一抗体是本发明所述的单克隆抗体。

[0024] 在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有：

[0025] 第二抗体，该第二抗体是抗禽流感病毒核蛋白的多克隆抗体。

[0026] 在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有：

[0027] 酶联免疫检测试剂，包括但不限于：标记物(如酶)，标记物对应的底物，显色剂，洗涤液或终止液。

[0028] 在本发明的第五方面，提供体外(非诊断或治疗性地)检测禽流感病毒的方 法，包括以下步骤：

[0029] (a)将待测样品加样于包被有第一抗体的固相载体，从而使待测样品中的禽流感病毒核蛋白与固相载体上的第一抗体结合，形成带有“核蛋白-第一抗体”二元复合物的固相载体；所述的第一抗体选自本发明所述的单克隆抗体(或抗禽流感病毒核蛋白的多克隆抗体)；

[0030] (b)将第二抗体加样于(a)获得的固相载体，从而形成带有“第二抗体-核蛋白-第一抗体”三元复合物的固相载体；所述的第二抗体是抗禽流感病毒核蛋白的多克隆抗体(或本发明所述的单克隆抗体)；且所述的第二抗体携带一标记物；

[0031] (c)检测三元复合物中的标记物，确定待检测样品中禽流感病毒核蛋白的存在与否以或存在的量，从而确定禽流感病毒的存在与否；

[0032] 或者，包括以下步骤：

[0033] (a1)将待测样品包被于固相载体；

[0034] (a2)将检测抗体加样于(a1)的固相载体，从而使待测样品中的禽流感病毒核蛋白与固相载体上的检测抗体结合，形成带有“核蛋白-检测抗体”二元复合物的固相载体”；所述的检测抗体选自本发明所述的单克隆抗体，且所述的检测抗体携带一标记物； [0035] (a3)检测二元复合物中的标记物，确定待检测样品中禽流感病毒核蛋白的存在与否以或存在的量，从而确定禽流感病毒的存在与否。

[0036] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

[0037] 图1显示了NP蛋白原核表达的SDS-PAGE电泳分析。各泳道样品依次为： [0038] 1：低分子量蛋白marker；

[0039] 2：PGEX-4t-1-NP转入到大肠杆菌后，IPTG诱导前表达情况(菌体上样)； [0040] 3和4：PGEX-4t-1-NP转入到大肠杆菌后，IPTG(0.5mM)诱导后表达情况(菌体上样)；

[0041] 5和6：Thrombin酶切后纯化得到的原核表达NP蛋白。

[0042] 图2显示了NP蛋白原核表达诱导前，超声破细胞前后的SDS-PAGE电泳分析。各泳道样品依次为：

[0043] 1：低分子量蛋白marker；

[0044] 2：PGEX-4t-1-NP转入到大肠杆菌后，IPTG诱导前表达情况(菌体上样)； [0045] 3：IPTG诱导后表达情况(菌体上样)；

[0046] 4：IPTG诱导后菌体超声破碎细胞上清中表达情况(菌体超声破碎后上清上样)； [0047] 5：IPTG诱导后菌体超声破碎细胞沉淀中表达情况(菌体超声破碎后沉淀上样)。 [0048] 图3显示了免疫印迹法检测NP鼠多抗识别灭活AIV中的NP蛋白的能力。 [0049] A为NP鼠多抗对原核表达的NP-GST重组蛋白的识别情况，其中“AIV灭活”是NP鼠多抗对灭活AIV的识别情况。

[0050] B为NP鼠多抗对原核表达的NP重组蛋白的识别情况，其中“AIV灭活”是NP鼠多抗对灭活AIV的识别情况。

[0051] 图4A-B显示了间接ELISA法检测S-171-9、S-200-23、S-220-10、S-290-3的抗体株分泌的抗体对抗原的识别情况。

[0052] 图4C显示了夹心ELISA法检测S-96-10、S-171-9、S-176-8、S-200-23、S-220-10、S-290-3的抗体株分泌的抗体对抗原的识别情况。

[0053] 图5A显示了夹心ELISA法检测S-290-3抗体株分泌的单抗与酶标多抗夹心检测抗原的结果。

[0054] 图5B显示了夹心ELISA法检测S-171-9抗体株分泌的单抗与酶标多抗夹心检测抗原的结果。

[0055] 图5C显示了夹心ELISA法检测S-200-23抗体株分泌的单抗与酶标多抗夹心检测抗原的结果。

[0056] 图6显示了利用多抗包被，加抗原后再用本发明的单抗作为检测抗体的夹心法ELISA法检测结果。

[0057] 具体实施方式

[0058] 本发明人经过广泛的研究，找到一类效果优异的特异性抗禽流感核蛋白(NP)的单克隆抗体。所述的单克隆抗体对于抗禽流感病毒核蛋白的检测范围宽。并且，其可良好地识别复杂体系中的NP抗原，不与其它蛋白发生交叉反应，特异性和灵敏度均非常高。 [0059] 禽流感核蛋白NP氨基酸序列长，抗原决定簇很多被包在蛋白结构的内部，因此难以找到一种特异性高的单克隆抗体。NP的很多抗体识别表位为空间表位，很多表位是在序列中间，没有在蛋白序列N端或者C端。本发明的抗原在制备过程中因为是变性纯化的，所以识别该变性蛋白的抗体是识别NP空间结构上的线性表位区而非空间表位区。目前，尽管本领域已经开发出一些抗NP单克隆抗体，然而当将这些抗体用于实际检测时，仍然遭遇到与天然NP蛋白结合特性差的问题，这是由于待测样品中NP蛋白的抗原决定簇被包在蛋白结构内部，无法接触到抗体造成的。当用这种单克隆抗体检测样品时，需要将样品进行处理(如加热变性)，使被包埋的抗原决定簇暴露出来，这一方面造成临床检测程序的复杂化，使得检测时间过长；另一方面，由于加热变性会导致待测样品中其它各种蛋白的变性，从而大大提高非特异性结合的发生率，造成干扰，降低检测的准确性。

[0060] 针对上述技术难题，本发明人制备了许多种针对NP蛋白的单克隆抗体，经过大量的、反复的研究试验，最终找到了本发明的抗NP单克隆抗体(分别由杂交瘤细胞株S-200-23，S-290-3，S-171-9产生)，所述单克隆抗体对于NP蛋白具有很高的特异性，不结合于NP以外的其它蛋白。并且，当用于检测时，无需对待测样品进行过多的处理即可方便地获得精确的检测结果。

[0061] 为了获得较好的效果，本发明人采用NP-GST融合蛋白来免疫动物，并用纯化的NP蛋白(不含GST蛋白)来筛选单克隆抗体。

[0062] 并且，以所述的单克隆抗体为基础，可制备方便、快速且准确地检测禽流感病毒的试剂盒。

[0063] 禽流感病毒核蛋白的原核表达

[0064] 表达禽流感病毒核蛋白NP的方法是本领域已知的，通常包括：

[0065] (a)PCR扩增获得NP蛋白的编码序列；

[0066] (b)将(a)所述的核蛋白的编码序列插入表达载体的多克隆位点中，获得插入了核蛋白编码序列的表达载体；

[0067] (c)使(b)获得的插入了核蛋白编码序列的表达载体转入宿主细胞，获得转化的宿主细胞；

[0068] (d)培养转化的宿主细胞，从而表达出核蛋白；

[0069] (e)分离获得禽流感病毒核蛋白NP。

[0070] 作为本发明的一种优选方式，所述的表达载体为PGEX-4t-1载体，其中自带有GST标签。

[0071] 将表达载体引入到基因工程化的宿主细胞中，即可表达所述的蛋白。在本发明的优选方式中，采用的宿主细胞为大肠杆菌Rossetta。

[0072] 本发明人采用原核表达禽流感病毒核蛋白NP的方法，高效的在大肠杆菌中表达并纯化了NP，表达量高，特异性强，易于纯化并具有完整的空间构象。基于所述的NP蛋白研制了抗NP蛋白的单克隆抗体以及多克隆抗体。

[0073] 单克隆抗体

[0074] 本领域技术人员均了解，一种抗原可能含有多个抗原表位(抗原决定簇)，因此，针对同一个抗原可以获得不止一个抗体，这些抗体对抗原的结合特性(如特异性等)均可能是不同的。因此，针对同一个抗原，本领域人员需要进行大量的反复比较、筛选和鉴定，才能找到适合于特异性结合的单抗。本发明人做了大量的工作，找到了本发明的抗NP单克隆抗体(分别由杂交瘤细胞株S-200-23，S-290-3，S-171-9产生)，其具有高特异性结合NP蛋白的能力，可见其结合的是NP蛋白(或含该蛋白的复合物)空间结构上被暴露于表面的抗原决定簇(表位)。且与NP蛋白以外的其它蛋白没有交叉反应。

[0075] 本发明的抗体是对禽流感病毒NP具有特异性的单克隆抗体。这里，“特异性”是指所述抗体能结合于NP蛋白或其片段；更特别地，指那些能与NP蛋白或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。

[0076] 本发明的单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等，Eur.J.Immunol.6：292，1976；
Hammerling 等，In Monoclonal Antibodies and T CellHybridomas，Elsevier，N.Y.，
1981)。本发明的单克隆抗体的一种杂交瘤的制 备方法是：(1)利用抗核蛋白NP免疫小鼠；
(2)分离经免疫的小鼠的脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞株融合；(3)加入小鼠腹腔饲养细胞与融合细胞共培养，并筛选阳性株；(4)有限稀释法克隆化筛选，从而获得单克隆抗体细胞株，从所述细胞株中筛选可生产所需单克隆抗体的细胞株。

[0077] 本发明的单克隆抗体还可以利用NP基因产物或片段或功能区，通过免疫技术获得。此外，还可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。本领域人员均了解，在得到了所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系或通过测序等手段得知所述的单克隆抗体后，本领域人员可以方便地获得所述的抗体。

[0078] 作为本发明的一种实施方式，所述的单克隆抗体可以由下列制备方法所制备，所述方法包括步骤：(1)提供佐剂预处理的小鼠；(2)在小鼠腹腔内接种所述的杂交瘤细胞并分泌单克隆抗体；(3)抽取腹水，分离获得所述的单克隆抗体。作为一种方式，从腹水中分离单克隆抗体的方法是：收集腹水，用经硫酸铵、辛酸沉淀，接着用Protein G预装层析柱纯化，获得高纯度的抗NP单克隆抗体。

[0079] 此外，也可按照常规的动物细胞培养方法，体外培养扩增所述的杂交瘤细胞，从而使之分泌所述的单克隆抗体。

[0080] 在获得了本发明的抗NP单克隆抗体后，本领域人员可通过多种途径来灵敏地检测样品中NP蛋白及其浓度，采用的技术可以是免疫学领域中常用的技术。

[0081] 检测试剂盒

[0082] 本发明提供了一种用于检测样品中是否存在禽流感病毒的检测试剂盒，该试剂盒中含有一种或多种本发明的抗NP单克隆抗体(分别由杂交瘤细胞株S-200-23，S-290-3，S-171-9产生)。

[0083] 在获得了本发明提供的抗NP单克隆抗体后，可以方便地制备出用于特异性检测禽流感病毒的检测试剂盒。所述试剂盒中除了含有本发明的抗NP单克隆抗体以外，还可以包含其它检测试剂或辅剂，如显色剂、标记物、二抗、抗抗体、增敏剂等。本领域人员应理解，各种变化形式的检测试剂盒均是包含在本发明中的，只要其中利用了本发明的抗NP单克隆抗体作为与NP特异性结合的试剂。

[0084] 作为本发明的一种优选方式，本发明人根据双抗夹心法的原理，制备了一 种用于检测NP蛋白水平的试剂盒。双抗夹心法常规的做法是将包被抗体固定于载体，然后包被抗体与抗原反应，洗涤后再与检测抗体反应(所述的检测抗体携带可检测信号，或可与携带可检测信号的物质结合)，最后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。双抗夹心法特别适用于具有两个或两个以上表位的抗原的检测。

[0085] 本发明人发现，采用本发明的抗NP单克隆抗体与另一种抗体(优选的为一种抗NP多克隆抗体)来将目标抗原NP吸附及定位，其定位和放大效果良好，具有良好的特异性和精密度。

[0086] 作为另一种可选择的检测方式，采用间接ELISA法，将待测的抗原包被于固相载体上，利用本发明的单克隆抗体检测NP。

[0087] 所述的包被抗体被包被在固相载体上。本发明对所采用的固相载体没有特别的限制，只要其能够与本发明的单克隆抗体或多克隆抗体相偶联(连接)即可。例如，所述的固相载体选自：微量滴定板(如96孔板)、或微球等。所述的检测抗体可以是本发明的单克隆抗体或多克隆抗体。可将本发明的单克隆抗体固定在固相载体上作为包被抗体，用抗NP蛋白的多克隆抗体来作为检测抗体；此外，也可采用抗NP蛋白的多克隆抗体作为包被抗体，采用本发明的单克隆抗体作为检测抗体。

[0088] 所述的多克隆抗体可通过常规的方法来制备，例如，可通过将所述的NP蛋白导入动物中来获得，例如将NP蛋白或灭活的病毒免疫动物。免疫方法可使用动物皮下注射。所述动物可选自兔、羊、牛等。例如将NP蛋白0.1mg/次免疫兔，免疫周期1.5-4个月(更优选的，为2个月左右)，优选间隔2-4周重复免疫；然后可从兔静脉血中收获抗血清并纯化，获得抗NP多克隆抗体。

[0089] 如本文所用，所述的“标记物”是指用于确定待检测样品中NP的存在与否以及存在的量的标志物。在确定了本发明的试剂盒所采用的包被抗体和/或检测抗体后，可以采用本领域常规用于与检测抗体结合来进行检测的各种标记物。本发明对所采用的标记物没有特别的限制，只要是能够与所述的检测抗体结合，且在适当处理后能够准确地指示待检测样品中NP蛋白的存在与否以及存在量的标记物均是可用的。所述的标记物可直接被设置于检测抗体上；或者，所述的标记物也可被设置于特异性抗检测抗体的抗抗体上，本领域人员可根据所采用的抗体的种类和特性，选择适宜的标记物。例如，所述的标记物可以选自： 辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酯酶(AP)、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。

[0090] 当采用如上所示的一些酶标记物时，还需要采用一些与相应的酶结合的底物，从而可通过显色等方式来报导标记物的存在情况或者存在量。如本文所用，所述的“与标记物相对应的底物”是指可被标记物所催化显色，用于显示检测抗体与NP发生结合的识别信号。所述的底物例如：用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS；用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate，p-NPP)；等等。本领域人员可根据所采用的标记物的种类和特性，选择适宜的底物。

[0091] 为了获得定量结果，可以在检测过程中设置含已知浓度的多个NP蛋白的标准品。对于标准品的设置方法可采用常规的方法。

[0092] 利用所述的标准品，标准曲线如下设置：以标准品的OD值检测结果为纵坐标(Y轴)，标准品浓度为横坐标(X轴)绘制成用于定量标准曲线。从而，根据待测样品检测获得的OD值，利用标准曲线可计算出待测样品中NP蛋白的浓度。

[0093] 为了消除假阳性和假阴性，也可在检测过程中设置质控(对照)。

[0094] 此外，为了使本发明的试剂盒在检测时更方便，所述的试剂盒中优选的还包含其它一些辅助试剂，所述的辅助试剂是ELISA试剂盒中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的。所述的试剂例如(但不限于)：显色剂、洗涤液、终止液、增敏稀释液。

[0095] 此外，在所述试剂盒中还可包含使用说明书，用于说明其中装载的试剂的使用方法。

[0096] 通过酶联免疫吸附(ELISA)实验证实，本发明的单克隆抗体和多克隆抗体能有效的识别灭活的禽流感病毒(A型流感病毒)。由此制备得到了能用于A型流感病毒诊断的ELISA试剂盒。其特异性和灵敏度均达到良好要求。

[0097] 本发明人采用这种方法研制的NP单克隆抗体和ELISA试剂盒能有效的用于A型流感病毒的检测，特异性高，灵敏度高，耗时短，成本低，工序简单，能快速灵敏有效的对A型流感病毒进行诊断，将其与B，C型流感病毒进行区分。

[0098] 检测禽流感病毒的方法

[0099] 在获得了本发明提供的抗NP单克隆抗体和/或试剂盒后，可以利用多种免疫学相关方法来检测样品中NP蛋白或其含量，从而得知待测样品的供体是否感染禽流感，这些方法均被包含在本发明中。

[0100] 作为一种优选方式，本发明提供一种体外(非诊断或治疗性地)检测禽流感病毒的方法，包括以下步骤：

[0101] (a)将待测样品加样于包被有第一抗体的固相载体，从而使待测样品中的禽流感病毒NP与固相载体上的第一抗体结合，形成带有“NP-第一抗体”二元复合物的固相载体；所述的第一抗体是本发明所述的单克隆抗体(或抗禽流感病毒核蛋白的多克隆抗体)； [0102] (b)将第二抗体加样于(a)获得的固相载体，从而形成带有“第二抗体-NP-第一抗体”三元复合物的固相载体；所述的第二抗体是抗NP的多克隆抗体(或本发明所述的单克隆抗体)且携带一标记物；

[0103] (c)检测三元复合物中的标记物，从而确定待检测样品中禽流感病毒NP的存在与否以或存在的量，从而确定禽流感病毒的存在与否。

[0104] 作为另一种可选择的检测方式，采用间接ELISA法，包括以下步骤： [0105] (a1)将待测样品包被于固相载体；

[0106] (a2)将检测抗体加样于(a1)的固相载体，从而使待测样品中的禽流感病毒NP与固相载体上的检测抗体结合，形成带有“NP-检测抗体”二元复合物的固相载体”；所述的检测抗体是本发明所述的单克隆抗体，且所述的检测抗体携带一标记物；

[0107] (a3)检测二元复合物中的标记物，确定待检测样品中禽流感病毒NP的存在与否以或存在的量，从而确定禽流感病毒的存在与否。

[0108] 此外，也可将抗NP的多克隆抗体包被于固相载体，将本发明所述的单克隆抗体作为检测抗体来检测样品中NP蛋白或其含量。

[0109] 按照上述方法，只要设置已知浓度的抗原对照，制作浓度标准曲线，通过比照浓度标准曲线就可以得出待测样品中的NP含量。

[0110] 作为本发明的一种优选方式，定量检测NP蛋白的方法具体如下：

[0111] (i)抗原抗体反应：将本发明的抗NP单克隆抗体包被在多孔板上，之后在多孔板的不同微孔内分别加入不同浓度的标准品、质控品(可选)，或待测血清样品； [0112] (ii)酶联反应：将第二抗体(其上设置有标记物或可与携带标记物的抗体结合)溶液加入各孔，振荡、孵育、洗涤；

[0113] (iii)显色反应：每孔加入对应于标记物的底物、显色剂，孵育，每孔加入反应终止液，结束反应；

[0114] (iv)酶标仪测定OD值；

[0115] (v)结果计算：

[0116] A)制作标准曲线：以标准品浓度为横坐标，标准品测定OD值为纵坐标，作出标准曲线；

[0117] B)评判质控品浓度(可选)：根据质控品的OD值，从标准曲线上读出相应的浓度值；质控品测定浓度值处于给定范围时，该次测定有效；

[0118] C)计算待测样品浓度：当标准曲线和质控品(可选)被判定有效时，根据待测样本的OD值从标准曲线计算出待测血清样品的NP蛋白浓度。

[0119] 作为本发明的另一种方式，定量检测NP蛋白的方法具体如下：

[0120] (1)分别以不同浓度NP标准品和待测样品包被固相载体；

[0121] (2)在经包被的固相载体上加入本发明的单克隆抗体，该单克隆抗体上连接有标记物或可与标记物相连接(还包括加入标记物使之连接于该单克隆抗体)；

[0122] (3)加入对应于标记物的底物、显色；

[0123] (4)结果计算(同前述)。

[0124] 本发明的主要优点在于：

[0125] (1)提供一类新的针对禽流感病毒NP的特异性单克隆抗体，是结合天然NP蛋白空间结构上外露表位的单克隆抗体。

[0126] (2)所述的单克隆抗体具有敏感、特异、制备成本低的特点，当用于检测时，无需对待测样品进行过多的处理即可方便地检测出样品中NP的含量，且与样品中的其它蛋白无交叉反应。

[0127] (3)提供一种基于所述单克隆抗体的试剂盒，所述的试剂盒灵敏度和准确性非常高。且所述的试剂盒在操作时不需要加热等处理步骤，可以准确快速地 测定。 [0128] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

[0129] 实施例1：NP蛋白的原核表达

[0130] 本发明人获得了含有目的基因片段的重组pGEM-T-vector载体(获自上海英沐生物科技有限公司)，以该载体为模板，以

[0131] CGCGGATCCATGGCGTCTCAAGGC(SEQ ID NO：3)；和

[0132] CCGCTCGAGTTTAATTGTCATACTC(SEQ ID NO：4)

[0133] 为引物，通过PCR扩增得到编码NP蛋白的目的基因。获得的基因经测序验证不含突变。

[0134] 通过两端添加BamH I和Xho I酶切位点的引物，将上述克隆的基因连接到PGEX-4t-1载体(购自Novagen公司)，获得PGEX-4t-1-NP重组质粒。再将该重组质粒转化到Rossetta表达型大肠杆菌中，在0.5mM IPTG条件下诱导，表达的蛋白主要存在于上清中。

[0135] 表达在上清中的NP蛋白通过载体自带的GST标签纯化，纯化介质采用法玛西亚公司产品Glutathione Sepharose 4B。纯化的蛋白浓度2mg/ml，共6ml，12mg。 [0136] 将得到的NP-GST重组蛋白，通过重组蛋白上特殊的thrombin酶切位点，用thrombin酶(sigma公司产品)将NP与GST蛋白切开，通过GlutathioneSepharose 4B珠子将GST与NP蛋白分离，得到原核表达的NP蛋白，浓度1.5mg/ml，共7ml，10mg左右。蛋白大小如下：

[0137] NP蛋白大小：55KD；

[0138] NP-GST重组蛋白：81-83KD。

[0139] NP蛋白诱导表达前后以及酶切后的表达情况见图1。

[0140] NP蛋白原核表达诱导前、超声破细胞前后的表达情况见图2。

[0141] 实施例2：动物免疫

[0142] 用实施例1中纯化的NP-GST融合蛋白免疫小鼠。Balb/c小鼠免疫剂量：0.1mg每只每次。肌肉多点注射。免疫程序：0，3，6周进行三次免疫。融合前3天取0.1mg蛋白腹腔注射，做回忆刺激。取小鼠抗血清，可获得鼠抗NP多抗。

[0143] 用实施例1中纯化的NP蛋白免疫雄性新西兰白兔。剂量：1mg每只每次。皮下体内多点注射。免疫程序：0，3，6周3次免疫。取抗血清，获得兔抗NP多抗。 [0144] 实施例3：灭活禽流感病毒(H5N1毒株)免疫印迹检测

[0145] 灭活禽流感(AIV)H5N1毒株纯化后病毒蛋白由武汉病毒所提供。用鼠抗NP多抗对其进行免疫印迹检测。实验流程如下：

[0146] 1.SDS-PAGE

[0147] 样品：原核表达的NP及NP-GST重组蛋白；灭活禽流感病毒(H5N1毒株)、原核重组表达的禽流感HA蛋白。

[0148] 上样量：5μl；

[0149] 上层胶：3.5％，下层胶：12％，上层胶100V 30分钟，下层胶150V 1小时。 [0150] 2.转膜

[0151] 电流：200mA，90分钟。

[0152] 3.封闭

[0153] 3％BSA封闭2小时。

[0154] 4.杂交

[0155] 一抗：均1∶5000稀释在相应的封闭液中，4℃杂交过夜。

[0156] 抗抗体：羊抗鼠HRP(购自Sigma公司)，1∶1000稀释。均杂交1小时。 [0157] 5.显色

[0158] 鼠多抗Western印迹验证实验。

[0159] 阴性对照(NC)：HA蛋白。

[0160] 结果分析如图3所示，NP鼠多抗能特异性识别灭活AIV中的NP蛋白，对HA不发生交叉反应。即可开始融合制备单抗。

[0161] 实施例4：杂交瘤细胞株的构建及单克隆抗体的制备

[0162] 小鼠回忆刺激后3天做融合。取免疫后小鼠的脾脏细胞和鼠骨髓瘤细胞SP2/0采用聚乙二醇(PEG)常规融合法做融合。

[0163] 融合后加HAT选择性培养基，筛选采用ELISA法，用于筛选的抗原为实施例1中纯化的NP蛋白。经过3次有限稀释法克隆化筛选，从诸多单克隆抗体株中选择得到6株单抗，包括S-96-10、S-220-10、S-171-9、S-200-23、S-290-3、S-176-8。然后通过以下ELISA进行进一步筛选。

[0164] 1.间接ELISA法

[0165] 通过间接ELISA法，对克隆号为S-171-9、S-200-23、S-220-10、S-290-3的抗体株分泌的抗体进行识别效果验证。

[0166] 包被：用灭活禽流感病毒(H5N1毒株)包被96孔板，浓度10μg/ml。阳性对照(PC)：用原核表达的重组NP蛋白包被96孔板，浓度5μg/ml。常规方法洗板后，用5％BSA封闭，洗板。

[0167] 在包被了抗原的96孔板各孔内加一抗，分别是S-171-9、S-200-23、S-220-10、S-290-3，按照倍比稀释浓度梯度为：1∶200，1∶400，1∶800，，1∶102400。常规方法洗板。

[0168] 经过前述处理的96孔板各孔中再加羊抗鼠抗抗体1∶5000，常规方法洗涤，显色。 [0169] 结果发现，S-220-10分泌的抗体对灭活的禽流感病毒中的NP蛋白不能识别，其它3株抗体的识别情况良好，见图4A-B。

[0170] 2.夹心法

[0171] 包被抗体：分别是前述获得的6株单抗，克隆号分别为S-96-10、S-171-9、S-176-8、S-200-23、S-220-10、S-290-3；及多抗。

[0172] 抗原：灭活禽流感病毒蛋白；阴性对照(NC)：检测原核HA蛋白。

[0173] 检测抗体：酶标兔抗NP多抗；对照：酶标抗H5N2鼠多抗。

[0174] 其它方面操作方法同间接ELISA法。

[0175] 结果见图4C，可见S-96-10、S-220-10、S-176-8作为包被抗体，识别效果不理想；而采用S-171-9、S-200-23、S-171-9的识别效果较为理想。

[0176] 综上可见，除S-220-10分泌的抗体不能识别天然灭活病毒中的蛋白外，其它5株分泌的抗体均可以识别。在进行单抗包被+多抗酶标检测的实验中发现S-171-9、S-200-23、S-290-3三株抗体株分泌的抗体可以成功地夹心检测，该三株抗体株分泌的单克隆抗体可良好地识别NP蛋白，特异性高。

[0177] 实施例5：特异性识别效果验证

[0178] 采用夹心法ELISA，步骤如下：

[0179] (1)包被

[0180] 将单克隆抗体S-171-9、S-200-23和S-290-3分别用包被液按1∶5000稀释(5μg/ml)，加样于96孔板的孔中，每孔加50μl，4℃包被过夜。

[0181] (2)封闭

[0182] 封闭液：3％BSA。

[0183] 每孔100μl，37℃封闭2小时。

[0184] (3)洗涤

[0185] 用水冲洗每孔10次，加洗液浸泡3分钟，再弃去洗液，重复1次后拍干96孔板。 [0186] (4)加样本

[0187] 在各孔中加入灭活禽流感病毒(H5N1毒株)，用封闭液(5％BSA)稀释，浓度分别为：10μg/ml，5μg/ml，2.5μg/ml，1μg/ml，500ng/ml，100ng/ml，50ng/ml，10ng/ml，0。 [0188] 阴性对照：原核表达的禽流感HA蛋白，用封闭液(5％BSA)稀释，浓度分别为：10μg/ml，5μg/ml，2.5μg/ml，1μg/ml，500ng/ml，100ng/ml，50ng/ml，10ng/ml，0。 [0189] 阳性对照：原核表达的NP蛋白。

[0190] 每孔50μl，37℃孵育2小时。

[0191] (5)洗涤

[0192] 用水冲洗每孔10次，加洗液浸泡3分钟，再弃去洗液，重复1次后拍干96孔板。 [0193] (6)加抗抗体杂交

[0194] 常规方法用HRP标记前述制备的兔多抗，获得标记的兔多抗。

[0195] HRP酶标前述抗禽流感病毒NP兔抗血清，将标记的兔多抗1∶1000稀释于封闭液中，每孔加50μl，37℃孵育2小时。

[0196] (7)洗涤

[0197] 用水冲洗每孔10次，加洗液浸泡3分钟，再弃去洗液，重复1次后拍干96孔板。 [0198] (8)显色

[0199] 加底物显色5-8分钟，OD450读数。

[0200] 结果见图5。实验结果表明，本发明人制备的单克隆抗体和多克隆抗体能有效识别禽流感病毒中的NP蛋白，能通过夹心ELISA法识别禽流感病毒中的NP蛋白，而对禽流感病毒中的其他蛋白不识别，特异性高，快速灵敏，工序简单。S-171-9、S-200-23检测下限约为5ug/ml，S-290-3的检测下限约为2.5μg/ml。

[0201] 实施例6：本发明的单克隆抗体作为检测抗体的识别验证

[0202] 采用夹心法ELISA法。用兔抗NP多抗进行包被，与抗原反应后，再加本发明的单抗，作为检测抗体进行检测。

[0203] 1.包被：

[0204] 将纯化好的兔多抗用包被液按1∶2000稀释(5μg/ml)，加入到96孔板中，每孔加50μl，4℃包被过夜。

[0205] 2.封闭

[0206] 封闭液：3％BSA；

[0207] 每孔100μl，37℃2小时。

[0208] 3.洗涤

[0209] 用水冲洗每孔10次，加洗液浸泡3分钟，再弃去洗液，重复一次后拍干96孔板。 [0210] 4.加抗原

[0211] 加灭活禽流感病毒(H5N1毒株)，用封闭液稀释，浓度为：5μg/ml； [0212] 阴性对照(NC)：原核表达的禽流感HA蛋白，用封闭液稀释，浓度为：5μg/ml； [0213] 阳性对照(PC)：原核表达的NP蛋白；

[0214] 每孔各加入50μl，37℃2小时。

[0215] 5.洗涤

[0216] 用水冲洗每孔10次，加洗液浸泡3分钟，再弃去洗液，重复一次后拍干96孔板。 [0217] 6.加检测抗体杂交

[0218] 加入单抗S-171-9、S-200-23和S-290-3，用封闭液按1∶1000稀释，每孔加50μl，37℃2小时。

[0219] 7.洗涤

[0220] 用水冲洗每孔10次，加洗液浸泡3分钟，再弃去洗液，重复一次后拍干96孔板。 [0221] 8.加酶标记抗抗体杂交

[0222] 加入羊抗鼠HRP，1∶1000稀释。均37℃杂交1小时。洗板。

[0223] 9.显色

[0224] 加底物显色5-8分钟，OD450读数。

[0225] 结果见图6，可见本发明的单克隆抗体作为检测抗体也可良好地识别灭活禽流感病毒中的NP蛋白。

[0226] 实施例7：本发明的单克隆抗体的测序

[0227] 对本发明的单克隆抗体进行测序鉴定，其中S-200-23抗体株分泌的单克隆抗体的重链基因如下：

[0228] 重链前导序列(信号肽核苷酸序列)(SEQ ID NO：1)：

[0229] ATGGGATGGAGCTATATCATCCTCTTTTTGGTAGCAACAGCAACAGGTGTCCACTCC

[0230] 重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO：2；下划线依次是CDR1，CDR2和CDR3)： [0231] CAGGTCCAACTGCAGCAGTCTGGGACTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGT [0232] TGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTATATGTACTGGGTGAAACA [0233] GAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTTGATTGGAGAGATTGATCCTAGCAATGGTGGTA

[0234] CTAACTTCAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCA

[0235] GCACATCATACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGT [0236] TCAAGATCCCGCTTCTATGATGGTTACCGGGGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAG

[0237] GGACCACGGTCACCGTCTCCTCA

[0238] 实施例8：试剂盒

[0239] 将S-200-23抗体以10μg/ml的浓度(溶于碳酸盐包被液中)包被酶标板，4℃过夜。用ELISA洗涤液洗板；用1％BSA于37℃封闭2h。用ELISA洗涤液洗板。

[0240] 将上述处理的酶标板晾干，装于合适的包装中，同时还在其中装入前述制备的兔抗NP多抗，以及抗兔酶标抗抗体，从而获得所述的试剂盒。

[0241] 生物材料保藏

[0242] 本发明制备的杂交瘤细胞保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉)，分别为：

[0243] 杂交瘤细胞株S-290-3：保藏号CCTCC NO：C200810；保藏日2008年3月27日； [0244] 杂交瘤细胞株S-171-9：保藏号CCTCC NO：C200811；保藏日2008年3月27 日； [0245] 杂交瘤细胞株S-200-23：保藏号CCTCC NO：C200812；保藏日2008年3月27日。 [0246] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

[0247] 序列表

[0248] <110>中国科学院上海生命科学研究院

[0249] <120>抗H5N1来源的禽流感病毒核蛋白NP的单克隆抗体及其应用

[0250] <130>082684

[0251] <160>4

[0252] <170>PatentIn version 3.3

[0253] <210>1

[0254] <211>57

[0255] <212>DNA

[0256] <213>小鼠(Mus musculus)

[0257] <400>1

[0258] atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag caacaggtgt ccactcc 57 [0259] <210>2

[0260] <211>366

[0261] <212>DNA

[0262] <213>小鼠(Mus musculus)

[0263] <400>2

[0264] caggtccaac tgcagcagtc tgggactgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagttg 60 [0265] tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactata tgtactgggt gaaacagagg 120 [0266] cctggacaag gccttgagtt gattggagag attgatccta gcaatggtgg tactaacttc 180 [0267] aatgagaagt tcaagagcaa ggccacactg actgtagaca aatcctccag cacatcatac 240 [0268] atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgttc aagatcccgc 300 [0269] ttctatgatg gttaccgggg gtacttcgat gtctggggcg cagggaccac ggtcaccgtc 360 [0270] tcctca 366 [0271] <210>3

[0272] <211>24

[0273] <212>DNA

[0274] <213>人工序列

[0275] <220>

[0276] <221>misc_feature

[0277] <223>引物

[0278] <400>3

[0279] cgcggatcca tggcgtctca aggc 24 [0280] <210>4

[0281] <211>25

[0282] <212>DNA

[0283] <213>人工序列

[0284] <220>

[0285] <221>misc_feature

[0286] <223>引物

[0287] <400>4

[0288] ccgctcgagt ttaattgtca tactc 25