一种野生型EGFR高表达的重组HEK293细胞

摘要

本发明公开了一种基于外源重组质粒pcDNA3.1(+)-EGFR构建的稳定高表达野生型EGFR的重组HEK293-EGFR细胞，EGFR表达较转染前高4-5倍。用EGFR的促进剂EGF及酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼对转染的HEK293细胞诱导作用，检测细胞内磷酸化EGFR及ERK表达量的变化，表明转染后的EGFR具有活性功能；药物吉非替尼对转染的EGFR也具有抑制作用，以EGFR为靶点的药物筛选，可提高筛选的特异性及灵敏性；并可应用于EGFR通路蛋白的差异性比较研究。

权利要求

1.一种野生型EGFR高表达的转化体，其特征在于，该转化体为HEK293-EGFR重组细胞，其宿主细胞为HEK293细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体是包含EGFR全长基因的pcDNA3.1(+)-EGFR表达载体。

2.如权利要求1所述的EGFR高表达的转化体应用于以EGFR为靶点的药物筛选；

所述的应用是通过EGFR高表达的HEK293-EGFR细胞膜色谱柱进行药物的筛选。

说明书

一种野生型EGFR高表达的重组HEK293细胞

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及野生型EGFR高表达的非癌细胞的构建，特别涉及一种基于外源重组质粒的野生型EGFR高表达的重组HEK293细胞，以及其应用。技术背景

[0002] 表皮生长因子受体(EGFR)是原癌基因cerbB1(HER1)的表达产物，在许多恶性肿瘤中高表达。EGFR是由1186个氨基酸构成，相对分子量为170kD的跨膜糖蛋白，由胞外区、跨膜区和胞内区三部分组成。糖基化的胞外区折叠成4个亚区，由配体结合位点和2个富含半胱氨酸区域所构成，能结合具有激动功能的多种配体，主要有表皮生长因子，转化生长因子α，B细胞生长因子，肝素结合表皮生长因子样生长因子和表皮调节素等(Cancer Letters，2007，254(2)：165-177)；跨膜区由一短列疏水氨基酸和一跨越脂质双层的α-螺旋桥组成，对激酶激活和信号传导起推动作用；胞内区包括酪氨酸激酶结构域和羧基末端结构域，具有酪氨酸激酶活性，因此EGFR属于受体酪氨酸激酶家族。

[0003] EGFR介导的信号转导通路主要有：①MAPK通路：EGFR配体和EGFR结合后，磷酸化酪氨酸残基与下游的生长因子受体结合蛋白2特异性结合，通过Ras活化，激活MAPK上其它因子，再激活一些转录因子、蛋白激酶等，引发多种生物学效应。②PI3K通路：EGFR配体和EGFR结合后，激活PI3K，PI3K对磷脂酰肌醇环上的3位羟基进行磷酸化，产生磷酸化的磷脂酰肌醇，PI3K激活产生的磷脂酰肌醇与Akt结合，进一步激活其下游的因子，对细胞生存、增殖、细胞周期、凋亡和血管新生等产生调节作用(Biochim BiophysActa，2006，1766(1)：120-39)。

[0004] EGFR的高表达对一些恶性肿瘤细胞的增殖、细胞周期、侵袭及新生血管形成等方面起关键作用(Mendelsohn J，J Clin Oncol，2003，21(14)：2787-2799)，EGFR成为抗肿瘤药物或者疫苗的重要靶点。目前，研发抑制恶性肿瘤中EGFR高表达的药物已成为治疗恶性肿瘤生长和转移的重要手段之一。然而，在EGFR抑制剂研发中，虽有吉非替尼、西妥昔单抗等已被应用于临床，但疗效并非理想，其它一些生物抑制剂仍处于基础研究和临床研究阶段。

[0005] 同时，以EGFR作为靶点，寻找抑制恶性肿瘤中EGFR高表达的药物是研发抗肿瘤新药或类似化合物的重要途径之一。目前已有突变型EGFR基因、干扰RNA等相关载体的构建、转染，以及EGFR家族其它成员相关载体的构建与研究的报道(Nat Biotechnol，2002，20(5)：505-508；Genes Dev，2002，16(8)：948-958.Nat Rev Genet，2002，3(10)：
737-747.)。然而，野生型全长EGFR基因细胞的相关生物学特性及其应用的研究未见报道。

发明内容

[0006] 本发明解决的问题在于提供一种野生型EGFR高表达的非癌细胞，在构建野生型EGFR全长基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-EGFR的基础上，转染HEK293细胞，获得稳定、高表达EGFR分子的HEK293细胞株。

[0007] 本发明是通过以下技术方案来实现：

[0008] 一种EGFR真核表达载体，通过多克隆位点将EGFR全长基因构建于真核质粒pcDNA3.1(+)，所述的多克隆位点为kpn I和xba I酶切位点。

[0009] 所述的EGFR全长基因其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

[0010] 一种野生型EGFR高表达的转化体，该转化体为HEK293-EGFR重组细胞，其宿主细胞为HEK293细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体是包含EGFR全长基因的pcDNA3.1(+)-EGFR表达载体。

[0011] 所述的野生型EGFR高表达的HEK293-EGFR重组细胞应用于以EGFR为靶点的药物筛选。

[0012] 比较野生型EGFR高表达细胞HEK293-EGFR与癌化高表达EGFR的细胞株，应用于EGFR为靶点的药物筛选中，增加筛药灵敏度与特异性，应用于EGFR的生物学特性的研究及EGFR通路蛋白的差异性比较，提高发现功能蛋白的有效性。

[0013] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

[0014] 1、本 发明 构 建了 人表 皮 生长 因子 受 体(EGFR)的 真核 表达 载 体pcDNA3.1(+)-EGFR，测序结果与基因库人EGFR(Transcript variant 1)除2个碱基外，其余碱基完全一致，它们所编码的氨基酸完全一致；pcDNA3.1(+)-EGFR载体脂质体法转染HEK293细胞，经过筛选获得了获得稳定、高表达EGFR分子的重组HEK293-EGFR细胞株。

[0015] 2、HEK293细胞为原代人胚肾细胞转染5型腺病毒(Ad5)DNA的永生化细胞，是载体构建理想的工具细胞；所得重组HEK293-EGFR细胞经过流式细胞术检测EGFR表达量比转染前高4～5倍，免疫荧光检测也显示EGFR的表达有明显的增高。

[0016] 3、pcDNA3.1(+)-EGFR载体转染前后对HEK293细胞的生长无显著影响，用EGF对HEK293-EGFR细胞作用，细胞内p-EGFR及p-ERK表达量增加，表明转染后的EGFR具有生物活性功能，激活了通路蛋白ERK。

[0017] 4、以吉非替尼和吉非替尼加EGF作为诱导因子，分别对转染后HEK293-EGFR细胞诱导15分钟后，检测细胞内磷酸化EGFR及ERK表达量，结果表明吉非替尼对转染后细胞的通路蛋白具有抑制作用，表明EGFR重组后依然介导了HEK293-EGFR细胞内的信号转导。

[0018] 5、细胞膜色谱检测HEK293-EGFR细胞对吉非替尼具有一定的保留，提高了以EGFR为靶点的药物筛选的特异性及灵敏性，为进一步研究其生物学特性及EGFR通路蛋白的差异性比较研究，提高发现功能蛋白的有效性提供细胞模型。

附图说明

[0019] 图1是pcDNA3.1(+)载体的质粒图谱；

[0020] 图2是纯化的EGFR电泳检测图谱；

[0021] 图3是pcDNA3.1(+)-EGFR载体BamH I酶切鉴定图谱；

[0022] 图4是HEK293-EGFR细胞的EGFR表达水平的RT-PCR检测图；

[0023] 图5是流式细胞术检测EGFR在各种细胞膜上的表达量，横坐标代表所测EGFR分子的荧光强度(即“荧光道数”)，纵坐标代表细胞的相对数；

[0024] 图6是免疫荧光染色定性鉴定EGFR在EGFR-293细胞中的表达图；

[0025] 图7是EGFR表达载体转染HEK293细胞前后生长曲线图；

[0026] 图8是EGF及吉非替尼作用于转染的HEK293细胞，western blot检测p-EGFR的表达量；

[0027] 图9是EGF及吉非替尼作用于转染的HEK293细胞，western blot检测通路蛋白p-ERK的表达量；

[0028] 图10是采用细胞膜色谱HEK293-EGFR细胞对吉非替尼的保留，其中，第二个峰为吉非替尼的保留峰。

具体实施方式

[0029] 本发明在构建野生型EGFR全长基因的真核表达载pcDNA3.1(+)-EGFR的基础上，转染HEK293细胞，获得稳定、高表达EGFR分子的重组HEK293-EGFR细胞株。

[0030] 与未转染表达载体的阴性对照细胞相比，该重组HEK293-EGFR细胞株的EGFR表达量增加了4～5倍，应用于EGFR为靶点的药物筛选中，增加筛药灵敏度与特异性；

[0031] 并且比较野生型EGFR高表达细胞HEK293-EGFR与癌化高表达EGFR的细胞株A431，应用于EGFR的生物学特性的研究及EGFR通路蛋白的差异性比较，提高发现功能蛋白的有效性。

[0032] 下面对本方面做详细的说明：

[0033] 本发明是以pcDNA3.1(+)为基础载体，(来源于西安交通大学第一附属医院所赠)，其质粒图谱，如图1所示，本发明选择Kpn I和Xba I酶切位点作为连接外源基因的多克隆位点，以BamH I酶切位点作为检测位点。

[0034] 1)构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-EGFR

[0035] a、设计包含酶切位点的引物对，以pBabe-Puro EGFR WT质粒(其包含EGFR全长基因，来源于美国肿瘤防治中心，上海药物所赠)为模板，PCR扩增EGFR基因全长，所述的引物对为：

[0036] 上游引物：cggggtacca ttatgcgacc ctccgggac 29bp；

[0037] 下游引物：gctctagatc atgctccaat aaattc 26bp；

[0038] 其中，上游引物中ggtacc为Kpn I酶切位点，下游引物中ctaga为XbaI酶切位点；

[0039] PCR反应体系为：HS PCR多聚酶0.5μL；10×Buffer 5μL；dNTP4μL；上游引物(sense，10μmol/L)1μL；下游引物(antisense，10μmol/L)1μL；模板(cDNA)2μL；ddH2O36.5μL；Total：50μL。

[0040] PCR的反应条件为：95℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸4min，循环数35；72℃延伸5min；回收PCR产物，将目的基因EGFR纯化，对纯化的EGFR做凝胶电泳检测，结果如图2所示，其中，泳道1、2为Marker，泳道3、4、5均为纯化的EGFR。

[0041] b、将纯化的EGFR、pcDNA3.1(+)载体在M缓冲液(M Buffer，Takara生物公司试剂)作用下，分别kpn I、xba I双酶切过夜；酶切体系如下：kpnI 1μL；Xba I 1μL，10×M Buffer 2μL；目的基因EGFR片段或载体pcDNA3.18μL；ddH2O 8μL；Total 20μL。

[0042] 分别纯化回收带黏性末端的EGFR片段和pcDNA3.1(+)载体片段，然后通过T4DNA连接酶连接，16℃条件下反应20小时，构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-EGFR。

[0043] 将所得载体常规转化大肠菌DH5a，在含氨苄青霉素的LB琼脂平板中37℃培养，挑取阳性克隆提取质粒，并进行电泳检测和测序。质粒酶切鉴定：用BamH I 37℃酶切3h，然后琼脂糖凝胶电泳检测。

[0044] 由于EGFR基因含有三个BamH1酶切位点，pcDNA3.1(+)载体上含一个该酶切位点，因而，pcDNA3.1(+)-EGFR环形载体可被BamH1酶切为四段，其中一段因分子量小，电泳可能跑出凝胶，其余三段及其大小如图3所示的7427bp、1031bp和539bp，泳道1、2、3、6分别为4个连接成功的质粒，泳道4为marker，泳道5为未连接成功的。

[0045] 将电泳检测正确的质粒进行测序，构建的载体中EGFR的测序结果如SEQ.ID.NO.1所示，其中，1267-1272bp、2298-2303bp、2837-2842bp为所包含的3个BamH1酶切位点，与基因库中EGFR比较(Transcript variant 1)，第2242bp、2467bp两2处核苷酸发生点突变，上述2处突变均为同义突变，其编码的氨基酸与Transcript variant 1完全一致，说明真核表达载体pcDNA3.1(+)-EGFR构建成功。

[0046] 2)pcDNA3.1(+)-EGFR表达载体转染HEK293细胞

[0047] c、采用脂质体2000将质粒转入HEK293细胞(脂质体2000购自美国GIBCO，Invitrogen公司，按照脂质体2000试剂盒说明书操作)，DMEM培养基(Dulbecco′s Modified Eagle Media)加G418浓度600ng/ml筛选14天，挑取G418抗性单克隆传代培养，将调整G418浓度调整为300ng/ml，DMEM培养基筛选培养，得到pcDNA3.1(+)-EGFR阳性转染的克隆。

[0048] d、对转染细胞株的RT-PCR检测：采用TRIZOL试剂盒分别提取未转染和转染的细胞总RNA，并以总RNA为模板采用Fermentas公司的cDNA合成试剂盒进行反转录，得到cDNA；

[0049] 分别以所得cDNA为模板，PCR扩增EGFR基因全长，PCR扩增条件与上述EGFR基因的PCR扩增方法相同，RT-PCR检测EGFR在HEK293-EGFR细胞中基因水平的表达，结果如图4所示，其中，泳道1为重组HEK293-EGFR细胞的EGFR表达检测，泳道2为未转染的HEK293细胞检测，泳道3为Marker，泳道4为空质粒作阴性对照，泳道5为pBabe-Puro EGFR WT质粒，作为阳性对照，与泳道2、4、5相比，泳道1和泳道5均分别得到了3800bp左右的条带，泳道2和4均没有得到相应的条带，RT-PCR检测结果表明重组HEK293-EGFR细胞的EGFR得到表达。

[0050] e、流式细胞术检测HEK293-EGFR细胞株中EGFR的表达：

[0051] 加入0.5-0.8ml胰酶，约5分钟后显微镜下可见贴壁的细胞变圆，吸管吸出胰酶，加入鲜培养基轻轻吹打培养瓶上的细胞，然后收集吹打下的贴壁HEK293-EGFR细胞，7
1×PBS洗涤三次。用含3％胎牛血清的PBS稀释HEK293-EGFR细胞至1×10 个细胞/ml；

[0052] 在HEK293-EGFR细胞悬浮液中加入鼠单克隆EGFR1作为一抗，(abcom公司，1∶2000稀释)，室温孵育45min，然后用PBS洗涤三次；用含3％BSA的PBS以1∶50稀释，有荧光标记的抗鼠源性的IgG作为二抗(美国KPL公司)。加入细胞中室温孵育45min，用流式细胞仪检测，结果如图5所示，其中，图A为HEK293细胞的阴性对照，图B为癌细胞A431的EGFR表达量的检测图，图C为未转染的HEK293的EGFR表达量的检测图，图D为HEK293-EGFR的EGFR表达量的检测图，图中横坐标标注的M1是以阴性细胞为准标出的，落在M1右侧的细胞越多，说明细胞表达的EGFR含量越高，对比图A、图C可见未转染的HEK293的EGFR表达量与阴性对照相比，EGFR的表达量基本一致，对比图A、图C与图D，可见重组的HEK293-EGFR的EGFR表达量明显增加，流式细胞术检测图具体数据为，转染前细胞的平均荧光强度为11.25±1.68，转染重组后的HEK293-EGF其平均荧光强度为43.94±1.98，表达量比转染前高4～5倍；对比图A、图B可见，HEK293-EGFR细胞与A431细胞的EGFR表达量相比也明显增加。

[0053] f、免疫荧光染色定性鉴定EGFR在EGFR-293细胞中的表达，其中使用的一抗、二抗同流式细胞检测的试剂，染色方法也同流式细胞检测的染色方法，检测使用的是共聚焦显微镜(Leica TCS-SP2，德国)。结果如图6所示，其中，荧光分布于细胞膜，一抗为鼠单克隆EGFR1，二抗为有绿色荧光标记的，抗鼠源性的IgG。EGFR与一抗、二抗结合形成免疫复合物并发出荧光，EGFR表达越高，与之结合的一抗、二抗就越多，所发出的荧光就越显著。

[0054] 3)HEK293-EGFR细胞生长及活性分析

[0055] 取生长良好接近汇合的细胞，用胰酶消化，加入新鲜的DMEM培养基制成细胞悬液4
后细胞计数。根据细胞计数结果稀释细胞悬液至浓度为1×10/mL，每25ml小瓶接种1mL细胞悬液，共接种30瓶细胞。

[0056] 24h后开始计数细胞，以后每隔24h计数一次，每次取3瓶细胞，分别进行计数，计算平均值。连续计数10d，结果如表1所示。根据细胞计数结果，以细胞数为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线，如图7所示，同时结合表1所示的HEK293-EGFR细胞生长计数，可以得出HEK293在转染外源表达载体pcDNA3.1(+)-EGFR前后其生长曲线并没有明显的区别。

[0057] 表1.HEK293-EGFR细胞生长计数

[0058]00 78
01 .67 01 .67

13. 00.
9 87 9 87
60. 49.
8 67 8 47
78.9 80.2
7 6 7 7
7 0
6 8.65 6 5.36
6 2
5 8.43 5 7.63

38 17
4 .41 4 .61

380 458
3 .9 3 .8
761 375
2 .4 2 .3
719. 922.
1 1 1 1
0 0
0 00.1 0 00.1
数 数胞 00001 数 数胞 00001
天 细 × 天 细 ×
92KEH RFGE-3 392keH

[0059] 4)HEK293-EGFR细胞部分信号通路蛋白的western blot检测

[0060] 采用western blot方法，检测转染细胞中p-EGFR的变化。用表皮生长因子(EGF)及吉非替尼分别处理转染的HEK293细胞，用RIPA裂解细胞提取细胞总蛋白，100℃变性5min，测蛋白定量。取30μg变性后蛋白上样于12％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，经过SDS-PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体硝酸纤维素薄膜上，以兔抗人磷酸化EGFR抗体为一抗，4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG为二抗孵育2h，经过显影，对细胞内磷酸化EGFR的表达检测，如图8所示的western blot检测结果图，无任何刺激的HEK293-EGFR为空白；给EGF试剂刺激15min后，p-EGFR表达会增加，如图第二泳道；对HEK293-EGFR给予吉非替尼抑制剂的刺激后，p-EGFR表达会降低，如图第三泳道和第二泳道的对比；给予吉非替尼抑制剂后再给予EGF诱导剂刺激15min，p-EGFR表达又会出现，其表达量比第二泳道低，比第三泳道高，表明转染后细胞的p-EGFR受外界作用后，同样会改变。

[0061] 利用同样方法检测HEK293-EGFR细胞内磷酸化ERK的表达，如图9所示，得到相同的结论。以上实验说明了：

[0062] 以EGF作为EGFR的刺激剂，对HEK293-EGFR细胞诱导后，细胞内p-EGFR及p-ERK表达量增加，表明转染后的EGFR具有生物活性功能，激活了通路蛋白ERK；

[0063] 以吉非替尼作为EGFR的抑制剂，对EGF诱导后的HEK293-EGFR细胞作用，细胞内p-EGFR及p-ERK表达量降低；然后再用EGF刺激15min，细胞内磷酸化EGFR及ERK表达量又得到回升，表明吉非替尼对转染后细胞的通路蛋白有影响作用。

[0064] 5)细胞膜色谱检测HEK293-EGFR细胞对吉非替尼的保留

[0065] 用水平衡EGFR高表达的HEK293-EGFR细胞膜色谱柱后，用包含吉非替尼(1.16mg/ml)的甲醇对HEK293-EGFR细胞膜色谱柱上样，上样完成之后用水洗脱，同时紫外检测波长249nm测定HEK293-EGFR细胞膜对吉非替尼的保留时间，同时以未转染的HEK293细胞作为阴性对照。

[0066] HEK293-EGFR细胞膜对吉非替尼的保留如图10所示，横坐标为时间(分钟)，纵坐标为保留量(洗脱量)；HEK293-EGFR细胞膜对吉非替尼具有一定的保留，水洗脱在1.8分钟的时候达到峰值，HEK293-EGFR细胞株在细胞膜色谱分析筛选针对EGFR靶点或者能与EGFR结合的药物，具有一定的亲和力、高灵敏度，说明HEK293-EGFR细胞可用于以EGFR为靶点的药物筛选。

[0067] 核苷酸序列表

[0068] <110>西安交通大学

[0069] <120>一种野生型EGFR高表达的重组HEK293细胞

[0070] <160>1

[0071] <210>1

[0072] <211>3813

[0073] <212>DNA

[0074] <213>人EGFR全长基因

[0075] <400>1

[0076] tggactttgg ctcagagacc actgcttact ggcttatcga aattaatacg actcactata 60[0077] gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttggt accattatgc gaccctccgg 120[0078] gacggccggg gcagcgctcc tggcgctgct ggctgcgctc tgcccggcga gtcgggctct 180[0079] ggaggaaaag aaagtttgcc aaggcacgag taacaagctc acgcagttgg gcacttttga 240[0080] agatcatttt ctcagcctcc agaggatgtt caataactgt gaggtggtcc ttgggaattt 300[0081] ggaaattacc tatgtgcaga ggaattatga tctttccttc ttaaagacca tccaggaggt 360[0082] ggctggttat gtcctcattg ccctcaacac agtggagcga attcctttgg aaaacctgca 420[0083] gatcatcaga ggaaatatgt actacgaaaa ttcctatgcc ttagcagtct tatctaacta 480[0084] tgatgcaaat aaaaccggac tgaaggagct gcccatgaga aatttacagg aaatcctgca 540[0085] tggcgccgtg cggttcagca acaaccctgc cctgtgcaac gtggagagca tccagtggcg 600[0086] ggacatagtc agcagtgact ttctcagcaa catgtcgatg gacttccaga accacctggg 660[0087] cagctgccaa aagtgtgatc caagctgtcc caatgggagc tgctggggtg caggagagga 720[0088] gaactgccag aaactgacca aaatcatctg tgcccagcag tgctccgggc gctgccgtgg 780[0089] caagtccccc agtgactgct gccacaacca gtgtgctgca ggctgcacag gcccccggga 840[0090] gagcgactgc ctggtctgcc gcaaattccg agacgaagcc acgtgcaagg acacctgccc 900[0091] cccactcatg ctctacaacc ccaccacgta ccagatggat gtgaaccccg agggcaaata 960[0092] cagctttggt gccacctgcg tgaagaagtg tccccgtaat tatgtggtga cagatcacgg 1020[0093] ctcgtgcgtc cgagcctgtg gggccgacag ctatgagatg gaggaagacg gcgtccgcaa 1080[0094] gtgtaagaag tgcgaagggc cttgccgcaa agtgtgtaac ggaataggta ttggtgaatt 1140[0095] taaagactca ctctccataa atgctacgaa tattaaacac ttcaaaaact gcacctccat 1200[0096] cagtggcgat ctccacatcc tgccggtggc atttaggggt gactccttca cacatactcc 1260[0097] tcctctggat ccacaggaac tggatattct gaaaaccgta aaggaaatca cagggttttt 1320[0098] gctgattcag gcttggcctg aaaacaggac ggacctccat gcctttgaga acctagaaat 1380[0099] catacgcggc aggaccaagc aacatggtca gttttctctt gcagtcgtca gcctgaacat 1440[0100] aacatccttg ggattacgct ccctcaagga gataagtgat ggagatgtga taatttcagg 1500[0101] aaacaaaaat ttgtgctatg caaatacaat aaactggaaa aaactgtttg ggacctccgg 1560[0102] tcagaaaacc aaaattataa gcaacagagg tgaaaacagc tgcaaggcca caggccaggt 1620[0103] ctgccatgcc ttgtgctccc ccgagggctg ctggggcccg gagcccaggg actgcgtctc 1680[0104] ttgccggaat gtcagccgag gcagggaatg cgtggacaag tgcaaccttc tggagggtga 1740[0105] gccaagggag tttgtggaga actctgagtg catacagtgc cacccagagt gcctgcctca 1800[0106] ggccatgaac atcacctgca caggacgggg accagacaac tgtatccagt gtgcccacta 1860[0107] cattgacggc ccccactgcg tcaagacctg cccggcagga gtcatgggag aaaacaacac 1920[0108] cctggtctgg aagtacgcag acgccggcca tgtgtgccac ctgtgccatc caaactgcac 1980[0109] ctacggatgc actgggccag gtcttgaagg ctgtccaacg aatgggccta agatcccgtc 2040[0110] catcgccact gggatggtgg gggccctcct cttgctgctg gtggtggccc tggggatcgg 2100[0111] cctcttcatg cgaaggcgcc acatcgttcg gaagcgcacg ctgcggaggc tgctgcagga 2160[0112] gagggagctt gtggagcctc ttacacccag tggagaagct cccaaccaag ctctcttgag 2220[0113] gatcttgaag gaaactgaat ttaaaaagat caaagtgctg ggctccggtg cgttcggcac 2280[0114] ggtgtataag ggactctgga tcccagaagg tgagaaagtt aaaattcccg tcgctatcaa 2340[0115] ggaattaaga gaagcaacat ctccgaaagc caacaaggaa atcctcgatg aagcctacgt 2400[0116] gatggccagc gtggacaacc cccacgtgtg ccgcctgctg ggcatctgcc tcacctccac 2460[0117] cgtgcaactc atcacgcagc tcatgccctt cggctgcctc ctggactatg tccgggaaca 2520[0118] caaagacaat attggctccc agtacctgct caactggtgt gtgcagatcg caaagggcat 2580[0119] gaactacttg gaggaccgtc gcttggtgca ccgcgacctg gcagccagga acgtactggt 2640[0120] gaaaacaccg cagcatgtca agatcacaga ttttgggctg gccaaactgc tgggtgcgga 2700[0121] agagaaagaa taccatgcag aaggaggcaa agtgcctatc aagtggatgg cattggaatc 2760[0122] aattttacac agaatctata cccaccagag tgatgtctgg agctacgggg tgaccgtttg 2820[0123] ggagttgatg acctttggat ccaagccata tgacggaatc cctgccagcg agatctcctc 2880[0124] catcctggag aaaggagaac gcctccctca gccacccata tgtaccatcg atgtctacat 2940[0125] gatcatggtc aagtgctgga tgatagacgc agatagtcgc ccaaagttcc gtgagttgat 3000[0126] catcgaattc tccaaaatgg cccgagaccc ccagcgctac cttgtcattc agggggatga 3060[0127] aagaatgcat ttgccaagtc ctacagactc caacttctac cgtgccctga tggatgaaga 3120[0128] agacatggac gacgtggtgg atgccgacga gtacctcatc ccacagcagg gcttcttcag 3180[0129] cagcccctcc acgtcacgga ctcccctcct gagctctctg agtgcaacca gcaacaattc 3240[0130] caccgtggct tgcattgata gaaatgggct gcaaagctgt cccatcaagg aagacagctt 3300[0131] cttgcagcga tacagctcag accccacagg cgccttgact gaggacagca tagacgacac 3360[0132] cttcctccca gtgcctgaat acataaacca gtccgttccc aaaaggcccg ctggctctgt 3420[0133] gcagaatcct gtctatcaca atcagcctct gaaccccgcg cccagcagag acccacacta 3480[0134] ccaggacccc cacagcactg cagtgggcaa ccccgagtat ctcaacactg tccagcccac 3540[0135] ctgtgtcaac agcacattcg acagccctgc ccactgggcc cagaaaggca gccaccaaat 3600[0136] tagcctggac aaccctgact accagcagga cttctttccc aaggaagcca agccaaatgg 3660[0137] catctttaag ggctccacag ctgaaaatgc agaataccta agggtcgcgc cacaaagcag 3720[0138] tgaatttatt ggagcatgat ctagagggcc cgtttaaacc cgctgatcag cctcgactgt 3780[0139] gccttctagt tgtcagcata ctcgtgtgtg gta 3813