一种在花生种子中表达人成骨蛋白-1的方法转让专利
申请号 : CN200910016959.3
文献号 : CN101591671B
文献日 : 2010-12-08
发明人 : 王兴军 , 赵传志 , 毕玉平 , 夏晗 , 李爱芹 , 李长生
申请人 : 山东省农业科学院高新技术研究中心
摘要 :
本发明公开了一种在花生种子中表达人成骨蛋白-1的方法，是利用基因工程手段将成骨蛋白编码基因连接到油体蛋白基因的3’端，构建由油体蛋白启动子驱动的“油体蛋白-肠肽酶-人成骨蛋白”植物表达载体，转化花生，重组蛋白伴随着油体的积累在花生种子中高水平的表达，通过漂浮离心将重组蛋白分离纯化，然后通过外切蛋白酶消化后纯化获得该蛋白。本发明方法获得的重组蛋白安全、活性高、非常容易回收和纯化，而且可以在花生种子中长期的储存、运输方便，可以增加农产品的附加值。
权利要求 :
1.一种在花生种子中表达人成骨蛋白-1的方法，步骤包括(1)克隆包含特异启动子的大豆全长油体蛋白基因soy-oleosin；(2)人成骨蛋白成熟肽cDNA基因bmp7的获得；(3)构建植物表达载体pCAMBIA1302-bmp7；(4)植株转化；(5)转基因花生种子的获得；(6)Western Blot检测转基因花生种子中人成骨蛋白的表达；(7)从转基因花生种子中大规模分离并回收人成骨蛋白；其特征是：所述克隆包含特异启动子的大豆全长油体蛋白基因soy-oleosin的方法是：以大豆基因组DNA为模板，以primer1：5’CATGCCATGGTGTTTATCTTTCTTGCTTTTCTG 3’；带有EcoRI酶切位点GAATTC和肠肽酶识别位点TTATCATCATCATC的反向引物primer2：5’CCGGAATTCCCTTATCATCATCATCTGCGGTTGCGGTTGTTGCTGTCA3’为引物进行PCR反应，PCR反应程序是：94℃5min；再94℃50s，54℃45s，72℃2min，30循环；72℃7min；
所述人成骨蛋白成熟肽cDNA基因bmp7获得的方法是：以人软骨细胞的mRNA为模板，以primer3：5’CCGAATTCATATGACCGGCAGCAAACAG 3’；primer4：5’GAAAGCTTGATCCTTACATGTCGCAGCCACAGGC3’为引物进行一步法RT-PCR反应，PCR反应程序是：45℃1h；再45℃5min，51℃1min，72℃1min，30循环；72℃7min；
所述植物表达载体pCAMBIA1302-bmp7的构建方法是：通过EcoRI酶切位点将按照上述克隆方法获得的bmp7基因连接到按照上述克隆方法获得的soy-oleosin基因的3’端，再通过NcoI和HindIII特异位点一起构建入植物表达载体pCAMBIA1302中，获得pCAMBIA1302-bmp7植物表达载体；
所述的植株转化是：将带有目的基因的植物表达载体pCAMBIA1302-bmp7通过农杆菌侵染的方法转化花生植株；
所述花生种子获得的方法是：收获第二代的转基因花生纯合体的花生种子；
所述Western Blot检测转基因花生种子中人成骨蛋白的表达的方法是：用人成骨蛋白抗体作为一抗，辣根过氧化物酶作为二抗的免疫印迹杂交检测；
所述从转基因花生种子中大规模分离并回收人成骨蛋白的方法是指：将获得的花生种子粉碎，液体抽提，离心处理，回收上层油相，得到融合蛋白；融合蛋白经酶切后离心即获得人成骨蛋白。
2.根据权利要求1所述在花生种子中表达人成骨蛋白-1的方法，其特征是：所述植物表达载体中大豆的油体蛋白基因和启动子、重组蛋白的编码基因的连接顺序为“大豆油体蛋白启动子+大豆油体蛋白基因+肠肽酶识别位点+人成骨蛋白基因+终止子”。
说明书 :
技术领域
本发明涉及一种表达人成骨蛋白-1的方法，尤其涉及一种在花生种子中利用油体蛋白表达系统表达人成骨蛋白-1的方法，属于生物技术领域。
背景技术
人成骨蛋白-1(Human Osteogenic Protein 1，hOP-1)也被称为骨形成发生蛋白7(Bone Morphogenetic Protein 7，BMP-7)对眼发育、肾功能调节和后脑发育等具有重要作用，在临床上有广泛的应用。但由于人骨来源有限，而且从骨组织中提取hOP-1程序复杂，难以得到纯品，经过繁琐程序分离纯化的hOP-1诱骨活性往往不高，严重限制了临床应用[1，2，3]。随着基因工程技术的发展，异源表达成骨蛋白成为可能。目前hOP-1的重组表达方式主要有两种：(1)在哺乳动物或昆虫细胞中表达；(2)原核表达。在哺乳动物细胞表达系统中hOP-1的表达水平低，培养条件要求高，不利于大规模生产。原核表达系统则不能对所表达的目的蛋白进行有效的修饰，得到的蛋白往往活性不高或不具活性[4，5]。
相对于微生物和动物生物反应器，植物反应器更具有明显的优势：成本低廉，易于大规模生产，无病原污染，有利于重组蛋白的翻译后加工及生物活性的维持。但是植物表达体系蛋白表达量低，下游加工纯化困难[6]。近年来，利用植物特别是利用植物的种子作为生物反应器表达外源重组蛋白备受关注，因为在种子成熟过程中，大约有95％的水分会主动失去，细胞中的水解酶活性因此大大降低，重组蛋白可以在种子内长期、稳定地贮存而不会被降解[7]。研究表明，油体蛋白(oleosin)具有亲水和亲脂双重特性，在植物种子中以膜嵌入方式覆盖在油体表面，油体蛋白在油料作物种子中高水平表达。油体蛋白分子除中部疏水区域高度保守外，N端和C端的序列差异都很大。当外源小分子量蛋白插入到油体蛋白的N端或C端后，不会影响到油体蛋白在植物油体上的定位以及其表达，且形成的重组融合蛋白非常稳定。由于油体蛋白定位在油体表面，通过漂浮离心很容易将它与其他细胞成分包括种子中其他储藏蛋白分开。在油料作物种子中利用油体蛋白做载体生产药用及其它有用物质，具有独特的优越性。Xu等克隆了大豆的24kDa油体蛋白的基因和启动子，构建了由油体蛋白启动子驱动的“油体蛋白-肠肽酶-水蛭素”植物表达载体，在转基因烟草中成功表达了重组蛋白，通过肠肽酶切割，通过聚丙烯酰胺电泳分离得到了水蛭素[8]。Nykiforuk等在拟南芥中利用油体-油体蛋白这一系统生产人胰岛素，种子中胰岛素累积到相当高的水平(0.13％种子总蛋白)。在大肠杆菌中表达纳豆激酶(丝氨酸蛋白酶)时往往形成不溶性沉淀，导致没有酶活[9]。Chiang等通过一个内含肽(intein)片断将纳豆激酶连接接到油体蛋白的C端，构建重组蛋白，通过温度诱导内含肽，释放得到可溶性的具有生物活性的纳豆激酶[10]。Chen等用三酰甘油酯、磷脂和油体蛋白合成了人工油体(AOB)，只有天然油体的1/10，通过一系列生理试验证明AOB保留了天然油体的特性而且非常稳定[11]。Peng等利用人工油体优化了油体-油体蛋白表达体系，在大肠杆菌中构建了“油体蛋白-Xa-GFP”表达载体，通过离心，油体蛋白-GFP全部富集到人工油体的表面，通过蛋白酶Xa将GFP从嵌入油体的油体蛋白中分离，再一次离心，收集上清液得到高浓度的GFP[12]。
花生被人们誉为“植物肉”，主要原因是花生种子的高含油量(45-55％)和高的蛋白含量(25-30％)，另外，花生中的蛋白质极易被人体消化吸收，吸收率在90％以上。花生在中国、印度、尼日利亚、美国等都有广阔的种植面积，因此其作为植物反应器有广发的基础，然而在可检索的现有技术中，利用油体蛋白表达系统在花生种子中表达人成骨蛋白-1的方法还未见报道。
相对于微生物和动物生物反应器，植物反应器更具有明显的优势：成本低廉，易于大规模生产，无病原污染，有利于重组蛋白的翻译后加工及生物活性的维持。但是植物表达体系蛋白表达量低，下游加工纯化困难[6]。近年来，利用植物特别是利用植物的种子作为生物反应器表达外源重组蛋白备受关注，因为在种子成熟过程中，大约有95％的水分会主动失去，细胞中的水解酶活性因此大大降低，重组蛋白可以在种子内长期、稳定地贮存而不会被降解[7]。研究表明，油体蛋白(oleosin)具有亲水和亲脂双重特性，在植物种子中以膜嵌入方式覆盖在油体表面，油体蛋白在油料作物种子中高水平表达。油体蛋白分子除中部疏水区域高度保守外，N端和C端的序列差异都很大。当外源小分子量蛋白插入到油体蛋白的N端或C端后，不会影响到油体蛋白在植物油体上的定位以及其表达，且形成的重组融合蛋白非常稳定。由于油体蛋白定位在油体表面，通过漂浮离心很容易将它与其他细胞成分包括种子中其他储藏蛋白分开。在油料作物种子中利用油体蛋白做载体生产药用及其它有用物质，具有独特的优越性。Xu等克隆了大豆的24kDa油体蛋白的基因和启动子，构建了由油体蛋白启动子驱动的“油体蛋白-肠肽酶-水蛭素”植物表达载体，在转基因烟草中成功表达了重组蛋白，通过肠肽酶切割，通过聚丙烯酰胺电泳分离得到了水蛭素[8]。Nykiforuk等在拟南芥中利用油体-油体蛋白这一系统生产人胰岛素，种子中胰岛素累积到相当高的水平(0.13％种子总蛋白)。在大肠杆菌中表达纳豆激酶(丝氨酸蛋白酶)时往往形成不溶性沉淀，导致没有酶活[9]。Chiang等通过一个内含肽(intein)片断将纳豆激酶连接接到油体蛋白的C端，构建重组蛋白，通过温度诱导内含肽，释放得到可溶性的具有生物活性的纳豆激酶[10]。Chen等用三酰甘油酯、磷脂和油体蛋白合成了人工油体(AOB)，只有天然油体的1/10，通过一系列生理试验证明AOB保留了天然油体的特性而且非常稳定[11]。Peng等利用人工油体优化了油体-油体蛋白表达体系，在大肠杆菌中构建了“油体蛋白-Xa-GFP”表达载体，通过离心，油体蛋白-GFP全部富集到人工油体的表面，通过蛋白酶Xa将GFP从嵌入油体的油体蛋白中分离，再一次离心，收集上清液得到高浓度的GFP[12]。
花生被人们誉为“植物肉”，主要原因是花生种子的高含油量(45-55％)和高的蛋白含量(25-30％)，另外，花生中的蛋白质极易被人体消化吸收，吸收率在90％以上。花生在中国、印度、尼日利亚、美国等都有广阔的种植面积，因此其作为植物反应器有广发的基础，然而在可检索的现有技术中，利用油体蛋白表达系统在花生种子中表达人成骨蛋白-1的方法还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种在花生种子中利用油体蛋白表达系统表达人成骨蛋白-1的方法，实现人成骨蛋白以融合的方式与转基因花生油体蛋白一起表达并高水平积累。
本发明所述在花生种子中表达人成骨蛋白-1的方法，步骤包括(1)克隆包含特异启动子的大豆全长油体蛋白基因soy-oleosin；(2)人成骨蛋白成熟肽cDNA基因bmp7的获得；(3)构建植物表达载体pCAMBIA1302-bmp7；(4)植株转化；(5)转基因花生种子的获得；(6)Western Blot检测转基因花生种子中人成骨蛋白的表达；(7)从转基因花生种子中大规模分离并回收人成骨蛋白；其特征是：
所述克隆包含特异启动子的大豆全长油体蛋白基因soy-oleosin的方法是：以大豆基因组DNA为模板，以primer1：5’CATGCCATGGTGTTTATCTTTCTTGCTTTTCTG 3’；primer2：5’CCGGAATTCCCTTATCATCATCATCTGCGGTTGCGGTTGTTGCTGTCA 3’为引物进行PCR反应，PCR反应程序是：94℃5min；再94℃50s，54℃45s，72℃2min，30循环；72℃7min；
所述人成骨蛋白成熟肽cDNA基因bmp7获得的方法是：以人软骨细胞的mRNA为模板，以primer3：5’CCGAATTCATATGACCGGCAGCAAACAG 3’；primer4：5’GAAAGCTTGATCCTTACATGTCGCAGCCACAGGC 3’为引物进行一步法RT-PCR反应，PCR反应程序是：45℃1h；再45℃5min，51℃1min，72℃1min，30循环；72℃7min；
所述植物表达载体pCAMBIA1302-bmp7的构建方法是：通过一个肠肽酶位点将bmp7基因连接到soy-oleosin基因的3’端，再通过NcoI和HindIII特异位点一起构建入植物表达载体pCAMBIA1302中，获得pCAMBIA1302-bmp7植物表达载体；
所述的植株转化是：将带有目的基因的植物表达载体pCAMBIA1302-bmp7通过农杆菌侵染的方法转化花生植株；
所述花生种子获得的方法是：收获第二代的转基因花生纯合体的花生种子；
所述Western Blot检测转基因花生种子中人成骨蛋白的表达的方法是：用人成骨蛋白抗体作为一抗，辣根过氧化物酶作为二抗的免疫印迹杂交检测；
所述从转基因花生种子中大规模分离并回收人成骨蛋白的方法是指：将获得的花生种子粉碎，液体抽提，离心处理，回收上层油相，得到融合蛋白；融合蛋白经酶切后离心即获得人成骨蛋白。
上述植物表达载体中大豆的油体蛋白基因和启动子、重组蛋白的编码基因的连接顺序为“大豆油体蛋白启动子+大豆油体蛋白基因+肠肽酶基因+人成骨蛋白基因+终止子”。
人成骨蛋白具有广阔的临床应用前景，目前直接从骨组织中提取人成骨蛋白程序复杂且难以得到纯品，更何况人骨来源也非常有限；利用微生物生物反应器不能对重组人成骨蛋白正确的糖基化修饰，重组蛋白往往没有活性或者活性很低，利用动物细胞作为生物反应器表达人成骨蛋白表达量低、成本高，这就限制了临床应用，本发明提供的在花生种子中表达人成骨蛋白的方法解决了这一难题，实现了人成骨蛋白以融合的方式与转基因花生油体蛋白一起表达并高水平积累。
本发明以花生为受体植物，花生种子作为表达蛋白的载体，采用大豆油体蛋白基因和启动子的克隆，表达载体的构建，花生的遗传转化，人成骨蛋白基因的表达确认，重组蛋白的分离纯化和回收的方法，成功实现了利用花生种子作为一种新型的生物反应器在转基因花生中高效、安全地表达人成骨蛋白，进而纯化回收蛋白。
本发明方法具有以下优点：
(1)花生含油量高，油体蛋白占花生种子总蛋白的比重在10％以上，人成骨蛋白以融合的方式与转基因花生油体蛋白一起表达并高水平积累。
(2)人成骨蛋白和花生油体蛋白组成的重组蛋白非常的稳定，可以在花生种子中长期、稳定的储存，而且方便运输。
(3)花生栽培面积广、产量高、生产容易，而且分离、纯化人成骨蛋白的方法简单、易操作、成本低。在分离人成骨蛋白后花生油的组分和性质不变，增加了花生产品的附加值。
本发明所述在花生种子中表达人成骨蛋白-1的方法，步骤包括(1)克隆包含特异启动子的大豆全长油体蛋白基因soy-oleosin；(2)人成骨蛋白成熟肽cDNA基因bmp7的获得；(3)构建植物表达载体pCAMBIA1302-bmp7；(4)植株转化；(5)转基因花生种子的获得；(6)Western Blot检测转基因花生种子中人成骨蛋白的表达；(7)从转基因花生种子中大规模分离并回收人成骨蛋白；其特征是：
所述克隆包含特异启动子的大豆全长油体蛋白基因soy-oleosin的方法是：以大豆基因组DNA为模板，以primer1：5’CATGCCATGGTGTTTATCTTTCTTGCTTTTCTG 3’；primer2：5’CCGGAATTCCCTTATCATCATCATCTGCGGTTGCGGTTGTTGCTGTCA 3’为引物进行PCR反应，PCR反应程序是：94℃5min；再94℃50s，54℃45s，72℃2min，30循环；72℃7min；
所述人成骨蛋白成熟肽cDNA基因bmp7获得的方法是：以人软骨细胞的mRNA为模板，以primer3：5’CCGAATTCATATGACCGGCAGCAAACAG 3’；primer4：5’GAAAGCTTGATCCTTACATGTCGCAGCCACAGGC 3’为引物进行一步法RT-PCR反应，PCR反应程序是：45℃1h；再45℃5min，51℃1min，72℃1min，30循环；72℃7min；
所述植物表达载体pCAMBIA1302-bmp7的构建方法是：通过一个肠肽酶位点将bmp7基因连接到soy-oleosin基因的3’端，再通过NcoI和HindIII特异位点一起构建入植物表达载体pCAMBIA1302中，获得pCAMBIA1302-bmp7植物表达载体；
所述的植株转化是：将带有目的基因的植物表达载体pCAMBIA1302-bmp7通过农杆菌侵染的方法转化花生植株；
所述花生种子获得的方法是：收获第二代的转基因花生纯合体的花生种子；
所述Western Blot检测转基因花生种子中人成骨蛋白的表达的方法是：用人成骨蛋白抗体作为一抗，辣根过氧化物酶作为二抗的免疫印迹杂交检测；
所述从转基因花生种子中大规模分离并回收人成骨蛋白的方法是指：将获得的花生种子粉碎，液体抽提，离心处理，回收上层油相，得到融合蛋白；融合蛋白经酶切后离心即获得人成骨蛋白。
上述植物表达载体中大豆的油体蛋白基因和启动子、重组蛋白的编码基因的连接顺序为“大豆油体蛋白启动子+大豆油体蛋白基因+肠肽酶基因+人成骨蛋白基因+终止子”。
人成骨蛋白具有广阔的临床应用前景，目前直接从骨组织中提取人成骨蛋白程序复杂且难以得到纯品，更何况人骨来源也非常有限；利用微生物生物反应器不能对重组人成骨蛋白正确的糖基化修饰，重组蛋白往往没有活性或者活性很低，利用动物细胞作为生物反应器表达人成骨蛋白表达量低、成本高，这就限制了临床应用，本发明提供的在花生种子中表达人成骨蛋白的方法解决了这一难题，实现了人成骨蛋白以融合的方式与转基因花生油体蛋白一起表达并高水平积累。
本发明以花生为受体植物，花生种子作为表达蛋白的载体，采用大豆油体蛋白基因和启动子的克隆，表达载体的构建，花生的遗传转化，人成骨蛋白基因的表达确认，重组蛋白的分离纯化和回收的方法，成功实现了利用花生种子作为一种新型的生物反应器在转基因花生中高效、安全地表达人成骨蛋白，进而纯化回收蛋白。
本发明方法具有以下优点：
(1)花生含油量高，油体蛋白占花生种子总蛋白的比重在10％以上，人成骨蛋白以融合的方式与转基因花生油体蛋白一起表达并高水平积累。
(2)人成骨蛋白和花生油体蛋白组成的重组蛋白非常的稳定，可以在花生种子中长期、稳定的储存，而且方便运输。
(3)花生栽培面积广、产量高、生产容易，而且分离、纯化人成骨蛋白的方法简单、易操作、成本低。在分离人成骨蛋白后花生油的组分和性质不变，增加了花生产品的附加值。
附图说明
图1载体构建示意图。
图2重组蛋白纯化示意图。
图2重组蛋白纯化示意图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明做进一步说明，但不限于此。
实施例1包含启动子的大豆油体蛋白基因的克隆
根据NCBI中大豆油体蛋白的启动子的序列和油体蛋白基因序列(基因登录号：GMU09118)，设计含有NcoI酶切位点(CCATGG)的正向引物序列：primer1：5’CATGCCATGGTGTTTATCTTTCTTGCTTTTCTG 3’；根据大豆油体蛋白基因的开放阅读框序列，去掉中止密码子，设计带有EcoRI酶切位点(GAATTC)和肠肽酶识别位点(TTATCATCATCATC)的反向引物primer2：5’CCGGAATTCCCTTATCATCATCATCTGCGGTTGCGGTTG TTGCTGTCA T 3’。
提取大豆(中黄13)的基因组DNA，方法如下：
(1)取100mg的大豆幼嫩叶片，用液氮研磨成粉，或直接用或贮存于-80℃；
(2)在65℃水浴中预热CTAB提取液(0.2M Tris-HCl，pH 9.0；0.4M LiCl；25mM EDTA；1％SDS)。
(3)估算样品组织的体积，每个样品中加1倍体积预热的CTAB提取液，在65℃温浴10-30min；
(4)加1倍体积的苯酚/氯仿/异戊醇(12∶12∶1)，混匀；
(5)13000rpm离心2min；
(6)将上清转移至一新的离心管中；
(7)用氯仿/异戊醇(24∶1)重复4-6步；
(8)加0.7倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min；
(9)以最大转速室温离心15min；
(10)倒掉上清，用0.2-0.5mL冷的75％乙醇洗沉淀2-3次；
(11)干燥沉淀后，用50μL水或TE溶解DNA，置于-20℃备用。
(12)吸取5μL溶解的DNA，加入45μL水，混匀。
大豆油体蛋白启动子和基因的PCR扩增：
以(primer1，primer2)为引物，大豆基因组DNA为模板，PCR扩增得到大豆油体蛋白的启动子和全长基因。反应程序如下：模板DNA 1μL，2x pfu mix 10.0μL，primer1(10um)0.5μL，primer2(10um)0.5μL，ddH2O 8.0μL。在PCR仪(TaKaRa TP650)上设置94℃5min，随后94℃50s，54℃45s，72℃2min，共30个循环后72℃7min结束反应。
取5μL PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果，挑取阳性克隆测序(见序列表1)。
实施例2人成骨蛋白成熟肽cDNA基因bmp7的获得
根据NCBI中人成骨蛋白-1基因成熟肽的序列(基因登录号：NM_001719)设计含有EcoRI位点的引物primer3：5’CCGAATTCATATGACCGGCAGCAAACAG 3’和带有HindIII位点的primer4：5’GAAAGCTTGATCC TTACATGTCGCAGCCACAGGC 3’。
收集1x106个软骨细胞，用Trizol(Takara)提取mRNA，根据One-Step RT-PCR试剂盒(Clonetech)的标准步骤，进行如下PCR反应：45℃温育1h，(45℃变性5min，51℃退火1min，72℃延伸1min)30个循环，72℃延长7分钟。
取5μL PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果，挑取阳性克隆测序(见序列表4)。
实施例3植物表达载体的构建
植物表达载体的构建过程如图1所示：
(1)油体蛋白基因和人成骨蛋白基因(oleo-bmp7)的连接
PCR产物酶切，体系如下：
PCR product 10.0μL，10x Buffer H 3.0μL，EcoRI 1.0μL，ddH2O16.0μL。37℃保温4h，琼脂糖电泳，分别回收油体蛋白和成骨蛋白基因片断。
用T4DNA连接酶将油体蛋白基因和人成骨蛋白基因进行连接：10x T4DNA ligasebuffer 1.0μL，Oleosin 4.0μL，Bmp74.0μL，T4DNA ligase 1.0μL。16℃连接过夜，取连接产物1.0μL PCR扩增，体系如下：2x pfu mix 10.0μl，primer1(10μm)0.5μl，primer4(10μm)0.5μl，ddH2O 8.0μl。在PCR仪(TaKaRa TP650)上设置94℃5min，随后94℃1min，58℃1min，72℃3min，共30个循环后72℃7min结束反应。
取5μl PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果，切胶回收1.8kb左右的目的带。
(2)植物表达载体的构建
将质粒pCAMBIA1302和上述回收的PCR产物同时用NcoI和HindIII双酶切，分别回收载体序列和oleo-bmp7序列，用T4DNA连接酶将两者进行连接：10xT4DNA ligasebuffer 1.0μl，oleo-bmp7 6.0μl，pCAMBIA1302 2.0μl，T4DNA ligase 1.0μl，16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α。
感受态细胞的制备：用无菌接种环挑取-70℃甘油保存的E.coli DH5α，通过划线稀释的方法经37℃培养16-20h后在平板中得到DH5α的单菌落；挑一单菌落于5ml的LB液体培养基，180rpm振荡培养12h；取1ml DH5αLB菌液于100ml的LB液体培养基，180rpm振荡培养到OD值0.4；冰上放置15分钟，无菌条件下倒入50mlBeckman离心管中，4℃，3500rpm离心10min，弃上清；沉淀用30ml冰预冷的0.1MCaCl2溶液重悬；4℃，3500rpm离心10min，小心倒出上清液；沉淀重悬于2ml冰预冷的含15％甘油0.1M CaCl2溶液；将这些感受态细胞按每份100μl分装。
大肠杆菌的转化：将上述10μl的连接液加入100μl感受态细胞中混匀，冰上30min，42℃热激90s，冰上2分钟，加入600μl液体LB(NaCl 10g/L，Tryptone10g/L，Yeast powder 5g/L)，37℃120rpm振荡培养1.5h，5000rpm离心1min，将大肠杆菌均匀涂抹到含有50μg/ml的卡那霉素的固体LB培养基上(NaCl 10g/L，Tryptone 10g/L，Yeast powder 5g/L，Agar powder 15g/L)，37℃培养过夜。挑取单菌落到4mL液体LB中，37℃摇菌8-10h，提取质粒DNA(Omega)，分别用(NcoI、HindIII)和(NcoI、EcoRI)双酶切验证，对阳性质粒进行测序验证。
(3)表达载体的农杆菌转化
制备农杆菌C58C1的感受态细胞：挑取农杆菌EHA105单菌落到5ml LB培养基(含利福平50μg/ml)摇菌过夜；然后取1ml接种到50ml液体LB培养基中(含利福平50μg/ml)，28℃扩大培养，220rpm震荡培养至OD600＝0.5；冰浴10min，4℃4500rpm，离心10min；菌体用10ml预冷的0.1M CaCl2重悬，4℃4500rpm再次离心10min；沉淀加入1ml 20mM CaCl2悬浮液(60％甘油，0.1M CaCl2)，再加入10％的甘油，80μl分装，液氮速冻保存。
重组质粒转化农杆菌：取上述测序验证正确的质粒2μl加入到80μl农杆菌感受态细胞中，混匀，放到冰上45min，37℃水浴3min，28℃120rpm振荡培养1.5h，5000rpm离心1min，将菌体均匀涂抹到固体LB培养基上(含利福平50μg/ml，卡那霉素50μg/ml)，28℃培养2d。挑取单菌落到4ml液体LB中，28℃摇菌过夜。
取1μl菌液做模板进行PCR验证，分别三对引物引物：(primer1，primer2)、(primer3、primer4)、(primer1，primer4)进行PCR验证，PCR程序同实施例1和实施例2。
实施例4花生的遗传转化和转基因花生种子的获得
(1)花生胚轴的遗传转化
外质体的制备：成熟花生种子去外壳，用70％乙醇浸种1min，无菌水冲洗3次，再用0.1％升汞(w/v)处理15-25min，然后用无菌水冲洗4-6遍，灭菌期间不断摇动种子，以保证种子表面灭菌彻底。剥去种皮，将胚接种于萌发培养基(蔗糖30g/l，琼脂0.7％，MS大量元素，MS微量元素)上，胚轴深入培养基中，培养4d左右取胚轴作为外植体。培养温度25±1℃，光照强度3500lux。
花生胚轴外植体的感染：新鲜培养的农杆菌LBA4404或EHA105，5000g/min离心收集菌体，重悬于液体诱导培养基中，农杆菌感染的最佳浓度为OD600＝0.5-0.8。手术刀切取萌动4d的花生胚轴，在培养的农杆菌(OD600＝0.5-0.8)中浸泡感染25-30分钟，取出外植体在滤纸上吸去多余的菌液，然后接种到诱导分化培养基(MS+蔗糖30g/l，琼脂0.7％，6-BA 10mg/l，NAA 0.8mg/l)上，暗处共培养2d。
选择培养基及转化植株再生：共培养后，将外植体接到含有500mg/l羧苄青霉素的诱导分化培养基上恢复培养7d，再接到含有10mg/l潮霉素和500mg/l羧苄青霉素的诱导分化培养基上进行筛选，培养7d后转接到含有25mg/l潮霉素的诱导分化培养基上进一步筛选，大约3-4周后出现丛生芽点，以后每2周更换一次新鲜培养基。待丛生芽长到1-2cm时将其切下，移至分化伸长培养基(MS+蔗糖30g/L，琼脂0.7％，GA34mg/l，6-BA 2mg/l)上，潮霉素浓度的浓度降至10mg/l，，当小苗长至3-5cm时，将其移至生根培养基(1/2MS+蔗糖30g/L，琼脂0.7％，NAA 2.0mg/l)中，炼苗、转基因植株的移栽。
(2)花生子叶的遗传转化
外质体的制备：成熟花生种子去外壳，先用70％酒精冲洗1min进行表面灭菌，再用0.1％升汞(w/v)处理15-25min，然后用无菌水冲洗4-6遍，最后在无菌水中浸泡2h。剥种皮，获得子叶外植体。
花生子叶外植体的感染：新鲜培养的农杆菌，5000rpm下离心10min，吸取5ml悬浮液重悬在30ml的1/2MS培养基(含有3％蔗糖，1∶6稀释)中，用于共培养。将细菌悬浮液铺在灭菌培养皿上，厚约2-3mm。取花生的新鲜被切子叶外植体，将切边浸入到细菌悬浮液中10-20min，取出外植体在滤纸上吸去多余的菌液，立即埋植到芽诱导培养基(MS+蔗糖30g/L，琼脂0.7％，6-BA 20μM，2，4-D 10μM)中，其中切口深入培养基中。子叶和农杆菌共培养72h后再移至含有头孢氨霉素(250mg/L)的芽诱导培养基上，同样要将切口埋于培养基中。种植密度为每个培养皿5个外植体，石蜡膜封口，在冷荧光灯下，100Es-1m-2光强，25±1℃，16h/8h光照暗周期培养。
植株再生和稳定转化植株的选择：经过农杆菌侵染的子叶外植体移植在含有250mg/L头孢氨霉素的芽诱导培养基上，两星期后，部分外植体出现丛生芽点，而且芽点继续形成。将出现芽点的外植体转移至含250mg/L头孢氨霉素和10mg/L潮霉素的芽诱导培养基中，一周后转接到含有25mg/L潮霉素的芽诱导培养基中继续培养，两周之后将长有丛生芽部分的外植体切下，转移至含有250mg/L头孢氨霉素和10mg/L潮霉素的的芽伸长培养基(MS+蔗糖30g/L，琼脂0.7％，6-BA 2μM)上，进行2-3次继代培养，每个次培养时间约为4周。将伸长的芽(3-4cm)切下在不含任何抗生素的生根培养基(1/2MS+蔗糖30g/L，琼脂0.7％，NAA 5μM)上诱导生根，两周即可诱导出不定根。经炼苗后，将转基因植株的移栽到土壤中。
(3)转基因花生种子的获得
收获花生种子，种植并收获第二代种子，提取DNA进行PCR检测和Southern杂交，验证转基因植株，获得转基因花生种子。
实施例5Western Blot检测转基因花生种子中人成骨蛋白的表达从转基因花生种子中提取重组蛋白：
(1)取0.5g干种子于8ml提取缓冲液(蔗糖0.6M，KCl 10mM，MgCl2 1mM，Tris-Cl0.15M pH7.5)中，匀浆。
(2)12000rpm离心20min，取油相。
(3)加入提取缓冲液重悬混匀，12000rpm离心20min，收集油相。
(4)加入5ml漂浮缓冲液(蔗糖0.4M，KCl 10mM，MgCl2 1mM，Tris-Cl 0.15M pH7.5)重悬，12000rpm离心20min，收集油相。
(5)加入NaHCO3冰浴30min，12000rpm离心20min，收集油相。
(6)用过量丙酮在0℃抽提3次，去除三酰甘油吹干沉淀的蛋白，然后溶于适量无菌水中。
Western Blot杂交：
(1)将提取的重组蛋白50μg通过12％的SDS-PAGE胶电泳分离。
(2)电泳结束后将胶切割成合适的大小，用转膜液平衡3次，每次5分钟。
(3)将硝酸纤维素膜用蒸馏水润洗，用电转方法将胶上的蛋白质转到膜上。
(4)转后将膜放入染色液中50s，在50％的甲醇中脱色至背景清晰，然后用双蒸水清洗。
(5)用0.01M PBS(NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g加H2O定容至1000ml)洗膜3次，每次15min，然后用3％明胶浸泡洗3h，封闭非特异位点的。
(6)将膜取出，用0.01M PBS洗2次，每次10min。
(7)加入用PBS稀释1000倍的一抗(Monoclonal anti-human BMP7antibody)，室温结合2h，阴性对照用1％的BSA。
(8)弃一抗和BSA，用0.01M的PBS洗膜4次，每次5min。
(9)加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(用PBS稀释2000倍)，室温轻摇2h。
(10)弃二抗，用PBS洗膜4次，每次5min。
(11)加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。
实施例6 从转基因花生种子中大规模分离并回收人成骨蛋白
人成骨蛋白分离并回收如图2所示，将转基因花生种子匀浆、压榨；离心后去掉沉淀(种子纤维等)，回收上层的油相，清洗后、离心再次上层的油相；加入肠肽酶进行酶消化反应，离心去掉上次的油相回收水相；纯化得到人成骨蛋白。
参考文献：
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序列表
<110>山东省农业科学院高新技术研究中心
<120>一种在花生种子中表达人成骨蛋白-1的方法
<141>2009-6-6
<160>4
<210>1
<211>1234
<212>DNA
<213>大豆油体蛋白基因及其启动子核苷酸序列
<400>1
tgtttatctt tcttgctttt ctgaacaatt tatctactat gtaaatatat tatcaatgtt 60
taatctattt taatttgcac ataaattttc attttatttt tactttacaa aacaaataaa 120
tatatatgca aaaaaattta caaacgatgc acggattaca aactaatttc attaaatgct 180
aatgcagatt ttgtgaagta aaactccaat tatgatgaaa aataccacca acaccacctg 240
cgaaactgta tcccaactgt ccttaataaa aatgttaaaa agtatattat tctcatttgt 300
ctgtcataat ttatgtaccc cactttaatt tttctgatgt actaaaccga gggcaaactg 360
aaacctgttc ctcatgcaaa gcccctactc accatgtatc atgtacgtgt catcacccaa 420
caactccact tttgctatat aacaacaccc ccgtcacact ctccctctct aacacacacc 480
ccactaacaa ttccttcact tgcagcactg ttgcatcatc atcttcattg caaaacccta 540
aacttcacct tcaaccatga ccacacaagt accaccacac agtgtccaag tccacacaac 600
aacacaccgc tacgaagctg gcgtcgtccc acccggagcc cgtttcgaac cgccgcgtta 660
tgaagccggc gtcaaagcgc cctccattta ccattccgag agaggtccaa cgacttccca 720
ggtcctcgcc gtcctcgccg gcctcccggt cggtggcatc ctgctcctcc tggcgggatt 780
gaccctgggc aggaaccctc accggactgg cagttgccac gccgctcttc gtcctcttca 840
gcccggtgct ggttccagcc acggtcgcat cggcctggcc gtggccgggt tcctgacgtc 900
gggggccttc gggctcacgg cgctgtcttc cttctcctgg atcctgaact acatccggga 960
gacccagcca gcctcggaga acctcgccgc cgccgcgaag catcacctcg ccgaggcggc 1020
ggagtacgtg gggcagaaga cgaaggaagt ggggcagaag accaaggagg ttgggcagga 1080
tattcagagc aaggcacagg atacaaggga ggcagctgca agggatgcaa gggaggcagc 1140
tgcaagggat gcaagggaag ctgctgcaag ggatgcaaag gtggaggcaa gggatgtaaa 1200
gagaacaaca gtgacagcaa caaccgcaac cgca 1234
<210>2
<211>678
<212>DNA
<213>去掉终止子的大豆油体蛋白基因
<400>2
atgaccacac aagtaccacc acacagtgtc caagtccaca caacaacaca ccgctacgaa 60
gctggcgtcg tcccacccgg agcccgtttc gaaccgccgc gttatgaagc cggcgtcaaa 120
gcgccctcca tttaccattc cgagagaggt ccaacgactt cccaggtcct cgccgtcctc 180
gccggcctcc cggtcggtgg catcctgctc ctcctggcgg gattgaccct gggcaggaac 240
cctcaccgga ctggcagttg ccacgccgct cttcgtcctc ttcagcccgg tgctggttcc 300
agccacggtc gcatcggcct ggccgtggcc gggttcctga cgtcgggggc cttcgggctc 360
acggcgctgt cttccttctc ctggatcctg aactacatcc gggagaccca gccagcctcg 420
gagaacctcg ccgccgccgc gaagcatcac ctcgccgagg cggcggagta cgtggggcag 480
aagacgaagg aagtggggca gaagaccaag gaggttgggc aggatattca gagcaaggca 540
caggatacaa gggaggcagc tgcaagggat gcaagggagg cagctgcaag ggatgcaagg 600
gaagctgctg caagggatgc aaaggtggag gcaagggatg taaagagaac aacagtgaca 660
gcaacaaccg caaccgca 678
<210>3
<211>556
<212>DNA
<213>启动子
<400>3
tgtttatctt tcttgctttt ctgaacaatt tatctactat gtaaatatat tatcaatgtt 60
taatctattt taatttgcac ataaattttc attttatttt tactttacaa aacaaataaa 120
tatatatgca aaaaaattta caaacgatgc acggattaca aactaatttc attaaatgct 180
aatgcagatt ttgtgaagta aaactccaat tatgatgaaa aataccacca acaccacctg 240
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ctgtcataat ttatgtaccc cactttaatt tttctgatgt actaaaccga gggcaaactg 360
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caactccact tttgctatat aacaacaccc ccgtcacact ctccctctct aacacacacc 480
ccactaacaa ttccttcact tgcagcactg ttgcatcatc atcttcattg caaaacccta 540
aacttcacct tcaacc 556
<210>4
<211>420
<212>DNA
<213>人成骨蛋白-1基因核苷酸序列
<400>4
atgaccggca gcaaacagcg cagccagaac cgctccaaga cgcccaagaa ccaggaagcc 60
ctgcggatgg ccaacgtggc agagaacagc agcagcgacc agaggcaggc ctgtaagaag 120
cacgagctgt atgtcagctt ccgagacctg ggctggcagg actggatcat cgcgcctgaa 180
ggctacgccg cctactactg tgagggggag tgtgccttcc ctctgaactc ctacatgaac 240
gccaccaacc acgccatcgt gcagacgctg gtccacttca tcaacccgga aacggtgccc 300
aagccctgct gtgcgcccac gcagctcaat gccatctccg tcctctactt cgatgacagc 360
tccaacgtca tcctgaagaa atacagagac atggtggtcc gggcctgtgg ctgccactag 420
实施例1包含启动子的大豆油体蛋白基因的克隆
根据NCBI中大豆油体蛋白的启动子的序列和油体蛋白基因序列(基因登录号：GMU09118)，设计含有NcoI酶切位点(CCATGG)的正向引物序列：primer1：5’CATGCCATGGTGTTTATCTTTCTTGCTTTTCTG 3’；根据大豆油体蛋白基因的开放阅读框序列，去掉中止密码子，设计带有EcoRI酶切位点(GAATTC)和肠肽酶识别位点(TTATCATCATCATC)的反向引物primer2：5’CCGGAATTCCCTTATCATCATCATCTGCGGTTGCGGTTG TTGCTGTCA T 3’。
提取大豆(中黄13)的基因组DNA，方法如下：
(1)取100mg的大豆幼嫩叶片，用液氮研磨成粉，或直接用或贮存于-80℃；
(2)在65℃水浴中预热CTAB提取液(0.2M Tris-HCl，pH 9.0；0.4M LiCl；25mM EDTA；1％SDS)。
(3)估算样品组织的体积，每个样品中加1倍体积预热的CTAB提取液，在65℃温浴10-30min；
(4)加1倍体积的苯酚/氯仿/异戊醇(12∶12∶1)，混匀；
(5)13000rpm离心2min；
(6)将上清转移至一新的离心管中；
(7)用氯仿/异戊醇(24∶1)重复4-6步；
(8)加0.7倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min；
(9)以最大转速室温离心15min；
(10)倒掉上清，用0.2-0.5mL冷的75％乙醇洗沉淀2-3次；
(11)干燥沉淀后，用50μL水或TE溶解DNA，置于-20℃备用。
(12)吸取5μL溶解的DNA，加入45μL水，混匀。
大豆油体蛋白启动子和基因的PCR扩增：
以(primer1，primer2)为引物，大豆基因组DNA为模板，PCR扩增得到大豆油体蛋白的启动子和全长基因。反应程序如下：模板DNA 1μL，2x pfu mix 10.0μL，primer1(10um)0.5μL，primer2(10um)0.5μL，ddH2O 8.0μL。在PCR仪(TaKaRa TP650)上设置94℃5min，随后94℃50s，54℃45s，72℃2min，共30个循环后72℃7min结束反应。
取5μL PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果，挑取阳性克隆测序(见序列表1)。
实施例2人成骨蛋白成熟肽cDNA基因bmp7的获得
根据NCBI中人成骨蛋白-1基因成熟肽的序列(基因登录号：NM_001719)设计含有EcoRI位点的引物primer3：5’CCGAATTCATATGACCGGCAGCAAACAG 3’和带有HindIII位点的primer4：5’GAAAGCTTGATCC TTACATGTCGCAGCCACAGGC 3’。
收集1x106个软骨细胞，用Trizol(Takara)提取mRNA，根据One-Step RT-PCR试剂盒(Clonetech)的标准步骤，进行如下PCR反应：45℃温育1h，(45℃变性5min，51℃退火1min，72℃延伸1min)30个循环，72℃延长7分钟。
取5μL PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果，挑取阳性克隆测序(见序列表4)。
实施例3植物表达载体的构建
植物表达载体的构建过程如图1所示：
(1)油体蛋白基因和人成骨蛋白基因(oleo-bmp7)的连接
PCR产物酶切，体系如下：
PCR product 10.0μL，10x Buffer H 3.0μL，EcoRI 1.0μL，ddH2O16.0μL。37℃保温4h，琼脂糖电泳，分别回收油体蛋白和成骨蛋白基因片断。
用T4DNA连接酶将油体蛋白基因和人成骨蛋白基因进行连接：10x T4DNA ligasebuffer 1.0μL，Oleosin 4.0μL，Bmp74.0μL，T4DNA ligase 1.0μL。16℃连接过夜，取连接产物1.0μL PCR扩增，体系如下：2x pfu mix 10.0μl，primer1(10μm)0.5μl，primer4(10μm)0.5μl，ddH2O 8.0μl。在PCR仪(TaKaRa TP650)上设置94℃5min，随后94℃1min，58℃1min，72℃3min，共30个循环后72℃7min结束反应。
取5μl PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果，切胶回收1.8kb左右的目的带。
(2)植物表达载体的构建
将质粒pCAMBIA1302和上述回收的PCR产物同时用NcoI和HindIII双酶切，分别回收载体序列和oleo-bmp7序列，用T4DNA连接酶将两者进行连接：10xT4DNA ligasebuffer 1.0μl，oleo-bmp7 6.0μl，pCAMBIA1302 2.0μl，T4DNA ligase 1.0μl，16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α。
感受态细胞的制备：用无菌接种环挑取-70℃甘油保存的E.coli DH5α，通过划线稀释的方法经37℃培养16-20h后在平板中得到DH5α的单菌落；挑一单菌落于5ml的LB液体培养基，180rpm振荡培养12h；取1ml DH5αLB菌液于100ml的LB液体培养基，180rpm振荡培养到OD值0.4；冰上放置15分钟，无菌条件下倒入50mlBeckman离心管中，4℃，3500rpm离心10min，弃上清；沉淀用30ml冰预冷的0.1MCaCl2溶液重悬；4℃，3500rpm离心10min，小心倒出上清液；沉淀重悬于2ml冰预冷的含15％甘油0.1M CaCl2溶液；将这些感受态细胞按每份100μl分装。
大肠杆菌的转化：将上述10μl的连接液加入100μl感受态细胞中混匀，冰上30min，42℃热激90s，冰上2分钟，加入600μl液体LB(NaCl 10g/L，Tryptone10g/L，Yeast powder 5g/L)，37℃120rpm振荡培养1.5h，5000rpm离心1min，将大肠杆菌均匀涂抹到含有50μg/ml的卡那霉素的固体LB培养基上(NaCl 10g/L，Tryptone 10g/L，Yeast powder 5g/L，Agar powder 15g/L)，37℃培养过夜。挑取单菌落到4mL液体LB中，37℃摇菌8-10h，提取质粒DNA(Omega)，分别用(NcoI、HindIII)和(NcoI、EcoRI)双酶切验证，对阳性质粒进行测序验证。
(3)表达载体的农杆菌转化
制备农杆菌C58C1的感受态细胞：挑取农杆菌EHA105单菌落到5ml LB培养基(含利福平50μg/ml)摇菌过夜；然后取1ml接种到50ml液体LB培养基中(含利福平50μg/ml)，28℃扩大培养，220rpm震荡培养至OD600＝0.5；冰浴10min，4℃4500rpm，离心10min；菌体用10ml预冷的0.1M CaCl2重悬，4℃4500rpm再次离心10min；沉淀加入1ml 20mM CaCl2悬浮液(60％甘油，0.1M CaCl2)，再加入10％的甘油，80μl分装，液氮速冻保存。
重组质粒转化农杆菌：取上述测序验证正确的质粒2μl加入到80μl农杆菌感受态细胞中，混匀，放到冰上45min，37℃水浴3min，28℃120rpm振荡培养1.5h，5000rpm离心1min，将菌体均匀涂抹到固体LB培养基上(含利福平50μg/ml，卡那霉素50μg/ml)，28℃培养2d。挑取单菌落到4ml液体LB中，28℃摇菌过夜。
取1μl菌液做模板进行PCR验证，分别三对引物引物：(primer1，primer2)、(primer3、primer4)、(primer1，primer4)进行PCR验证，PCR程序同实施例1和实施例2。
实施例4花生的遗传转化和转基因花生种子的获得
(1)花生胚轴的遗传转化
外质体的制备：成熟花生种子去外壳，用70％乙醇浸种1min，无菌水冲洗3次，再用0.1％升汞(w/v)处理15-25min，然后用无菌水冲洗4-6遍，灭菌期间不断摇动种子，以保证种子表面灭菌彻底。剥去种皮，将胚接种于萌发培养基(蔗糖30g/l，琼脂0.7％，MS大量元素，MS微量元素)上，胚轴深入培养基中，培养4d左右取胚轴作为外植体。培养温度25±1℃，光照强度3500lux。
花生胚轴外植体的感染：新鲜培养的农杆菌LBA4404或EHA105，5000g/min离心收集菌体，重悬于液体诱导培养基中，农杆菌感染的最佳浓度为OD600＝0.5-0.8。手术刀切取萌动4d的花生胚轴，在培养的农杆菌(OD600＝0.5-0.8)中浸泡感染25-30分钟，取出外植体在滤纸上吸去多余的菌液，然后接种到诱导分化培养基(MS+蔗糖30g/l，琼脂0.7％，6-BA 10mg/l，NAA 0.8mg/l)上，暗处共培养2d。
选择培养基及转化植株再生：共培养后，将外植体接到含有500mg/l羧苄青霉素的诱导分化培养基上恢复培养7d，再接到含有10mg/l潮霉素和500mg/l羧苄青霉素的诱导分化培养基上进行筛选，培养7d后转接到含有25mg/l潮霉素的诱导分化培养基上进一步筛选，大约3-4周后出现丛生芽点，以后每2周更换一次新鲜培养基。待丛生芽长到1-2cm时将其切下，移至分化伸长培养基(MS+蔗糖30g/L，琼脂0.7％，GA34mg/l，6-BA 2mg/l)上，潮霉素浓度的浓度降至10mg/l，，当小苗长至3-5cm时，将其移至生根培养基(1/2MS+蔗糖30g/L，琼脂0.7％，NAA 2.0mg/l)中，炼苗、转基因植株的移栽。
(2)花生子叶的遗传转化
外质体的制备：成熟花生种子去外壳，先用70％酒精冲洗1min进行表面灭菌，再用0.1％升汞(w/v)处理15-25min，然后用无菌水冲洗4-6遍，最后在无菌水中浸泡2h。剥种皮，获得子叶外植体。
花生子叶外植体的感染：新鲜培养的农杆菌，5000rpm下离心10min，吸取5ml悬浮液重悬在30ml的1/2MS培养基(含有3％蔗糖，1∶6稀释)中，用于共培养。将细菌悬浮液铺在灭菌培养皿上，厚约2-3mm。取花生的新鲜被切子叶外植体，将切边浸入到细菌悬浮液中10-20min，取出外植体在滤纸上吸去多余的菌液，立即埋植到芽诱导培养基(MS+蔗糖30g/L，琼脂0.7％，6-BA 20μM，2，4-D 10μM)中，其中切口深入培养基中。子叶和农杆菌共培养72h后再移至含有头孢氨霉素(250mg/L)的芽诱导培养基上，同样要将切口埋于培养基中。种植密度为每个培养皿5个外植体，石蜡膜封口，在冷荧光灯下，100Es-1m-2光强，25±1℃，16h/8h光照暗周期培养。
植株再生和稳定转化植株的选择：经过农杆菌侵染的子叶外植体移植在含有250mg/L头孢氨霉素的芽诱导培养基上，两星期后，部分外植体出现丛生芽点，而且芽点继续形成。将出现芽点的外植体转移至含250mg/L头孢氨霉素和10mg/L潮霉素的芽诱导培养基中，一周后转接到含有25mg/L潮霉素的芽诱导培养基中继续培养，两周之后将长有丛生芽部分的外植体切下，转移至含有250mg/L头孢氨霉素和10mg/L潮霉素的的芽伸长培养基(MS+蔗糖30g/L，琼脂0.7％，6-BA 2μM)上，进行2-3次继代培养，每个次培养时间约为4周。将伸长的芽(3-4cm)切下在不含任何抗生素的生根培养基(1/2MS+蔗糖30g/L，琼脂0.7％，NAA 5μM)上诱导生根，两周即可诱导出不定根。经炼苗后，将转基因植株的移栽到土壤中。
(3)转基因花生种子的获得
收获花生种子，种植并收获第二代种子，提取DNA进行PCR检测和Southern杂交，验证转基因植株，获得转基因花生种子。
实施例5Western Blot检测转基因花生种子中人成骨蛋白的表达从转基因花生种子中提取重组蛋白：
(1)取0.5g干种子于8ml提取缓冲液(蔗糖0.6M，KCl 10mM，MgCl2 1mM，Tris-Cl0.15M pH7.5)中，匀浆。
(2)12000rpm离心20min，取油相。
(3)加入提取缓冲液重悬混匀，12000rpm离心20min，收集油相。
(4)加入5ml漂浮缓冲液(蔗糖0.4M，KCl 10mM，MgCl2 1mM，Tris-Cl 0.15M pH7.5)重悬，12000rpm离心20min，收集油相。
(5)加入NaHCO3冰浴30min，12000rpm离心20min，收集油相。
(6)用过量丙酮在0℃抽提3次，去除三酰甘油吹干沉淀的蛋白，然后溶于适量无菌水中。
Western Blot杂交：
(1)将提取的重组蛋白50μg通过12％的SDS-PAGE胶电泳分离。
(2)电泳结束后将胶切割成合适的大小，用转膜液平衡3次，每次5分钟。
(3)将硝酸纤维素膜用蒸馏水润洗，用电转方法将胶上的蛋白质转到膜上。
(4)转后将膜放入染色液中50s，在50％的甲醇中脱色至背景清晰，然后用双蒸水清洗。
(5)用0.01M PBS(NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g加H2O定容至1000ml)洗膜3次，每次15min，然后用3％明胶浸泡洗3h，封闭非特异位点的。
(6)将膜取出，用0.01M PBS洗2次，每次10min。
(7)加入用PBS稀释1000倍的一抗(Monoclonal anti-human BMP7antibody)，室温结合2h，阴性对照用1％的BSA。
(8)弃一抗和BSA，用0.01M的PBS洗膜4次，每次5min。
(9)加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(用PBS稀释2000倍)，室温轻摇2h。
(10)弃二抗，用PBS洗膜4次，每次5min。
(11)加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。
实施例6 从转基因花生种子中大规模分离并回收人成骨蛋白
人成骨蛋白分离并回收如图2所示，将转基因花生种子匀浆、压榨；离心后去掉沉淀(种子纤维等)，回收上层的油相，清洗后、离心再次上层的油相；加入肠肽酶进行酶消化反应，离心去掉上次的油相回收水相；纯化得到人成骨蛋白。
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序列表
<110>山东省农业科学院高新技术研究中心
<120>一种在花生种子中表达人成骨蛋白-1的方法
<141>2009-6-6
<160>4
<210>1
<211>1234
<212>DNA
<213>大豆油体蛋白基因及其启动子核苷酸序列
<400>1
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<211>678
<212>DNA
<213>去掉终止子的大豆油体蛋白基因
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<212>DNA
<213>启动子
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<213>人成骨蛋白-1基因核苷酸序列
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