一种微生物转化生产二羟基丙酮的方法

摘要

本发明提供了一种微生物转化生产二羟基丙酮的方法，所述方法包括：将氧化葡糖杆菌CCTCC No：M 208069接种至发酵培养基，培养获得发酵液，以发酵液中含酶细胞作为催化剂、以甘油为底物的反应体系中进行生物催化反应，反应结束后，反应液经分离纯化得到所述二羟基丙酮；本发明利用整体细胞作为生物催化剂，结合整体细胞辅酶再生技术，在气搅拌式生物反应器中生产DHA；具有操作简单方便、节能、生产效率高等特点，可适合于工业化大规模生产。

权利要求

1.一种微生物转化生产二羟基丙酮的方法，所述方法包括：

(1)将氧化葡糖杆菌CCTCC No：M 208069接种至发酵培养基，在28～32℃、通风量

0.3～1.5vvm条件下培养24～32h，得到发酵液；所述发酵培养基终浓度组成如下：甘露醇

40～100g/L，酵母提取粉2～20g/L，蛋白胨1～20g/L，NaH2PO4·2H2O 0.5～2g/L，溶剂为水，pH4.0～7.0；

(2)在以步骤(1)发酵液中含酶细胞作为催化剂、以甘油为底物的反应体系中，于气搅拌式生物反应器中，在温度28～32℃、通风量0.3～3.0vvm、pH 4.0～7.0条件下进行生物催化反应，底物甘油初始浓度为5g/L～30g/L，于反应过程中流加甘油使甘油总浓度为

200～300g/L，总反应时间为24h～96h，得到反应液；过滤使含催化剂的滤饼与滤液分离；

(3)按照步骤(2)方法重复进行3～4批次生物催化反应后，对催化剂进行复活操作：将步骤(2)含催化剂的滤饼置于足量的液体培养基中，在28～32℃通风量0.3～1.5vvm条件下，培养20～28h；使含酶细胞复活，所述液体培养基终浓度组成如下：甘油30mL/L，酵母提取粉5g/L，溶剂为水；

(4)取步骤(3)复活后的含酶细胞另取甘油重复步骤(2)、(3)的操作3～5次，合并多个批次的反应液的滤液，经分离纯化得到所述二羟基丙酮。

2.一种微生物转化生产二羟基丙酮的方法，其特征在于所述方法如下：

(1)氧化葡糖杆菌CCTCC No：M 208069接种至斜面培养基，30℃培养至长出单菌落，作为斜面种子；所述的斜面培养基终浓度组成如下：葡萄糖20g/L，酵母提取粉5g/L，琼脂

20g/L，溶剂为水，pH7.0；

(2)将斜面种子接种至液体种子培养基，30℃、100～200rpm振荡培养24～60h，得到种子液；所述液体种子培养基终浓度组成如下：甘油10～50mL/L，酵母提取粉2～20g/L，蛋白胨1～20g/L，NaH2PO4·2H2O 0.5～2g/L，溶剂为水，pH4.0～7.0；

(3)种子液以1～5％体积比接种量接种至发酵培养基，温度30℃、转速250rpm、通风量0.3～1.5vvm、pH 4.0～7.0条件下培养24～32h，得到菌悬液；所述发酵培养基终浓度组成如下：甘露醇40～100g/L，酵母提取粉2～0g/L，蛋白胨1～20g/L，NaH2PO4·2H2O

0.5～2g/L，溶剂为水，pH4.0～7.0；

(4)将步骤(3)所述菌悬液，与4％海藻酸钠溶液混合，搅拌均匀，将混合液滴在1.0％CaCl2溶液中，静置12小时，制备得到固定化细胞，菌悬液：海藻酸钠溶液：CaCl2溶液体积用量之比为1∶1∶10；

(5)将固定化细胞装入气搅拌式生物反应器中，加入5g/L～30g/L甘油水溶液，于温度

30℃、通风量0.3～3.0vvm、pH4.0～7.0条件下进行生物催化反应，反应过程中流加甘油至反应体系中甘油总浓度为200～300g/L，总反应时间为24h～96h；

(6)反应结束后，放出反应液，往反应器中加入甘油水溶液，按照步骤(5)的操作进行下一批次生物催化反应，总计进行3～5个批次的生物催化反应；

(7)对固定化细胞进行细胞复活：往反应器中加入足量液体培养基，在28～32℃通风量0.3～1.5vvm条件下，培养20～28h；所述液体培养基终浓度组成如下：甘油30g/L，酵母提取粉5g/L，溶剂为水；

(8)放出液体培养基，重复进行步骤(5)～(7)的操作1～3次，合并各批次反应液，经分离纯化得到所述二羟基丙酮。

3.一种微生物转化生产二羟基丙酮的方法，其特征在于所述方法如下：

(1)氧化葡糖杆菌CCTCC No：M 208069接种至斜面培养基，30℃培养至长出单菌落，作为斜面种子；所述的斜面培养基终浓度组成如下：葡萄糖20g/L，酵母提取粉5g/L，琼脂

20g/L，溶剂为水，pH7.0；

(2)将斜面种子接种至液体种子培养基，30℃、100～200rpm振荡培养24～60h，得到种子液；所述液体种子培养基终浓度组成如下：甘油10～50g/L，酵母提取粉2～20g/L，蛋白胨1～20g/L，NaH2PO4·2H2O 0.5～2g/L，溶剂为水，pH4.0～7.0；

(3)种子液以1～5％体积比接种量接种至发酵培养基，温度30℃、转速250rpm、通风量0.3～1.5vvm、pH 4.0～7.0条件下培养24～32h，得到菌悬液；所述发酵培养基终浓度组成如下：甘露醇40～100g/L，酵母提取粉2～20g/L，蛋白胨1～20g/L，NaH2PO4·2H2O

0.5～2g/L，溶剂为水，pH4.0～7.0；

(4)将步骤(3)得到的菌悬液移入气搅拌式生物反应器，连续加入甘油，甘油总的流加量为使甘油在反应体系中总浓度达到200～300g/L，于温度30℃、通风量0.3～3vvm、pH

4.0～7.0条件下进行生物催化反应，总反应时间为24h～96h；

(5)反应结束后，放出反应液进行固液分离，得到的上清液用于分离纯化二羟基丙酮，菌体重新装入气搅拌式生物反应器，往反应器中加入甘油水溶液，按照步骤(4)的操作进行下一批次生物催化反应，总计进行3～5个批次的生物催化反应；

(6)对游离细胞进行细胞复活：反应后的菌体细胞加入液体培养基中，在28～32℃通风量0.3～1.5vvm条件下，培养20～28h；所述液体培养基终浓度组成如下：甘油30mL/L，酵母提取粉5g/L，溶剂为水；

(7)经复活后的菌体细胞再重复步骤(4)～(6)的操作1～3次，合并各个批次的上清液，经分离纯化得到所述二羟基丙酮。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述气搅拌式生物反应器为下列之一：气搅拌鼓泡塔生物反应器，外循环式气升式生物反应器，内循环式气升式生物反应器。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述分离纯化方法如下：将反应液或上清液浓缩得到浓缩液，浓缩液上装有100～200目硅胶的层析柱，采用体积比95∶5的乙酸乙酯-乙醇混合溶剂为流动相，使用石油醚湿法装柱，层析柱高径比35∶1，洗脱流速2mL/min，加样体积为柱床体积的5％；收集含DHA段样品，进行真空浓缩，于体积比95∶5的乙酸乙酯-乙醇溶液中获得二羟基丙酮结晶。

6.氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)ZJB-605，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 208069，保藏日期2008年

05月09日。

说明书

一种微生物转化生产二羟基丙酮的方法

(一)技术领域

[0001] 本发明涉及一种微生物转化生产二羟基丙酮的方法。(二)背景技术

[0002] 1，3-二羟基丙酮(1，3-Dihydroxyacetone)又称为二羟基丙酮，(以下简称DHA)，是最单的酮糖，带有甜味的白色粉末状结晶，易溶于水、乙醇、丙酮和乙醚等有机溶剂。这种化学物质的分子量为90.08。

[0003] DHA用途广泛，市场容量大，DHA生产方法主要有化学法与生物法。生物法生产DHA与化学法相比具有许多优点：专一性强、底物利用率高、转化率高等特点。

[0004] 用微生物法转化甘油为二羟基丙酮的研究已有很多专利和文献报道，所用的用于产生甘油脱氢酶的微生物主要是葡糖杆菌属(Gluconobacter)(US 5770411)和醋杆菌属(Acetobacter)(US 4076589)微生物，尤其是氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和弱氧化醋杆菌(AcebobacterSuboxydans)的报道居多，此外还研究过芽孢杆菌属(Bacillus)的枯草杆菌(Bacillus subtilis FERM P-10524)(JP 2286089)、单孢丝菌属(Micromonospora)(JP 62210994)，假单胞菌属(Pseudomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、克霉伯氏菌属(Klebsiella)、欧文艺节目氏菌属(Erwinia)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、根霉属(Rhizopus)(US 4576913)、毕赤酵母(Pichia)等等。

[0005] 生物催化甘油生产DHA的反应机理就是，利用微生物产生的甘油脱氢酶通过催化甘油2位的羟基氧化成羰基反应，生成DHA。

[0006]

[0007] 甘油脱氢酶是属于氧化还原酶类，催化甘油氧化反应生成DHA的反应需要辅酶+(NAD/NADH)参与。辅酶再生循环是氧化还原酶类生物催化反应的关键。辅酶再生循环就是把辅酶从氧化态再生为还原态，或者反之，从而使一定状态的辅酶(氧化态与还原态)保持在一定的催化剂量水平。辅酶再生有化学、光化学、酶学和电化学等再生体系，在工业化生产其中尤以酶法辅酶再生为主。辅酶再生体系在应用过程中可以以游离酶的状态，或者以固定化酶、细胞内酶等多种方式进行再生。微生物细胞内自身拥有十分完整的辅酶再生体系，通过微生物的各种代谢与呼吸链传递等手段实现辅酶再生循环。因此利用整体细胞生物催化反应，微生物细胞自身的辅酶循环与平衡系统能有效解决辅酶再生问题，利用整体细胞进化催化反应时候，不需要添加辅酶，可以通过菌体培养，能恢复菌体细胞催化活力。
跟游离酶生物催化反应相比，利用整体细胞进行生物催化反应，具有一定的优点：(1)减少了酶的分离、纯化过程；(2)许多生物催化与生物转化反应过程要在胞内多酶体系中进行，极难在非细胞内状态下得以重现；(3)完整细胞可在其代谢过程中产生各种辅酶，能保持辅酶再生循环，使各种催化反应得以顺利进行。

[0008] 国内外报道生物法生产DHA方法主要有：固定化细胞生物催化生产DHA，膜生物反应器连续发酵法制取DHA，半连续二阶段重复补料分批发酵法生产DHA等。未见文献报道用气搅拌式生物反应器生产DHA，也未见有关辅酶再生技术在DHA生产过程中的应用。(三)发明内容

[0009] 本发明目的在于提供一种高效、节能、操作简单方便的二羟基丙酮生产新工艺。

[0010] 本发明采用的技术方案是：

[0011] 一种微生物转化生产二羟基丙酮的方法，所述方法包括：

[0012] (1)将氧化葡糖杆菌CCTCC No：M 208069接种至发酵培养基，在28～32℃、通风量0.3～1.5vvm条件下培养24～32h，得到发酵液；

[0013] 所述发酵培养基终浓度组成如下：甘露醇40～100g/L，酵母提取粉2～20g/L，蛋白胨1～20g/L，NaH2PO4·2H2O 0.5～2g/L，溶剂为水，pH4.0～7.0；氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)ZJB-605，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 208069，保藏日期2008年05月09日。

[0014] (2)在以步骤(1)发酵液中含酶细胞作为催化剂、以甘油为底物的反应体系中(可直接使用发酵液添加底物进行反应，也可将发酵液分离获得湿菌体细胞作为催化剂加入甘油水溶液中进行反应)，于气搅拌式生物反应器中，在温度28～32℃、通风量0.3～3.0vvm、pH4.0～7.0条件下进行生物催化反应，底物甘油初始浓度为5g/L～30g/L，于反应过程中流加甘油使甘油总浓度为200～300g/L，总反应时间为24h～96h，得到反应液；
过滤使含催化剂的滤饼与滤液分离；

[0015] (3)含催化剂的滤饼继续加入底物甘油的水溶液按照步骤(2)方法重复进行多批次生物催化反应后，对催化剂进行复活操作：将步骤(2)含催化剂的滤饼置于足量的液体培养基中，在28～32℃通风量0.3～1.5vvm条件下，培养20～28h；使含酶细胞复活，所述液体培养基终浓度组成如下：甘油30mL/L，酵母提取粉5g/L，溶剂为水；

[0016] (4)取步骤(3)复活后的含酶细胞另取甘油重复步骤(2)、(3)的操作，合并多个批次的反应液的滤液，经分离纯化得到所述二羟基丙酮。

[0017] 通常，所述含酶细胞需经固定化后获得固定化细胞，再作为催化剂使用。

[0018] 所述固定化细胞可重复使用3～5个批次，在连续进行3～4批反应过后，要对固定化细胞活力恢复，细胞内辅酶会再生，重新达到平衡，满足进行固定化细胞生物催化反应的要求。所述固定化细胞复活方法如下：将固定化细胞加入至液体培养基，在28～32℃通风量0.3～1.5vvm条件下，培养20～28h；所述液体培养基终浓度组成如下：甘油30mL/L，酵母提取粉5g/L，溶剂为水。经过细胞复活处理后的整体细胞的催化活力将会恢复，然后进行3～5个批次的生物催化反应操作，然后再进行细胞复活操作，这样可以循环3～5次。

[0019] 本发明利用微生物产生的甘油脱氢酶通过催化甘油2位的羟基氧化成羰基反应，生成DHA。甘油脱氢酶是属于氧化还原酶类，催化甘油氧化反应生成DHA的反应需要辅酶+(NAD/NADH)参与。本发明利用微生物胞内甘油脱氢酶(整体细胞)作为生物催化剂，利用微生物细胞体内自身的辅酶再生平衡系统，来实现辅酶的再生循环。在整体细胞进行催化甘油生产DHA时候，由于辅酶再生循环等问题，整体细胞的催化活力会下降，通过对整体细胞的培养，细胞的催化活力得到恢复，可以实现整体细胞多批次重复利用，提高生产效率，大大降低生产成本。

[0020] 具体的，所述方法如下：

[0021] (1)氧化葡糖杆菌CCTCC No：M 208069接种至斜面培养基，30℃培养至长出单菌落，作为斜面种子；所述的斜面培养基终浓度组成如下：葡萄糖20g/L，酵母提取粉5g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH7.0；

[0022] (2)将斜面种子接种至液体种子培养基，30℃、100～200rpm振荡培养24～60h，得到种子液；所述液体种子培养基终浓度组成如下：甘油10～50mL/L，酵母提取粉2～20g/L，蛋白胨1～20g/L，NaH2PO4·2H2O0.5～2g/L，溶剂为水，pH4.0～7.0；

[0023] (3)种子液以1～5％体积比接种量接种至发酵培养基，温度30℃、转速250rpm、通风量0.3-1.5vvm、pH4.0～7.0条件下培养24～32h，得到菌悬液；所述发酵培养基终浓度组成如下：甘露醇40～100g/L，酵母提取粉2～20g/L，蛋白胨1～20g/L，NaH2PO4·2H2O0.5～2g/L，溶剂为水，pH4.0～7.0；

[0024] (4)将步骤(3)所述菌悬液，与4％海藻酸钠溶液混合，搅拌均匀，将混合液滴在1.0％CaCl2溶液中，静置12小时，制备得到固定化细胞，菌悬液、海藻酸钠溶液∶CaCl2溶液体积用量之比为1∶1∶10；

[0025] (5)将固定化细胞装入气搅拌式生物反应器中，加入5g/L～30g/L甘油水溶液，于温度30℃、通风量0.3～3.0vvm、pH4.0～7.0条件下进行生物催化反应，反应过程中流加甘油至反应体系中甘油总浓度为200～300g/L，总反应时间为24h～96h；

[0026] (6)反应结束后，放出反应液，往反应器中加入甘油水溶液，按照步骤(5)的操作进行下一批次生物催化反应，总计进行3～5个批次的生物催化反应；

[0027] (7)对固定化细胞进行细胞复活：往反应器中加入足量液体培养基，在28～32℃通风量0.3～1.5vvm条件下，培养20～28h；所述液体培养基终浓度组成如下：甘油30mL/L，酵母提取粉5g/L，溶剂为水；

[0028] (8)放出液体培养基，重复进行步骤(5)～(7)的操作1～3次，合并各批次反应液，经分离纯化得到所述二羟基丙酮。

[0029] 或者，所述方法如下：

[0030] (1)氧化葡糖杆菌CCTCC No：M 208069接种至斜面培养基，30℃培养至长出单菌落，作为斜面种子；所述的斜面培养基终浓度组成如下：葡萄糖20g/L，酵母提取粉5g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH7.0；

[0031] (2)将斜面种子接种至液体种子培养基，30℃、100～200rpm振荡培养24～60h，得到种子液；所述液体种子培养基终浓度组成如下：甘油10～50mL/L，酵母提取粉2～20g/L，蛋白胨1～20g/L，NaH2PO4·2H2O0.5～2g/L，溶剂为水，pH4.0～7.0；

[0032] (3)种子液以1～5％体积比接种量接种至发酵培养基，温度30℃、转速250rpm、通风量0.3～1.5vvm、pH4.0～7.0条件下培养24～32h，得到菌悬液；所述发酵培养基终浓度组成如下：甘露醇40～100g/L，酵母提取粉2～20g/L，蛋白胨1～20g/L，NaH2PO4·2H2O 0.5～2g/L，溶剂为水，pH4.0～7.0；

[0033] (4)将步骤(3)得到的菌悬液移入气搅拌式生物反应器，连续加入甘油，甘油总的流加量为使甘油在反应体系中总浓度达到200～300g/L，于温度30℃、通风量0.3～3vvm、pH4.0～7.0条件下进行生物催化反应，总反应时间为24h～96h；

[0034] (5)反应结束后，放出反应液进行固液分离，得到的上清液用于分离纯化二羟基丙酮，菌体重新装入气搅拌式生物反应器，往反应器中加入甘油水溶液，按照步骤(4)的操作进行下一批次生物催化反应，总计进行3～5个批次的生物催化反应；

[0035] (6)对游离细胞进行细胞复活：反应后的菌体细胞加入液体培养基中，在28～32℃通风量0.3～1.5vvm条件下，培养20～28h；所述液体培养基终浓度组成如下：甘油
30mL/L，酵母提取粉5g/L，溶剂为水；

[0036] (7)经复活后的菌体细胞再重复步骤(4)～(6)的操作1～3次，合并各个批次的上清液，经分离纯化得到所述二羟基丙酮。

[0037] 所述气搅拌式生物反应器可为下列之一：鼓泡塔生物反应器，外循环式气升式生物反应器，内循环式气升式生物反应器。

[0038] 所述分离纯化可按本领域常规适用于二羟基丙酮的分离纯化步骤进行，如：过滤、离心、沉淀、结晶、重结晶、浓缩、干燥、冷冻干燥、吸附、离子交换、层析等等。本发明中所述分离纯化方法如下：将反应液或上清液浓缩得到浓缩液，浓缩液上层析柱，采用体积比95∶5的乙酸乙酯-乙醇混合溶剂为流动相，使用石油醚湿法装柱，层析柱高径比10～
40∶1，洗脱流速1mL/min～10mL/min，加样体积为柱床体积的3％～10％；收集含DHA段样品，进行真空浓缩，于体积比95∶5的乙酸乙酯-乙醇溶液中获得二羟基丙酮结晶。

[0039] 本发明中，DHA的分析方法可采用气相色谱与薄层层析方法进行：

[0040] DHA薄层层析方法：实验采用G型硅胶板(20mm×10mm)，展开剂：氯仿-甲醇-蒸馏水混合溶剂(体积比为80∶19∶1)，显色剂组成为：磷钼酸3g，甲醇45mL，蒸馏水45mL和浓硫酸10mL。具体操作步骤：将点样后的硅胶薄板以基准线向下放置在装有展开剂的层析缸中展开10～15min，直至展开剂扩散至距离薄板顶端1～2cm处。取出薄板，吹干，碘缸中熏蒸2～5min，显色，放入烘箱中，在110℃下烘烤10min左右，即可呈现DHA斑点，采用CAMMA的薄层扫描仪测定DHA含量。

[0041] DHA气相色谱分析方法：所用的仪器：瓦里安varian cp-3800气相色谱仪，带氢火焰离子化检测器；PY-2020iD型裂解器(Frontier LaboratoriesLtd.Japan)。所用试剂：TMAH(25％水溶液)，DHA(色谱纯)，甘油、无水甲醇(分析纯)，蒸馏水。色谱条件：Ultra ALLOY-5不锈钢毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；汽化温度400℃；检测器温度280℃；
柱温50℃开始以1℃/min升至60℃，再以10℃/min升至280℃；分流比30∶1；载气，氮气；柱流量1mL/min。加样：0.2μL发酵上清夜和0.4μLTMAH(25％水溶液)。

[0042] 本发明利用整体细胞作为生物催化剂，结合整体细胞辅酶再生技术，在气搅拌式生物反应器中生产DHA；具有操作简单方便、节能、生产效率高等特点，可适合于工业化大规模生产。(四)附图说明

[0043] 图1为鼓泡塔生物反应器结构示意图；

[0044] 图2为内循环式气升式生物反应器结构示意图；

[0045] 图3为外循环式气升式生物反应器结构示意图。

[0046] (五)具体实施方式

[0047] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

[0048] 实施例1：

[0049] 斜面培养基配方：葡萄糖：20g/L，酵母提取粉：5g/L，琼脂20g/L，用自来水配制，用1.0mol/L的HCl或者1.0mol/L NaOH溶液将pH调到7.0，加热溶解琼脂，121℃灭菌20min后，摆置成斜面，冷却后得到斜面培养基备用。

[0050] 摇瓶液体种子培养基的配方：甘油10mL/L，酵母提取粉2g/L，蛋白胨1g/L，NaH2PO4·2H2O 0.5g/L，溶剂为水，用1.0mol/L的HCl调pH到4.0。

[0051] 将保藏在4℃冰箱中斜面菌株氧化葡糖杆菌CCTCC No：M 208069取出，接种到新配制的斜面培养基中，30℃下，培养24h，将作为斜面种子备用。

[0052] 取600mL摇瓶液体种子培养基，装到12个500mL三角瓶中装入，每个摇瓶装50mL，121℃灭菌20min，将斜面种子接种至500mL三角瓶，30℃、200rpm振荡培养24h，得到种子液，待用。

[0053] 发酵培养基的配方：甘露醇40g/L，酵母提取粉2g/L，蛋白胨1g/L，NaH2PO4·2H2O0.5g/L，溶剂为水，用1.0mol/L的HCl调pH到4.0。

[0054] 按上述发酵培养基配方制备发酵培养基10L，装入15L发酵罐，121℃灭菌20min后。接入种子液500mL，进行菌体培养，培养条件如下：温度30℃，转速250rpm，通风量为0.3vvm，培养过程中采用1.0mol/L的HCl或者1.0mol/LNaOH控制pH为4.0，培养24h。

[0055] 将上述含有菌体的培养液与4％(w/w)海藻酸钠水溶液以等体积比混合，搅拌均匀后，将它滴在体积为培养液体积10倍的1.0％(w/w)CaCl2溶液中，在4℃条件静置12h，凝结成小球状固定化细胞颗粒。用无菌纱布进行过滤得到固定化化细胞，再用无菌水淋洗。用无菌量筒量取约1.8L的固定化细胞，装入无菌的气搅拌鼓泡塔生物反应器，该反应器的总容积为2.0L，高径比为5，装置为玻璃制造，其结构示意图见图1。加入浓度为5g/L甘油水溶液，到总反应体积达到1.9L为止，进行固定化细胞生物催化反应，反应条件如下：通风量为0.3vvm，温度30℃，pH控制在4.0，用1.0mol/L HCl或NaOH调节反应液的pH值，在反应过程中流加甘油，流加速度为8mL/h，流加至总甘油浓度为200g/L。反应48h，放出反应液。再重复进行一批次的固定化细胞生物催化反应，连续反应3批次固定化细胞生物催化反应。

[0056] 然后进行固定化细胞催化活力恢复，加入无菌的液体培养基到气搅拌鼓泡塔生物反应器至总的体积为1.9L，液体培养基的组成如下：甘油30mL/L，酵母提取粉5g/L，其余为水。固定化细胞活力恢复的培养条件如下：30℃下，通风量为0.3vvm，培养24h。

[0057] 固定化细胞经过活力恢复培养后，进行固定化细胞生物催化反应，反应操作同上，连续进行3批次固定化细胞生物催化反应。然后再进行固定化细胞催化活力恢复，这样连续进行3个循环，共进行9批次固定化细胞生物催化反应生产DHA。将各批次的反应液混合，用于提取DHA产品。

[0058] 收集上述反应液1000mL，经过离心(10000×g，10min)之后，上清液浓缩至250mL，在55℃下活性炭脱色30min，然后真空浓缩至浆状，加入适量无水乙醇混匀，真空浓缩去乙醇，反复加入乙醇三次，浓缩至无乙醇为止，浓缩物备用。

[0059] 上述浓缩物通过装有100～200目硅胶的吸附层析柱分离浓缩物中的DHA和甘油，采用95∶5的乙酸乙酯-乙醇混合溶剂为流动相，使用石油醚湿法装柱，在高径比35∶1，洗脱流速2mL/min，加样量为柱床体积5％时，其浓缩物中甘油和DHA分离效果较好。收集含DHA段样品，进行真空浓缩，在95∶5的乙酸乙酯-乙醇溶液中获得白色DHA结晶，冷冻干燥后得到81.6g DHA。

[0060] 实施例2：

[0061] 斜面培养基配方：葡萄糖：20g/L，酵母提取粉：5g/L，琼脂20g/L，用自来水配制，用1.0mol/L的HCl或者1.0mol/L NaOH溶液将pH调到7.0，加热溶解琼脂，121℃灭菌20min后，摆置成斜面，冷却后得到斜面培养基备用。

[0062] 摇瓶液体种子培养基的配方：甘油50mL/L，酵母提取粉20g/L，蛋白胨20g/L，NaH2PO4·2H2O 2g/L，溶剂为水，用1.0mol/L的HCl或者1.0mol/L NaOH调节pH至7.0。

[0063] 将保藏在4℃冰箱中斜面菌株氧化葡糖杆菌CCTCC No：M 208069取出，接种到新配制的斜面培养基中，30℃下，培养24h，将作为斜面种子备用。

[0064] 取600mL摇瓶液体种子培养基，分装到12个500mL三角瓶中装入，每个500mL三角瓶中装50mL。121℃灭菌20min，将斜面种子接种至500mL三角瓶，30℃、100rpm振荡培养60h，得到种子液，待用。

[0065] 发酵培养基的配方：甘露醇100g/L，酵母提取粉20g/L，蛋白胨20g/L，NaH2PO4·2H2O 2g/L，溶剂为水，用1.0mol/L的HCl或者1.0mol/LNaOH调节pH至7.0。

[0066] 按上述发酵培养基配方制备发酵培养基10L，装入15L发酵罐，121℃灭菌20min后。接入种子液500mL，进行菌体培养，培养条件如下：温度30℃，转速250rpm，通风量为1.5vvm，培养过程中采用1.0mol/L的HCl或者1.0mol/L NaOH控制pH为7.0，培养32h。

[0067] 将上述含有菌体的培养液与4％海藻酸钠水溶液以等体积比混合，搅拌均匀，然后将它滴在1.0％CaCl2溶液中，在4℃条件静止12h，凝结成小球状固定化细胞。用无菌纱布进行过滤固定化化细胞，再用无菌水淋洗。用无菌量筒量取约1.8L的固定化细胞，装入无菌的内循环式气升式生物反应器中，该反应器的总容积为2.0L，高径比为5，装置为玻璃制造，其结构示意图见图2。加入浓度为30g/L的甘油溶液，到总反应体积达到1.9L为止，进行固定化细胞生物催化反应生产DHA，反应条件如下：通风量为3.0vvm，温度30℃，pH控制在7.0，用1.0mol/L HCl或NaOH调节反应液的pH值。在反应进行12h后，开始流加甘油，流加速度为7mL/h，流加至总甘油浓度为300g/L。反应96h，排出反应液，再重复进行一批次的反应，连续反应3批次。

[0068] 然后进行固定化细胞催化活力恢复，加入无菌的液体培养基到内循环式气升式生物反应器至总体积为1.9L，液体培养基的组成如下：甘油30mL/L，酵母提取粉5g/L，其余为水。固定化细胞活力恢复的培养条件如下：30℃下，通风量为1.5vvm，培养24h。

[0069] 固定化细胞经过活力恢复培养后，进行固定化细胞生物催化反应，反应操作同上，连续进行3批次固定化细胞生物催化反应。然后再进行固定化细胞催化活力恢复，这样连续进行5个循环，共进行15批次固定化细胞生物催化反应生产DHA。将各批次的反应液混合，用于提取DHA产品。

[0070] 收集上述发酵液1000mL，按实例1步骤进行分离纯化，得到130.4gDHA。

[0071] 实施例3：

[0072] 斜面培养基配方：葡萄糖：20g/L，酵母提取粉：5g/L，琼脂20g/L，用自来水配制，用1.0mol/L的HCl或者1.0mol/L NaOH溶液将pH调到7.0，加热溶解琼脂，121℃灭菌20min后，摆置成斜面，冷却后得到斜面培养基备用。

[0073] 摇瓶液体种子培养基的配方：甘油20mL/L，酵母提取粉10g/L，蛋白胨8g/L，NaH2PO4·2H2O 0.8g/L，溶剂为水，用1.0mol/L的HCl或者1.0mol/LNaOH调节pH至6.0。

[0074] 将保藏在4℃冰箱中斜面菌株氧化葡糖杆菌CCTCC No：M 208069取出，接种到新配制的斜面培养基中，30℃下，培养24h，将作为斜面种子备用。

[0075] 取600mL摇瓶液体种子培养基，分装到12个500mL三角瓶中装入，每个500mL三角瓶中装50mL。121℃灭菌20min，将斜面种子接种至500mL三角瓶，30℃、120rpm振荡培养30h，得到种子液，待用。

[0076] 发酵培养基的配方：甘露醇60g/L，酵母提取粉10g/L，蛋白胨10g/L，NaH2PO4·2H2O1g/L，溶剂为水，用1.0mol/L的HCl或者1.0mol/L NaOH调节pH至6.0。

[0077] 按上述发酵培养基配方制备发酵培养基10L，装入15L发酵罐，121℃灭菌20min后。接入种子液500mL，进行菌体培养，培养条件如下：温度30℃，转速250rpm，通风量为1.0vvm，培养过程中采用1.0mol/L的HCl或者1.0mol/LNaOH控制pH为6.5，培养28h；

[0078] 将上述的菌悬液1.9L装入无菌的内循环式气升式生物反应器中，该反应器的总容积为2.0L，高径比为5，加入约10mL甘油，反应初始甘油浓度为5g/L。进行游离细胞生物催化反应，反应条件如下：通风量为3.0vvm，温度30℃，pH控制在7.0，用1.0mol/L HCl或NaOH调节反应液的pH值，在反应开始流加甘油，流加速度为10mL/h，流加量为总甘油浓度为250g/L。反应87h后进行固液分离，固液分离的方法为将含有菌体细胞的反应液在10000r/min条件下，离心10min。上清液用于提取DHA产品，将菌体重新装入内循环式气升式生物反应器，进行游离细胞催化反应生产DHA，反应条件同上一批次，连续反应3批次。

[0079] 然后进行游离细胞催化活力恢复，将菌体细胞和1.9L无菌的液体培养基加入到气搅拌生物反应器，液体培养基的组成如下：甘油30mL/L，酵母提取粉5g/L，其余为水。游离细胞活力恢复的培养条件如下：30℃下，通风量为1.5vvm，培养24h。

[0080] 游离细胞经过活力恢复培养后，再进行游离细胞生物催化反应，反应操作同上，连续进行3批次游离细胞生物催化反应。然后再进行游离细胞催化活力恢复，这样连续进行5个循环，共进行15批次游离细胞生物催化反应生产DHA。将各批次的反应液混合，用于提取DHA产品。

[0081] 收集上述发酵液1000mL，按实例1步骤进行分离纯化，得到150.3gDHA。

[0082] 实施例4：

[0083] 斜面培养基配方：葡萄糖：20g/L，酵母提取粉：5g/L，琼脂20g/L，用自来水配制，用1.0mol/L的HCl或者1.0mol/L NaOH溶液将pH调到7.0，加热溶解琼脂，121℃灭菌20min后，摆置成斜面，冷却后得到斜面培养基备用。

[0084] 摇瓶液体种子培养基的配方：甘油30mL/L，酵母提取粉10g/L，蛋白胨8g/L，NaH2PO4·2H2O 1.2g/L，溶剂为水，用1.0mol/L的HCl或者1.0mol/LNaOH调节pH至5.0。

[0085] 将保藏在4℃冰箱中斜面菌株氧化葡糖杆菌CCTCC No：M 208069取出，接种到新配制的斜面培养基中，30℃下，培养24h，将作为斜面种子备用。

[0086] 取600mL摇瓶液体种子培养基，分装到12个500mL三角瓶中，每个500mL三角瓶中装50mL。121℃灭菌20min，将斜面种子接种至500mL三角瓶，30℃、200rpm振荡培养24h，得到种子液，待用。

[0087] 发酵培养基的配方：甘露醇40g/L，酵母提取粉10g/L，蛋白胨10g/L，NaH2PO4·2H2O1g/L，溶剂为水，用1.0mol/L的HCl或者1.0mol/L NaOH调节pH至6.0。

[0088] 按上述发酵培养基配方制备发酵培养基10L，装入15L发酵罐，121℃灭菌20min后。接入种子液500mL，进行菌体培养，培养条件如下：温度30℃，转速250rpm，通风量为1.5vvm，培养过程中采用1.0mol/L的HCl或者1.0mol/L NaOH控制pH为5.0，培养24h。

[0089] 将上述含有菌体的培养液1.9L装入无菌的鼓泡塔式生物反应器中，该反应器的总容积为2.0L，高径比为5，加入约10mL甘油，反应初始的甘油浓度为5g/L。进行游离细胞生物催化反应，反应条件如下：通风量为2.0vvm，温度30℃，在反应开始就流加甘油，流加速度为20mL/h，流加至总甘油浓度为220g/L。反应30h后进行固液分离，固液分离的方法为将含有菌体细胞的反应液进行在10000r/min条件下，离心10min。上清液用于提取DHA产品，菌体重新装入内循环式气升式生物反应器，重复进行酶催化反应，反应条件同上一批次，连续反应3批次。

[0090] 然后进行游离细胞催化活力恢复，将菌体细胞和1.9L无菌的液体培养基加入到气搅拌生物反应器，液体培养基的组成如下：甘油30mL/L，酵母提取粉5g/L，其余为水。游离细胞活力恢复培养条件如下：30℃下，通风量为1.5vvm，培养24h。

[0091] 游离细胞经过活力恢复培养后，再进行游离细胞生物催化反应，反应操作同上，连续进行3批次游离细胞生物催化反应。然后再进行游离细胞催化活力恢复，这样连续进行5个循环，共进行15批次游离细胞生物催化反应生产DHA。将各批次的反应液混合，用于提取DHA产品。

[0092] 收集上述发酵液1000mL，按实例1步骤进行分离纯化，冷冻干燥后得到125.4g DHA。

[0093] 实施例5：

[0094] 斜面培养基配方：葡萄糖：20g/L，酵母提取粉：5g/L，琼脂20g/L，用自来水配制，用1.0mol/L的HCl或者1.0mol/L NaOH溶液将pH调到7.0，加热溶解琼脂，121℃灭菌20min后，摆置成斜面，冷却后得到斜面培养基备用。

[0095] 摇瓶液体种子培养基的配方：甘油30mL/L，酵母提取粉10g/L，蛋白胨8g/L，NaH2PO4·2H2O 1.2g/L，溶剂为水，用1.0mol/L的HCl或者1.0mol/LNaOH调节pH至5.0。

[0096] 将保藏在4℃冰箱中斜面菌株氧化葡糖杆菌CCTCC No：M 208069取出，接种到新配制的斜面培养基中，30℃下，培养24h，将作为斜面种子备用。

[0097] 取500mL摇瓶液体种子培养基，分装到10个500mL三角瓶中装入，每个500mL三角瓶中装50mL。121℃灭菌20min，将斜面种子接种至500mL三角瓶，30℃、200rpm振荡培养24h，得到种子液，待用。

[0098] 发酵培养基的配方：甘露醇80g/L，酵母提取粉10g/L，蛋白胨10g/L，NaH2PO4·2H2O1g/L，溶剂为水，用1.0mol/L的HCl或者1.0mol/L NaOH调节pH至6.0。

[0099] 按上述发酵培养基配方制备发酵培养基10L，实罐灭菌后，接入400mL种子液，进行发酵，发酵条件如下：温度30℃，通风量为1.2vvm，转速250rpm，发酵过程中采用1.0mol/L的HCl或者1.0mol/L NaOH控制pH6.0。发酵60h。

[0100] 按上述发酵培养基配方制备发酵培养基10L，装入15L发酵罐，121℃灭菌20min后。接入种子液500mL，进行菌体培养，培养条件如下：温度30℃，转速250rpm，通风量为1.5vvm，培养过程中采用1.0mol/L的HCl或者1.0mol/L NaOH控制pH为5.0，培养24h。

[0101] 将上述的含有菌体的培养液9L装入无菌的外循环气升式生物反应器中，该反应器的总容积为11.5L，上升管与下降管的直径比(D/d)为6.6，罐体高径比(H/D)为2.9，罐内可加装筛板，形成带筛板的外循环气升式生物反应器，装置用不锈钢制造，通风量、温度可调节控制，溶氧可自动检测，其结构示意图见图3。加入45mL甘油。进行游离细胞生物催化反应，反应条件如下：通风量为2.0vvm，温度30℃，pH控制在6.5，1.0mol/L的HCl或者1.0mol/L NaOH控制。反应开始流加甘油，流加速度为50mL/h，流加至总甘油浓度为300g/L。反应30h后进行固液分离，固液分离的方法为将含有菌体细胞的反应液进行在10000r/min条件下，离心10min。上清液用于提取DHA产品，菌体沉淀用0.5％甘油悬浮，重新装入内循环式气升式生物反应器，重复进行酶催化反应，反应条件同上一批次，连续反应3批次。

[0102] 然后进行游离细胞催化活力恢复，将菌体细胞和9L无菌的液体培养基加入到外循环气升式生物反应器，液体培养基的组成如下：甘油30mL/L，酵母提取粉5g/L，其余为水。游离细胞活力恢复培养条件如下：30℃下，通风量为1.5vvm，培养24h。

[0103] 游离细胞经过活力恢复培养后，再进行游离细胞生物催化反应，反应操作同上，连续进行3批次游离细胞生物催化反应。然后再进行游离细胞催化活力恢复，这样连续进行5个循环，共进行15批次游离细胞生物催化反应生产DHA。将各批次的反应液混合，用于提取DHA产品。

[0104] 收集上述发酵液1000mL，按实例1步骤进行分离纯化，冷冻干燥后得到200.4g DHA。