本发明提供一种圆齿野鸦椿叶片高频再生体系建立及快速繁殖方法，属于圆齿野鸦椿胚的栽培技术，解决现有技术中圆齿野鸦椿胚种子发芽率低，不能大量的提供优良纯化的组培苗的问题，本发明其选取茎段繁殖或种子繁殖进行继代转接时去除的部分幼嫩叶片为材料，经过诱导培养，15～20天即可萌发出生长健壮的新芽；再经过20～30天的增殖培养，20～25天诱导生根后即可成苗、移栽，成活率高达95％以上；扩繁系数高，苗木成活后生长健壮，长势良好。
1.一种圆齿野鸦椿叶片高频再生体系的建立及快速繁殖方法，其特征在于：所述方法的具体步骤包括：
1）取材方法：选取圆齿野鸦椿幼嫩叶片为外植体进行接种；
2）培养基的配制：在基本培养基为WPM中分别添加生长激素：ZE、NAA或IBA中的几种，分别配制成芽诱导培养基、丛芽诱导培养基、芽增殖培养基和生根培养基，所述这些培养基+中还加入Su为20g/L，Ag 为7.5g/L，PH值为5.8，附加物为活性炭Ac；所述这些培养基的厚度为1.4～1.6cm；
3) 材料处理：在茎段繁殖或种子繁殖进行继代转接时去除的部分幼嫩叶片直接作为外植体进行接种；
4) 诱导培养：选择叶片，将叶片切成1.5cm×1.5cm大小，接种在所述的芽诱导培养基中；100～150g的芽诱导培养基接种3个胚；所述诱导培养的培养条件：培养室温度为
25±2℃，光照时间12h/d，光照强度1500～2000 Lx；诱导培养的时间15～20天；
5) 丛芽诱导培养：将经过步骤4）诱导培养的生长健壮的诱导芽切成0.5cm长的小块，接种在所述丛芽诱导培养基中；100～150g的丛芽诱导培养基接种3个胚；所述诱导培养的培养条件：培养室温度为25±2℃，光照时间12h/d，光照强度1500～2000 Lx；丛芽诱导培养的时间 15～20天；
6) 增殖培养：将经过步骤5）丛芽诱导培养生长良好的丛芽切割开，接种在芽增殖培养基中；100～150g的增殖培养基接种3个胚；所述增殖培养的培养条件：培养室温度为
25±2℃，光照时间12h/d，光照强度1500～2000 Lx；增殖培养的时间 20～30天；
7) 诱导生根培养：当丛生芽长至2cm高时，将芽分割成单株，转移到所述生根培养基中；100～150g的生根培养基接种3个胚；所述生根培养的培养条件：培养室温度为
25±2℃，光照时间12h/d，光照强度1500～2000 Lx；生根培养的时间 20～25天；
8) 小苗移栽：当试管苗长至3～4cm高，有3～5条根， 5～7片叶片，长度2～3cm时，完成圆齿野鸦椿叶片高频再生体系的建立及快速繁殖试管苗培养；
所述芽诱导培养基为：基本培养基WPM中再加入：ZE 1.0mg/L；NAA 1.0mg/L；Ag
7.5g/L； Su 20g/L和Ac 2～2.5 g/L；
所述丛芽诱导培养基为：基本培养基WPM中再加入：ZE 1.0mg/L；NAA 0.5mg/L；Ag
7.5g/L；Su 20g/L和Ac 2～2.5 g/L；
所述芽增殖培养基为：基本培养基WPM中再加入： ZE 2.0mg/L；NAA 0.3mg/L；Ag
7.5g/L；Su 20g/L和Ac 2～2.5 g/L；
所述生根培养基为：基本培养基1/2WPM中再加入： NAA 0.1mg/L； IBA 0.5mg/L； Ag +
7.5g/L；Su 20g/L和Ac 2～2.5 g/L；
所述基本培养基1/2 WPM是指：WPM中大量元素减半，其余不变。
2.根据权利要求1所述的圆齿野鸦椿叶片高频再生体系的建立及快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤8）中的完成试管苗的圆齿野鸦椿进行移栽，将试管苗放在自然光下炼苗
3～5天后再打开瓶盖先进行炼苗2～4天，以增强试管苗对室外环境的适应能力；然后从培养瓶中取出，洗去根部培养基，移入椰糠和腐殖土的质量比=1∶2混合的基质中，保湿遮阴培养，所述移植的圆齿野鸦椿试管苗成活率达95%以上。
3.根据权利要求1所述的圆齿野鸦椿叶片高频再生体系的建立及快速繁殖方法，其特+征在于：所述培养基中Ag 的来源于AgNO3。
圆齿野鸦椿叶片高频再生体系建立及快速繁殖方法
技术领域
[0001] 本发明属于圆齿野鸦椿胚的栽培技术，更具体涉及一种圆齿野鸦椿叶片高频再生体系建立及快速繁殖方法。
背景技术
[0002] 圆齿野鸦椿为省沽油科野鸦椿属，别名花溴木、秤杆木、淡椿子、开口椒，六十年代由厦门大学生物系徐炳声教授发现的一个新种福建野鸦椿(Euscaphis fukienensis Hsu)，以后也并为该种，是我国特有的观赏树种。夏季开花，冬季结果，果期长，红色的果成熟时沿腹缝线开裂，与其黑色的种子一起，犹如一只美丽栩栩如生的红蝴蝶，极具观赏价值，可作园景树或行道树。挂果时间很长，从外果皮变红到果皮脱落，时间长达半年。因此，可供观赏时间长，是优良的观果树种。其种子含脂肪油25％-30％，可制皂，也可作其它工业用油；树皮可以提烤漆及器具用材。此外，它的根或根皮、花及干果都可供药用，性辛、甘、平，根祛风除湿，健脾，治痢疾、泄泻、疝痛、风湿疼痛、跌打损伤；花镇痛，治头痛眩晕；干果有温重理气、消肿止痛的功效，主治胃痛、寒疝、泻疾、脱肛，对漆过敏疗效甚佳，是一种良好的中草药材。但由于圆齿野鸦椿的种子有外壳坚硬、深休眠的特点，致使育苗时间长、出苗率低，因此很难获得优良的发芽率和更多的健壮苗。赣州市林木种苗站等单位开展了播种育苗方法研究，对种子进行湿沙贮藏催芽，使种子的发芽率提高到51％-65％，但仍无法满足实际生产需要和大面积推广要求，特别是对其进行药用价值开发时，则要求优良纯化的组培苗，这就要求在组培试验时，减少污染，提高成功率，而利用种子或茎段繁殖苗木的叶片进行植株高频再生和快速繁殖恰能满足这个条件，但在专利公开以前没有一个有关圆齿野鸦椿叶片高频再生体系建立及快速繁殖的组织培养的报道，更没有成功的实例。 发明内容
[0003] 本发明的目的是提供一种圆齿野鸦椿叶片高频再生体系建立及快速繁殖的组织培养方法；解决现有技术中圆齿野鸦椿胚种子发芽率低，不能大量的提供优良纯化的组培苗的问题，该方法培养的芽健康、茁壮、增殖时间短、成苗移植后的成活率高。 [0004] 本发明的技术内容如下：
[0005] 1)取材方法：选取圆齿野鸦椿幼嫩叶片为外植体进行接种；
[0006] 2)培养基的配制：在基本培养基为WPM中分别添加生长激素：ZE、NAA或IBA中的几种，分别配置成芽诱导培养基、丛芽诱导培养基、芽增殖培养基和生根培养基，所述这些+培养基 中还加入Su为20g/L，Ag 为7.5g/L，PH值为5.8，附加物为活性炭Ac；所述这些培养基的厚度为1.4～1.6cm；
[0007] 3)材料处理：在茎段繁殖或种子繁殖进行继代转接时去除的部分幼嫩叶片直接作为外植体进行接种。
[0008] 4)诱导培养：选择叶片，将叶片切成1.5cm×1.5cm大小，接种在所述的芽诱导培养基中；100～150g的芽诱导培养基接种3个胚；所述诱导培养的培养条件：培养室温度为25±2℃，光照时间12h/d，光照强度1500～2000Lx；诱导培养的时间15～20天； [0009] 5)丛芽诱导培养：将经过步骤4)诱导培养的生长健壮的诱导芽切成0.5cm长的小块，接种在所述丛芽诱导培养基中；100～150g的丛芽诱导培养基接种3个胚；所述诱导培养的培养条件：培养室温度为25±2℃，光照时间12h/d，光照强度1500～2000Lx；丛芽诱导培养的时间15～20天；
[0010] 6)增殖培养：将经过步骤5)丛芽诱导培养生长良好的丛芽切割开，接种在芽增殖培养基中；100～150g的芽增殖培养基接种3个胚；所述增殖培养的培养条件：培养室温度为25±2℃，光照时间12h/d，光照强度1500～2000Lx；增殖培养的时间20～30天； [0011] 7)诱导生根培养：当丛生芽长至2cm高时，将芽分割成单株，转移到所述生根培养基中；100～150g的生根培养基接种3个胚；所述生根培养的培养条件：培养室温度为25±2℃，光照时间12h/d，光照强度1500～2000Lx；生根培养的时间20～25天； [0012] 8)试管苗完成：当试管苗长至3～4cm高，有3～5条根，5～7片叶片，长度2～
3cm时，完成圆齿野鸦椿叶片高频再生体系的建立及快速繁殖试管苗培养。
[0013] 9)小苗移栽：所述步骤8)中的完成试管苗的圆齿野鸦椿进行移栽，将试管苗放在自然光下炼苗3～5天后再打开瓶盖先进行炼苗2～4天，以增强试管苗对室外环境的适应能力；然后从培养瓶中取出，洗去根部培养基，移入椰糠和腐殖土的(质量比)1∶2混合的基质中，保湿遮阴培养，所述移植的圆齿野鸦椿试管苗成活率达95％以上。 [0014] 本发明的显著优点是：采用本发明方法进行，叶片经过诱导培养，15～20天即可萌发出生长健壮的新芽；再经过20～30天的增殖培养，20～25天诱导生根后即可成苗、移栽，成活率高达95％以上；扩繁系数在18倍以上，苗木成活后生长健壮，长势良好；基本上解决了现有技术中圆齿野鸦椿胚种子发芽率低，不能大量的提供优良纯化的组培苗的问题，具有显著的经济效益。
附图说明
[0015] 图1是离体叶肉栅栏组织直接脱分化产生的不定芽。
[0016] 图2是愈伤组织产生的不定芽。
[0017] 图3是叶片表皮细胞脱分化后形成的胚状体。
[0018] 图4是叶细胞建立的植物体细胞快速无性繁殖体系。
[0019] 图5是叶肉栅栏组织脱分化、胚状体、愈伤组织形成的丛芽。
[0020] 图6是长根后的芽苗。
具体实施方式
[0021] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。
[0022] 实施例1
[0023] 取材方法：选取茎段繁殖或种子繁殖进行继代转接时去除的部分幼嫩叶片直接作为外植体进行接种；
[0024] 培养基：
[0025] MS基本培养基采用1986，北京高等教育出版社出版，陈正华主编的《木本植物组织培养及其应用》中的配方进行配制的。
[0026] 培养基的配制：基本培养基为WPM，加入生长激素为ZE、NAA、IBA，培养基中加入+Su(蔗糖)为20g/L，Ag 为7.5g/L，PH值为5.8，附加物为活性炭Ac等；培养基厚度一般为
1.4～1.6cm；
[0027] 芽 诱 导 培 养 基 → WPM+ZE(1.0mg/L)+NAA(1.0mg/L)+Ag+(7.5g/L)+Su(20g/L)+Ac(2～2.5g/L)
[0028] 丛芽 诱导 培养基 →WPM+ZE(1.0mg/L)+NAA(0.5mg/L)+Ag+(7.5g/L)+Su(20g/L)+Ac(2～2.5g/L)
[0029] 芽 增 殖 培 养 基 →WPM+ZE(2.0mg/L-1)+NAA(0.3mg/L)+Ag+(7.5g/L)+Su(20g/L)+Ac(2～2.5g/L)
[0030] 生 根 培 养 基 →1/2WPM+NAA(0.1mg/L)+IBA(0.5mg/L)+Ag+(7.5g/L)+Su(20g/L)+Ac(2～2.5g/L)
[0031] 这些培养基中Ag+来源于AgNO3。
[0032] 基本培养基1/2 WPM是指：WPM中大量元素减半，其余不变。
[0033] 诱导培养：选择叶片，将叶片切成1.5cm×1.5cm大小，接种在所述的芽诱导培养基中；100～150g的芽诱导培养基接种3个胚；所述诱导培养的培养条件：培养室温度为25±2℃，光照时间12h/d，光照强度1500～2000Lx；诱导培养的时间15～20天； [0034] 丛芽诱导培养：将经过诱导培养的生长健壮的诱导芽切成0.5cm长的小块，接种在所述 从芽诱导培养基中；100～150g的芽诱导培养基接种3个胚；所述诱导培养的培养条件：培养室温度为25±2℃，光照时间12h/d，光照强度1500～2000Lx；丛芽诱导培养的时间15～20天；
[0035] 增殖培养：将经过丛芽诱导培养生长良好的丛芽切割开，接种在芽增殖培养基中；100～150g的芽诱导培养基接种3个胚；所述增殖培养的培养条件：培养室温度为25±2℃，光照时间12h/d，光照强度1500～2000Lx；增殖培养的时间20～30天； [0036] 诱导生根培养：当丛生芽长至2cm高时，将芽分割成单株，转移到所述生根培养基中；100～150g的芽诱导培养基接种3个胚；所述增殖培养的培养条件：培养室温度为
25±2℃，光照时间12h/d，光照强度1500～2000Lx；生根培养的时间20～25天； [0037] 小苗移栽：当试管苗长至3～4cm高，有3～5条根，5～7片叶片，长度2～3cm时，完成圆齿野鸦椿叶片高频再生体系的建立及快速繁殖。
[0038] 完成试管苗的圆齿野鸦椿进行移栽，将试管苗放在自然光下炼苗3～5天后在打开瓶盖先进行炼苗2～4天，以增强试管苗对室外环境的适应能力；然后从培养瓶中取出，洗去根部培养基，移入椰糠和腐殖土的(质量比)1∶2混合的基质中，保湿遮阴培养，所述移植的圆齿野鸦椿试管苗成活率达95％以上。
[0039] 按照以上方法进行，叶片经过诱导培养，15～20天即可萌发出生长健壮的新芽；再经过20～30天的增殖培养，20～25天诱导生根后即可成苗、移栽，成活率高达95％以上；扩繁系数在18倍以上，苗木成活后生长健壮，长势良好。
