一种包封三磷酸腺苷的壳聚糖纳米粒及制备方法转让专利
申请号 : CN200910100449.4
文献号 : CN101596169B
文献日 : 2011-05-04
发明人 : 杜永忠 , 应晓英 , 袁弘 , 胡富强
申请人 : 浙江大学
摘要 :
本发明提供一种包封三磷酸腺苷的壳聚糖纳米粒，其组成为：86-99.5wt％壳聚糖，0-10wt％三磷酸腺苷，0.5-4wt％戊二醛；壳聚糖重均分子量为5000-50000Da，壳聚糖纳米粒的粒径为110nm左右，电位为20mV左右。本发明以具有良好水溶性的低分子量壳聚糖为载体材料，通过亚微乳、表面交联和离子复合技术的联合应用制备包封ATP的壳聚糖纳米粒，实现了ATP从壳聚糖纳米粒中的缓释。本发明通过亚微乳、表面交联固化和离子复合技术的联合应用，将三磷酸腺苷以细小的纳米粒的形式包封于经交联的壳聚糖纳米粒网络结构中，从而实现壳聚糖纳米粒对水溶性低分子量药物-三磷酸腺苷的缓释。
权利要求 :
1.一种包封三磷酸腺苷的壳聚糖纳米粒，其组成的重量百分比为：86-99.5％壳聚糖，2.41-10％三磷酸腺苷，0.5-4％戊二醛，所有成分之和为100％；壳聚糖重均分子量为
5000-50000Da，壳聚糖纳米粒的粒径为110纳米，电位为20毫伏。
2.一种包封三磷酸腺苷的壳聚糖纳米粒的制备方法，其特作在于，通过以下步骤实现：(1)分别称取100-200mg壳聚糖、10-20mg三磷酸腺苷和吐温80 100mg溶于pH 7.4的PBS缓冲液中，400rpm磁力搅拌后作为水相，配置重量体积比为1％司盘80正己烷溶液
90ml作为油相，在400rpm磁力搅拌条件下将水相缓慢滴加到油相后，在400rpm条件下继续搅拌10分钟后，采用探头超声20次，制备得到W/O型亚微乳；
(2)在上述得到的亚微乳中加入0.005-0.04ml 25％戊二醛溶液，于电热恒温水槽中固化反应6小时后，加入盐酸调至pH 5，400rpm磁力搅拌10分钟，得到包封三磷酸腺苷的壳聚糖纳米粒分散液，将分散液低温离心，去除上清液，重新分散于20ml石油醚中，再低温离心，重复3次，洗去表面活性剂后，分散于去离子水中，冷冻干燥制备得到包封三磷酸腺苷的壳聚糖纳米粒；
所述壳聚糖重均分子量为5000-50000Da，壳聚糖纳米粒的粒径为110纳米，电位为20毫伏。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特作在于，步骤(2)所述固化反应是60℃恒温
400rpm搅拌。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特作在于，步骤(2)所述低温离心条件为4℃，
21000rpm/，25分钟。
说明书 :
一种包封三磷酸腺苷的壳聚糖纳米粒及制备方法
发明领域
[0001] 本发明涉及壳聚糖纳米粒及其制备方法、具体为包封低分子水溶性药物三磷酸腺苷的壳聚糖纳米粒以及纳米粒的制备方法。
背景技术
[0002] 在过去的几十年里，随着药学、生命科学、高分子材料学等学科的飞速发展，药剂学的发展也日新月异，取得了令人瞩目的进步，药物制剂已经从普通制剂发展到靶向制剂阶段，并且应用于临床诊断与治疗。
[0003] 近年来磁共振波谱技术(magnetic resonance sectroscopy，MRS)已越来越多地用于临床研究。使用该技术能无创性检测体内组织器官的生化成分和能量代谢的变化。它是疾病诊断、治疗和随访的一项新的检查和监测手段。磁共振波谱分析(MRS)是近年磁共振(MR)成像最主要的进展之一。MRS是一种新近发展起来的功能磁共振成像，是影像学诊断模式一次质的飞跃，具有广阔的应用前景。该方法利用受检部位发生病变前后某一或多种化合物含量的变化，通过其MRS波峰的变化而达到诊断疾病的目的。在临床研究和诊断中，MRS可以无创地进行在体和离体生物医学研究，进行定性或者定量评估组织内的代谢物构成及浓度水平，其测定结果可以反映被研究对象的生化、生理改变。不过，影响MRS结果准确性的因素却非常复杂，可以归结在两个方面：一是MRS数据的采集；二是MRS采集数据的处理。
[0004] 以肝31P-MRS检查为例，该方法是通过研究肝能量代谢水平(通过磷化物的代谢实现)的变化已达到诊断肝脏疾病的目的。但由于正常肝组织与肝病组织之间、不同肝病之间或同一肝病不同时期之间的PME、PDE、Pi、ATP含量差异或变化不大，所以难以应用于临床。将肝组织靶向方法引入测量磷化物，可放大这一差异，使MRS应用于诊断肝脏疾病及预后判断。
[0005] 靶向方法作为分子影像研究最重要方法之一，近年来在各个研究领域均取得显著成果。磁共振成像(MRI)分子影像使分子影像学研究领域重要组成部分，MRI靶向成像是将墨一种带有顺磁性物质如超磁性氧化铁(SPIO)、轧喷替酸葡甲胺(gadolinium)等，通过某种载体选择性积聚于特定组织器官或病变组织，改变了MR T1EI、T2WI或T*2WI驰豫时间，是特定组织器官或病变组织的MRI信号发生明显改变，从而实现MRI靶向分子成像，并得到更明确的疾病诊断和更可靠的预后评价。
[0006] MRS成像原理与MRI成像有明显的相似之处，MRI靶向分子成像研究成功和临床的广泛应用，也为MRS的成功靶向成像的实现提供重要理论与经验。MRS成像是通过多种特定化合物的波峰信号强度，反映其含量水平而达到诊断疾病的目的。根据MRI靶向成像原理推论，改变该组织MRS图像上某一种或多种化合物的波峰特征，就能实现MRS靶向分子成像31
的目的。就肝 P-MRS靶向成像而言，要改变波峰特征，只有把向性改变肝组织内PME、PDE、Pi和ATP的其中一种或多种含量水平才能实现。
的目的。就肝 P-MRS靶向成像而言，要改变波峰特征，只有把向性改变肝组织内PME、PDE、Pi和ATP的其中一种或多种含量水平才能实现。
[0007] 在生物化学中，三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)是一种核苷酸，作为细胞内能量传递的“分子通货”，储存和传递化学能。ATP在核酸合成中也具有重要作用。ATP由腺苷和三个磷酸基所组成，分子式C10H16N5O13P3，分子量507.184。三个磷酸基团从腺苷开始被编为α、β和γ磷酸基。ATP的化学名称为5′-三磷酸-9-β-D-呋喃核糖基腺嘌呤，或者5′-三磷酸-9-β-D-呋喃核糖基-6-氨基嘌呤。ATP的立体结构ATP可通过多种细胞途径产生，最典型的如在线粒体中通过氧化磷酸化由ATP合成酶合成，或者在植物的叶绿体中通过光合作用合成。ATP合成的主要能源为葡萄糖和脂肪酸。每分子葡萄糖先在胞液中产生2分子丙酮酸同时产生2分子ATP，最终在线粒体中通过三羧酸循环产生最多36分子ATP。人体中ATP的总量只有大约0.1摩尔。人体细胞每天的能量需要水解
200-300摩尔的ATP，这意味着每个ATP分子每天要被重复利用2000-3000次。ATP不能被储存，因为ATP的合成后必须在短时间内被消耗，如果将ATP作成某种靶向制剂并提高其稳定性，这将是一件很有意义的事情。
200-300摩尔的ATP，这意味着每个ATP分子每天要被重复利用2000-3000次。ATP不能被储存，因为ATP的合成后必须在短时间内被消耗，如果将ATP作成某种靶向制剂并提高其稳定性，这将是一件很有意义的事情。
[0008] 为了实现肝31P-MRS靶向成像，构建经ATP标记的肝细胞靶向纳米载体，将ATP释放入肝细胞内，增加肝细胞内的ATP含量，从而实现改变ATP波峰特征的目标。目前肝靶向给药系统的研究一般采用微粒被网状内皮细胞所吞噬的被动靶向法和基于肝细胞表面受体识别的主动靶向法。被动靶向主要依赖于微粒的大小及表面性质等，而主动靶向则是利用药物或载体分子和受体的特异性配体问的识别。壳聚糖(chitosan，CSO)是一种来自壳多糖脱乙酰作用的天然多糖，是一类由氨基葡萄糖组成的阳离子聚合物，具有低毒性和生物兼容性。研究发现，壳聚糖及其衍生物对生物大分子药物具有保护作用，以该类聚合物为载体制备的多肽、蛋白质、核酸类药物的口服制剂已成为该类药物的研究热点，近年来已广泛应用于携带质粒DNA的基因治疗研究。低分子量壳聚糖不存在难以被消化道吸收而在人体内蓄积的问题，因此，研究低分子量壳聚糖作为药物载体材料具有非常重要的意义。
[0009] ATP为水溶性低分子量药物，要实现ATP的肝靶向分布，必须减少包封ATP的纳米粒在体内转运过程中的药物泄漏，实现纳米粒对ATP的缓释。然而水溶性低分子量药物的缓释是当前药物制剂研究中的一大难点之一。
发明内容
[0010] 为了提高三磷酸腺苷在体内的靶向分布，本发明的目的是提供一种包封三磷酸腺苷的壳聚糖纳米粒，其重量百分比组成为：86-99.5％壳聚糖，0-10％三磷酸腺苷，0.5-4wt％戊二醛；壳聚糖重均分子量为5000-50000Da，壳聚糖纳米粒的粒径为110纳米(nm)，电位为20毫伏(mV)。
[0011] 本发明的另一个目的是提供上述包封三磷酸腺苷的壳聚糖纳米粒的制备方法，通过以下步骤实现：
[0012] 1.分别精密称取100-200mg壳聚糖、0-20mg三磷酸腺苷(ATP)和吐温80(Tween80)100mg溶于10ml的PBS缓冲液中(pH 7.4)，磁力高速(400rpm)搅拌10min作为水相。
配置1％司盘80(span 80)(w/v)正己烷(n-hexane)溶液90ml作为油相。在400rpm磁力搅拌条件下将水相缓慢滴加到油相后，在400rpm条件下继续搅拌10min后，采用探头超声
20次(工作2s，停3s，600w)，制备得到W/O型亚微乳。
配置1％司盘80(span 80)(w/v)正己烷(n-hexane)溶液90ml作为油相。在400rpm磁力搅拌条件下将水相缓慢滴加到油相后，在400rpm条件下继续搅拌10min后，采用探头超声
20次(工作2s，停3s，600w)，制备得到W/O型亚微乳。
[0013] 2.在制备得到的亚微乳中加入0.005-0.04ml 25％戊二醛溶液，于电热恒温水槽中固化反应6h(恒温搅拌(60℃，400rpm))后，加入盐酸调pH至弱酸性(pH为5)，400rpm磁力搅拌10min，制备得到包封ATP的壳聚糖纳米粒分散液。将制得包封ATP的壳聚糖纳米粒分散液低温离心(4℃，21000rpm/，25min)，去除上清液，重新分散于20ml石油醚中，重新低温离心(4℃，21000rpm/，25min)，重复3次，洗去表面活性剂后，分散于去离子水中，冷冻干燥制备得到包封ATP的壳聚糖纳米粒。
[0014] 本发明以具有良好水溶性的低分子量壳聚糖为载体材料，通过亚微乳、表面交联和离子复合技术的联合应用制备包封ATP的壳聚糖纳米粒，实现了ATP从壳聚糖纳米粒中的缓释。本发明通过亚微乳、表面交联固化和离子复合技术的联合应用，将三磷酸腺苷以细小的纳米粒的形式包封于经交联的壳聚糖纳米粒网络结构中，从而实现壳聚糖纳米粒对水溶性低分子量药物-三磷酸腺苷的缓释。
附图说明
[0015] 图1包封三磷酸腺苷的壳聚糖纳米粒的药物体外释放。
[0016] 图2三磷酸腺苷释放前后的壳聚糖纳米粒透射电镜照片，(A)释放前，(B)释放后。
具体实施方式
[0017] 本发明结合附图和实施例作进一步的说明。但本发明并不局限于这些实施例。
[0018] 一、包封三磷酸腺苷的壳聚糖纳米粒的制备
[0019] 实施例1
[0020] 精密称取100mg重均分子量为5000Da的壳聚糖、10mg三磷酸腺苷(ATP)和吐温80(Tween 80)100mg溶于10ml的PBS缓冲液中(pH 7.4)，磁力高速(400rpm)搅拌10min作为水相。配置1％司盘80(span 80)(w/v)正己烷(n-hexane)溶液90ml作为油相。在
400rpm磁力搅拌条件下将水相缓慢滴加到油相后，在400rpm条件下继续搅拌10min后，采用探头超声20次(工作2s，停3s，600w)，制备得到W/O型亚微乳。
400rpm磁力搅拌条件下将水相缓慢滴加到油相后，在400rpm条件下继续搅拌10min后，采用探头超声20次(工作2s，停3s，600w)，制备得到W/O型亚微乳。
[0021] 在制备得到的亚微乳中加入0.04ml 25％戊二醛溶液，于电热恒温水槽中固化反应6h(恒温搅拌(60℃，400rpm))后，加入盐酸调pH至弱酸性(pH为5)，400rpm磁力搅拌10min，制备得到包封ATP的壳聚糖纳米粒分散液。将制得包封ATP的壳聚糖纳米粒分散液低温离心(4℃，21000rpm/，25min)，去除上清液，重新分散于20ml石油醚中，重新低温离心(4℃，21000rpm/，25min)，重复3次，洗去表面活性剂后，分散于去离子水中，冷冻干燥制备得到包封ATP的壳聚糖纳米粒。
[0022] 实施例2
[0023] 精密称取100mg重均分子量为50000Da的壳聚糖、10mg三磷酸腺苷(ATP)和吐温80(Tween 80)100mg溶于10ml的PBS缓冲液中(pH 7.4)，磁力高速(400rpm)搅拌10min作为水相。配置1％司盘80(span 80)(w/v)正己烷(n-hexane)溶液90ml作为油相。在
400rpm磁力搅拌条件下将水相缓慢滴加到油相后，在400rpm条件下继续搅拌10min后，采用探头超声20次(工作2s，停3s，600w)，制备得到W/O型亚微乳。
400rpm磁力搅拌条件下将水相缓慢滴加到油相后，在400rpm条件下继续搅拌10min后，采用探头超声20次(工作2s，停3s，600w)，制备得到W/O型亚微乳。
[0024] 在制备得到的亚微乳中加入0.017ml 25％戊二醛溶液，于电热恒温水槽中固化反应6h(恒温搅拌(60℃，400rpm))后，加入盐酸调pH至弱酸性(pH为5)，400rpm磁力搅拌10min，制备得到包封ATP的壳聚糖纳米粒分散液。将制得包封ATP的壳聚糖纳米粒分散液低温离心(4℃，21000rpm/，25min)，去除上清液，重新分散于20ml石油醚中，重新低温离心(4℃，21000rpm/，25min)，重复3次，洗去表面活性剂后，分散于去离子水中，冷冻干燥制备得到包封ATP的壳聚糖纳米粒。
[0025] 实施例3
[0026] 精密称取100mg重均分子量为18000Da的壳聚糖、10mg三磷酸腺苷(ATP)和吐温80(Tween 80)100mg溶于10ml的PBS缓冲液中(pH 7.4)，磁力高速(400rpm)搅拌10min作为水相。配置1％司盘80(span 80)(w/v)正己烷(n-hexane)溶液90ml作为油相。在
400rpm磁力搅拌条件下将水相缓慢滴加到油相后，在400rpm条件下继续搅拌10min后，采用探头超声20次(工作2s，停3s，600w)，制备得到W/O型亚微乳。
400rpm磁力搅拌条件下将水相缓慢滴加到油相后，在400rpm条件下继续搅拌10min后，采用探头超声20次(工作2s，停3s，600w)，制备得到W/O型亚微乳。
[0027] 在制备得到的亚微乳中加入0.01ml 25％戊二醛溶液，于电热恒温水槽中固化反应6h(恒温搅拌(60℃，400rpm))后，加入盐酸调pH至弱酸性(pH为5)，400rpm磁力搅拌10min，制备得到包封ATP的壳聚糖纳米粒分散液。将制得包封ATP的壳聚糖纳米粒分散液低温离心(4℃，21000rpm/，25min)，去除上清液，重新分散于20ml石油醚中，重新低温离心(4℃，21000rpm/，25min)，重复3次，洗去表面活性剂后，分散于去离子水中，冷冻干燥制备得到包封ATP的壳聚糖纳米粒。
[0028] 实施例4
[0029] 精密称取150mg重均分子量为18000Da的壳聚糖、10mg三磷酸腺苷(ATP)和吐温80(Tween 80)100mg溶于10ml的PBS缓冲液中(pH 7.4)，磁力高速(400rpm)搅拌10min作为水相。配置1％司盘80(span 80)(w/v)正己烷(n-hexane)溶液90ml作为油相。在
400rpm磁力搅拌条件下将水相缓慢滴加到油相后，在400rpm条件下继续搅拌10min后，采用探头超声20次(工作2s，停3s，600w)，制备得到W/O型亚微乳。
400rpm磁力搅拌条件下将水相缓慢滴加到油相后，在400rpm条件下继续搅拌10min后，采用探头超声20次(工作2s，停3s，600w)，制备得到W/O型亚微乳。
[0030] 在制备得到的亚微乳中加入0.016ml 25％戊二醛溶液，于电热恒温水槽中固化反应6h(恒温搅拌(60℃，400rpm))后，加入盐酸调pH至弱酸性(pH为5)，400rpm磁力搅拌10min，制备得到包封ATP的壳聚糖纳米粒分散液。将制得包封ATP的壳聚糖纳米粒分散液低温离心(4℃，21000rpm/，25min)，去除上清液，重新分散于20ml石油醚中，重新低温离心(4℃，21000rpm/，25min)，重复3次，洗去表面活性剂后，分散于去离子水中，冷冻干燥制备得到包封ATP的壳聚糖纳米粒。
[0031] 实施例5
[0032] 精密称取200mg重均分子量为18000Da的壳聚糖、10mg三磷酸腺苷(ATP)和吐温80(Tween 80)100mg溶于10ml的PBS缓冲液中(pH 7.4)，磁力高速(400rpm)搅拌10min作为水相。配置1％司盘80(span 80)(w/v)正己烷(n-hexane)溶液90ml作为油相。在
400rpm磁力搅拌条件下将水相缓慢滴加到油相后，在400rpm条件下继续搅拌10min后，采用探头超声20次(工作2s，停3s，600w)，制备得到W/O型亚微乳。
400rpm磁力搅拌条件下将水相缓慢滴加到油相后，在400rpm条件下继续搅拌10min后，采用探头超声20次(工作2s，停3s，600w)，制备得到W/O型亚微乳。
[0033] 在制备得到的亚微乳中加入0.02ml 25％戊二醛溶液，于电热恒温水槽中固化反应6h(恒温搅拌(60℃，400rpm))后，加入盐酸调pH至弱酸性(pH为5)，400rpm磁力搅拌10min，制备得到包封ATP的壳聚糖纳米粒分散液。将制得包封ATP的壳聚糖纳米粒分散液低温离心(4℃，21000rpm/，25min)，去除上清液，重新分散于20ml石油醚中，重新低温离心(4℃，21000rpm/，25min)，重复3次，洗去表面活性剂后，分散于去离子水中，冷冻干燥制备得到包封ATP的壳聚糖纳米粒。
[0034] 实施例6
[0035] 精密称取100mg重均分子量为18000Da的壳聚糖、10mg三磷酸腺苷(ATP)和吐温80(Tween 80)100mg溶于10ml的PBS缓冲液中(pH 7.4)，磁力高速(400rpm)搅拌10min作为水相。配置1％司盘80(span 80)(w/v)正己烷(n-hexane)溶液90ml作为油相。在
400rpm磁力搅拌条件下将水相缓慢滴加到油相后，在400rpm条件下继续搅拌10min后，采用探头超声20次(工作2s，停3s，600w)，制备得到W/O型亚微乳。
400rpm磁力搅拌条件下将水相缓慢滴加到油相后，在400rpm条件下继续搅拌10min后，采用探头超声20次(工作2s，停3s，600w)，制备得到W/O型亚微乳。
[0036] 在制备得到的亚微乳中加入0.005ml 25％戊二醛溶液，于电热恒温水槽中固化反应6h(恒温搅拌(60℃，400rpm))后，加入盐酸调pH至弱酸性(pH为5)，400rpm磁力搅拌10min，制备得到包封ATP的壳聚糖纳米粒分散液。将制得包封ATP的壳聚糖纳米粒分散液低温离心(4℃，21000rpm/，25min)，去除上清液，重新分散于20ml石油醚中，重新低温离心(4℃，21000rpm/，25min)，重复3次，洗去表面活性剂后，分散于去离子水中，冷冻干燥制备得到包封ATP的壳聚糖纳米粒。
[0037] 实施例7
[0038] 精密称取100mg重均分子量为18000Da的壳聚糖、10mg三磷酸腺苷(ATP)和吐温80(Tween 80)100mg溶于10ml的PBS缓冲液中(pH 7.4)，磁力高速(400rpm)搅拌10min作为水相。配置1％司盘80(span 80)(w/v)正己烷(n-hexane)溶液90ml作为油相。在
400rpm磁力搅拌条件下将水相缓慢滴加到油相后，在400rpm条件下继续搅拌10min后，采用探头超声20次(工作2s，停3s，600w)，制备得到W/O型亚微乳。
400rpm磁力搅拌条件下将水相缓慢滴加到油相后，在400rpm条件下继续搅拌10min后，采用探头超声20次(工作2s，停3s，600w)，制备得到W/O型亚微乳。
[0039] 在制备得到的亚微乳中加入0.016ml 25％戊二醛溶液，于电热恒温水槽中固化反应6h(恒温搅拌(60℃，400rpm))后，加入盐酸调pH至弱酸性(pH为5)，400rpm磁力搅拌10min，制备得到包封ATP的壳聚糖纳米粒分散液。将制得包封ATP的壳聚糖纳米粒分散液低温离心(4℃，21000rpm/，25min)，去除上清液，重新分散于20ml石油醚中，重新低温离心(4℃，21000rpm/，25min)，重复3次，洗去表面活性剂后，分散于去离子水中，冷冻干燥制备得到包封ATP的壳聚糖纳米粒。
[0040] 实施例8
[0041] 精密称取100mg重均分子量为18000Da的壳聚糖和吐温80(Tween 80)100mg溶于10ml的PBS缓冲液中(pH 7.4)，磁力高速(400rpm)搅拌10min作为水相。配置1％司盘80(span 80)(w/v)正己烷(n-hexane)溶液90ml作为油相。在400rpm磁力搅拌条件下将水相缓慢滴加到油相后，在400rpm条件下继续搅拌10min后，采用探头超声20次(工作2s，停3s，600w)，制备得到W/O型亚微乳。
[0042] 在制备得到的亚微乳中加入0.016ml 25％戊二醛溶液，于电热恒温水槽中固化反应6h(恒温搅拌(60℃，400rpm))后，加入盐酸调pH至弱酸性(pH为5)，400rpm磁力搅拌10min，制备得到包封ATP的壳聚糖纳米粒分散液。将制得包封ATP的壳聚糖纳米粒分散液低温离心(4℃，21000rpm/，25min)，去除上清液，重新分散于20ml石油醚中，重新低温离心(4℃，21000rpm/，25min)，重复3次，洗去表面活性剂后，分散于去离子水中，冷冻干燥制备得到包封ATP的壳聚糖纳米粒。
[0043] 实施例9
[0044] 精密称取100mg重均分子量为18000Da的壳聚糖、20mg三磷酸腺苷(ATP)和吐温80(Tween 80)100mg溶于10ml的PBS缓冲液中(pH 7.4)，磁力高速(400rpm)搅拌10min作为水相。配置1％司盘80(span 80)(w/v)正己烷(n-hexane)溶液90ml作为油相。在
400rpm磁力搅拌条件下将水相缓慢滴加到油相后，在400rpm条件下继续搅拌10min后，采用探头超声20次(工作2s，停3s，600w)，制备得到W/O型亚微乳。
400rpm磁力搅拌条件下将水相缓慢滴加到油相后，在400rpm条件下继续搅拌10min后，采用探头超声20次(工作2s，停3s，600w)，制备得到W/O型亚微乳。
[0045] 在制备得到的亚微乳中加入0.016ml 25％戊二醛溶液，于电热恒温水槽中固化反应6h(恒温搅拌(60℃，400rpm))后，加入盐酸调pH至弱酸性(pH为5)，400rpm磁力搅拌10min，制备得到包封ATP的壳聚糖纳米粒分散液。将制得包封ATP的壳聚糖纳米粒分散液低温离心(4℃，21000rpm/，25min)，去除上清液，重新分散于20ml石油醚中，重新低温离心(4℃，21000rpm/，25min)，重复3次，洗去表面活性剂后，分散于去离子水中，冷冻干燥制备得到包封ATP的壳聚糖纳米粒。
[0046] 二、包封ATP的壳聚糖纳米粒的特性
[0047] 分别称取上述实施例1-9得到的包封ATP的壳聚糖纳米粒10mg，加100mL双蒸水分散，得到相应的包封ATP的壳聚糖纳米粒分散液。使用Zetasizer3000HS分析仪，测定包封ATP的壳聚糖纳米粒的平均粒径(D)和点位。通过公知的紫外分光光度法测定药物含量，实施例1-9的上述特性均列于下表1。
[0048] 表1
[0049]粒径(nm) 电位(mV) ATP含量(wt％)
实施例1 108±1.00 21.0±0.45 4.42
实施例2 104±2.64 20.6±0.25 4.73
实施例3 107±3.06 20.3±1.33 5.49
实施例4 105±3.21 21.6±0.79 3.29
实施例5 111±4.51 23.8±1.14 2.41
实施例6 109±2.64 22.6±1.25 6.50
实施例7 111±4.51 18.2±1.28 3.90
实施例8 104±2.89 21.3±0.56 0
实施例9 110±3.56 19.7±0.88 10.25
实施例1 108±1.00 21.0±0.45 4.42
实施例2 104±2.64 20.6±0.25 4.73
实施例3 107±3.06 20.3±1.33 5.49
实施例4 105±3.21 21.6±0.79 3.29
实施例5 111±4.51 23.8±1.14 2.41
实施例6 109±2.64 22.6±1.25 6.50
实施例7 111±4.51 18.2±1.28 3.90
实施例8 104±2.89 21.3±0.56 0
实施例9 110±3.56 19.7±0.88 10.25
[0050] 实施例3、6和7所得包封ATP的壳聚糖纳米粒在pH7.4的磷酸缓冲液中的体外释放结果参见图1。图1显示，以亚微乳、表面交联固化和离子复合技术的联合应用制备得到的包封ATP的壳聚糖纳米粒，ATP从纳米粒中的释放具有缓释作用，均可持续释放24小时以上，而ATP为低分子水溶性药物，相同量的药物粉末在pH7.4的磷酸缓冲液中的可在瞬间溶解。更进一步，随着纳米粒制备过程中戊二醛加入量的增加(实施例6-实施例3-实施例7)，ATP从壳聚糖纳米粒中的缓释效果越明显。
[0051] 图2为实施例3的包封ATP的壳聚糖纳米粒的ATP释放前后的透射电镜照片，从图2A中可以清楚的看到ATP以细小的复合纳米粒(ATP与壳聚糖的复合物)的形式被包裹于以交联壳聚糖作为载体的球状结构中，而图2B则为ATP释放后的壳聚糖纳米粒，纳米粒表面与纳米粒中可明显看到ATP释放后所残留的空洞。纳米粒粒子形状规则，呈类球形，大小较为均匀。