使用密闭微孔卡检测结核分支杆菌药敏的方法

摘要

本发明公开了一种使用密闭微孔卡检测结核分支杆菌药敏的方法，包括带有测试微孔的长方形卡体及上盖，测试微孔呈多行、多列的方式均布在卡体上；在卡体上围绕测试微孔开设有环形凹槽，在环形凹槽外的卡体周边处设置有卡槽，上盖周边设置的卡板与所述卡槽相匹配，在上盖的内表面设置有与各微孔相对应的密封凸环。本发明还同时公开了使用该卡检测结核分支杆菌药敏的方法，此方法可以同时对所要检测的结核分枝杆菌临床分离菌株进行菌型鉴定和抗结核药物最小抑制浓度测定，生长指示孔的设定，使得生长速度不同的临床分离株的药敏试验能够顺利完成，保证了结果的可靠性。微孔卡的密封性保证了操作人员的安全。

权利要求

1.一种非诊断目的的，使用密闭微孔卡检测结核分支杆菌药敏的方法，其特征在于：

所述密闭微孔卡包括带有测试微孔(1)的长方形卡体(2)及上盖(3)，所述的测试微孔(1)呈多行、多列的方式均布在卡体(2)上；在所述卡体(2)上围绕测试微孔(1)开设有环形凹槽(4)，在所述环形凹槽(4)外的卡体周边处设置有卡槽(5)，所述上盖(3)周边设置的卡板(6)与所述卡槽(5)相匹配，在所述上盖(3)的内表面设置有与各测试微孔(1)相对应的密封凸环；所述卡槽(5)的内壁上贴附有柔性密封环(7)；

具体检测步骤如下：

第一步：将密闭微孔卡卡体上排列设置的测试微孔分为三个区域：药敏鉴定区多列；

菌型鉴定区1列；生长指示区2列：一列为菌体生长指示孔，一列为培养基质控孔；

第二步：将密闭微孔卡的上盖打开，将药敏鉴定区的微孔按行分类，每一行添加一种抗生素，同一行中各个微孔中抗生素的量用培养基倍比稀释，抗生素的浓度依次降低；在菌型鉴定区的微孔中复孔添加PNB鉴定培养基和TCH鉴定培养基；在生长指示区的微孔中添加和药敏鉴定区相同的培养基；

第三步：将经过稀释的结核杆菌菌悬液分别添加到药敏鉴定区、菌型鉴定区的微孔中以及生长指示区的菌体生长指示孔中，培养基质控孔中不加菌悬液，为空白对照；

第四步：将密闭微孔卡上环绕所有微孔开设的环形凹槽内加入无菌水，盖上密闭微孔卡的上盖，微孔板用上盖进行密封后，放入37℃培养箱中3-8天；

第五步：将第四步中培养好的微孔板取出，在生长指示区第一行添加Alamar Blue，

37℃过夜培养，于第二天观察，如果生长指示孔颜色由原来的蓝色变为粉红色，培养基质控孔保持蓝色，则证明菌体达到使变色剂变色的浓度，在药敏鉴定区和菌型鉴定区加入相同量的Alamar Blue，37℃培养过夜，于第二天观察变色情况，把最小抑制浓度定义为与粉红色微孔相邻的蓝色微孔的药物浓度，并根据鉴定培养基的变色情况判断菌型，非结核分支杆菌PNB鉴定培养基和TCH鉴定培养基颜色均为粉红色，牛型结核分支杆菌PNB鉴定培养基和TCH鉴定培养基颜色均为蓝色，人型结核分支杆菌TCH鉴定培养基颜色粉红色，PNB鉴定培养基颜色蓝色；如果两孔颜色均变为粉红色，则说明本次实验无效；如果生长指示区两孔颜色保持蓝色，则在生长指示区第二行两孔中添加Alamar Blue，判断方法同上，依次类推。

说明书

使用密闭微孔卡检测结核分支杆菌药敏的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种体外检测试剂的方法，尤其是涉及一种使用密闭微孔卡检测结核分支杆菌药敏的方法。

背景技术

[0002] 结核病是一种古老的疾病，曾经一度被控制，但是随着爱滋病患者的增多和免疫抑制治疗的流行，近年来全球结核病呈上升趋势。尤其是我国，由于治疗条件的限制和艾滋病患者的增多，结核病在我国形势非常严峻。而当前我国大部分医院检测结核菌药敏的方法还是固体培养基绝对浓度法和比例法，其他方法由于技术水平的限制或者花费太过昂贵，目前都得不到普及。然而固体药敏方法时间漫长，可达到两个月之久，严重耽误病人的及时诊治。而在结核药敏的测试方法上，液体药敏由于方法更加快捷已逐步受到临床检测的重视。该种方法也是WHO鼓励采用的方法，尤其是在发展中国家，液体药敏法由于价格低廉，将会进一步促其发展。

[0003] 在当前液体培养基药敏测试中，最常用的是采用MTT作为细菌生长指示剂，如果MTT从黄色变为紫红色，则表示培养物中有细菌生长，以此来判定结核分枝杆菌的耐药情况。MTT具有细胞毒性，对结核分枝杆菌的生长有一定影响。Alamar Blue作为一种新型的显色剂，作为细胞生长的指示剂已经被广泛报道，它不影响细胞的正常生长，添加以后可以观察细胞的后继生长情况。国内对Alamar Blue法检测结核分枝杆菌的方法已经有所探讨。本方法即是采用Alamar Blue作为结核菌生长指示剂，其显色要比MTT法更为灵敏，缩短了检测的时间。

[0004] 在对结核分枝杆菌的药敏试验上，由于瓶装培养基体积大，需要的抗生素较多而使结核药敏鉴定费用昂贵。在微孔板上进行结核药敏试验，虽然已经有相当多的研究，然而，由于微孔板上的测试小孔不是与外界相对密闭，使得结核药敏试验在微孔板上进行难以突破，无法进入临床检测实验室。针对本方法设计的密闭微孔板就是为了解决这些难题。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种低成本进行药敏试验的密闭微孔卡，以及使用该密闭微孔卡检测结核分支杆菌药敏的方法。

[0006] 为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

[0007] 本发明所述的使用密闭微孔卡检测结核分支杆菌药敏的方法，包括带有测试微孔的长方形卡体及上盖，所述的测试微孔呈多行、多列(4×9、4×10、4×11或4×12)的方式均布在卡体上；在所述卡体上围绕测试微孔开设有环形凹槽，在所述环形凹槽外的卡体周边处设置有卡槽，所述上盖周边设置的卡板与所述卡槽相匹配，在所述上盖的内表面设置有与各微孔相对应的密封凸环。

[0008] 为保证上盖与卡体间形成良好的密封，使结核分支杆菌在培养过程中不会污染环境，以保证操作人员的安全，所述卡槽的内壁上贴附有柔性密封环。

[0009] 本发明的密闭微孔卡的上盖卡板卡入卡体的卡槽内，上盖内表面的密封凸环将所对应的微孔进行有效密封，即可保证整个培养过程在一个密闭的系统中进行，围绕测试微孔开设的环形凹槽用来灌注无菌水，防止药敏试验过程中水分的过度蒸发；整个结核药敏试验在配备有生物安全柜的实验室中即可进行。

[0010] 使用上述密闭微孔卡检测结核分支杆菌药敏的方法，包括以下步骤：

[0011] 第一步：将密闭微孔卡卡体上排列设置的测试微孔分为三个区域：药敏鉴定区多列；菌型鉴定区1列；生长指示区2列：一列为菌体生长指示孔，一列为培养基质控孔；

[0012] 第二步：将密闭微孔卡的上盖打开，将药敏鉴定区的微孔按行分类，每一行添加一种抗生素，同一行中各个微孔中抗生素的量用培养基倍比稀释，抗生素的浓度依次降低；在菌型鉴定区的微孔中复孔添加PNB鉴定培养基和TCH鉴定培养基；在生长指示区的微孔中添加和药敏鉴定区相同的培养基；

[0013] 第三步：将经过稀释的结核杆菌菌悬液分别添加到药敏鉴定区、菌型鉴定区的微孔中以及生长指示区的菌体生长指示孔中，培养基质控孔中不加菌悬液，为空白对照；

[0014] 第四步：将密闭微孔卡上环绕所有微孔开设的环形凹槽内加入无菌水，盖上密闭微孔卡的上盖，微孔板用上盖进行密封后，放入37℃培养箱中3-8天；

[0015] 第五步：将第四步中培养好的微孔板取出，在生长指示区第一行添加Alamar Blue，37℃过夜培养，于第二天观察，如果生长指示孔颜色由原来的蓝色变为粉红色或无色，培养基质控孔保持蓝色，则证明菌体达到使变色剂变色的浓度，在药敏鉴定区和菌型鉴定区加入相同量的Alamar Blue，37℃培养过夜，于第二天观察变色情况，把最小抑制浓度定义为与粉红色微孔相邻的蓝色微孔的药物浓度，并根据鉴定培养基的变色情况判断菌型，非结核分支杆菌PNB(对硝基苯甲酸)鉴定培养基和TCH(噻吩-2-羧酸肼)鉴定培养基颜色均为粉红色，牛型结核分支杆菌PNB(对硝基苯甲酸)鉴定培养基和TCH(噻吩-2-羧酸肼)鉴定培养基颜色均为蓝色，人型结核分支杆菌TCH(噻吩-2-羧酸肼)鉴定培养基颜色粉红色，PNB(对硝基苯甲酸)鉴定培养基颜色蓝色；如果两孔颜色均变为粉红色，则说明本次实验无效；如果生长指示区两孔颜色保持蓝色，则在生长指示区第二行两孔中添加Alamar Blue，判断方法同上，依次类推。

[0016] 使用本发明所述的密闭微孔卡按照上述方法可以同时对所要检测的结核分枝杆菌临床分离菌株进行菌型鉴定和抗结核药物最小抑制浓度测定，生长指示孔的设定，使得生长速度不同的临床分离株的药敏试验能够顺利完成，保证了结果的可靠性。

附图说明

[0017] 图1是本发明密闭微孔卡的结构示意图。

[0018] 图2是图1的A-A向视图。

具体实施方式

[0019] 如图1、2所示，本发明所述的使用密闭微孔卡检测结核分支杆菌药敏的方法，包括带有测试微孔1的长方形卡体2及上盖3，所述的测试微孔1呈4行、12列的方式均布在卡体2上；在所述卡体2上围绕测试微孔1开设有环形凹槽4，在所述环形凹槽4外的卡体周边处设置有卡槽5，所述卡槽5的内壁上贴附有柔性塑料密封环7；所述上盖3周边设置的卡板6与所述卡槽5相匹配，在所述透明塑料上盖3的内表面设置有与各测试微孔1相对应的密封凸环。

[0020] 检测实施例1：

[0021] 将密闭微孔卡卡体上排列的48个测试微孔(4行12列)分为三个区域：药敏鉴定区9列；菌型鉴定区1列；生长指示区2列：一列为菌体生长指示孔，一列为培养基质控孔；在药敏鉴定区第一列分别加入用结核分支杆菌液体培养基溶解的异烟肼(8μg/ml)、利福平(4μg/ml)、硫酸链霉素(32μg/ml)、乙胺丁醇(128μg/ml)200ml(利福平用二甲基亚砜溶解后再添加培养基)，在后面的微孔中依次用结核分枝杆菌液体培养基对抗生素进行倍比稀释，在鉴定孔中复孔添加含有PNB和TCH的结核分枝杆菌鉴定培养基，在生长指示区的各孔中添加和药敏鉴定区相同但不含抗生素的液体培养基；

[0022] 将经过分离纯化的结核分枝杆菌用生理盐水稀释到3个麦氏浊度的浓度，每孔添加80ul，其中生长指示区第二列的培养基质控孔中不添加菌悬液；将接种好的药敏板用透明塑料上盖密封，置37℃培养箱培养3天取出，在生长指示孔添加5-10％Alamar Blue25-50μl，37℃过夜培养，于第二天观察，生长指示孔颜色由原来的蓝色变为粉红色，培养基质控孔保持蓝色，证明菌体达到使变色剂变色的浓度，在药敏鉴定区和菌型鉴定区加入相同量的Alamar Blue，37℃培养过夜，于第二天观察变色情况；

[0023] 在药敏区域，观察四行微孔的颜色：第一行异烟肼梯度孔2μg/ml蓝色，1μg/ml孔以及后面微孔颜色为粉红色，说明最小抑制浓度为2μg/ml；第二行利福平0.063μg/ml颜色蓝色，0.031μg/ml颜色粉红色，则最小抑制浓度为0.063μg/ml；第三行0.125颜色粉红色，0.250μg/ml孔颜色蓝色，则最小抑制浓度为0.250μg/ml；第四行8μg/ml孔颜色粉红色，16μg/ml孔颜色蓝色，则最小抑制浓度为16μg/ml。从鉴定培养基复孔结果看，PNB(对硝基苯甲酸)鉴定培养基和TCH(噻吩-2-羧酸肼)鉴定培养基颜色均未发生改变，则说明该临床分离菌株为牛型结核分支杆菌。

[0024] 检测实施例2：

[0025] 将密闭微孔卡卡体上排列的48个测试微孔(4行12列)分为三个区域：药敏鉴定区9列；菌型鉴定区1列；生长指示区2列：一列为菌体生长指示孔，一列为培养基质控孔；在药敏鉴定区第一列分别加入用结核分支杆菌液体培养基溶解的异烟肼(8μg/ml)、利福平(4μg/ml)、硫酸链霉素(32μg/ml)、乙胺丁醇(128μg/ml)200ml(利福平用二甲基亚砜溶解后再添加培养基)，在后面的微孔中依次用结核分枝杆菌液体培养基对抗生素进行倍比稀释，在鉴定孔中复孔添加含有PNB和TCH的结核分枝杆菌鉴定培养基，在生长指示区的各孔中添加和药敏鉴定区相同但不含抗生素的液体培养基；

[0026] 将经过分离纯化的结核分枝杆菌用生理盐水稀释到2个麦氏浊度的浓度，每孔添加40ul，其中生长指示区第二列的培养基质控孔中不添加菌悬液；

[0027] 将接种好的药敏板用透明塑料上盖密封，置37℃培养箱培养5天取出，在生长指示孔添加5-10％Alamar Blue 25-50μl，37℃过夜培养，于第二天观察，两孔同时为粉红色，则说明培养基可以使显色剂变色，本次试验无效。

[0028] 检测实施例3：

[0029] 将密闭微孔卡卡体上排列的48个测试微孔(4行12列)分为三个区域：药敏鉴定区9列；菌型鉴定区1列；生长指示区2列：一列为菌体生长指示孔，一列为培养基质控孔；在药敏鉴定区第一列分别加入用结核分支杆菌液体培养基溶解的异烟肼(8μg/ml)、利福平(4μg/ml)、硫酸链霉素(32μg/ml)、乙胺丁醇(128μg/ml)200ml(利福平用二甲基亚砜溶解后再添加培养基)，在后面的微孔中依次用结核分枝杆菌液体培养基对抗生素进行倍比稀释，在鉴定孔中复孔添加含有PNB和TCH的结核分枝杆菌鉴定培养基，在生长指示区的各孔中添加和药敏鉴定区相同但不含抗生素的液体培养基；

[0030] 将经过分离纯化的结核分枝杆菌用生理盐水稀释到1个麦氏浊度的浓度，每孔添加20ul，其中生长指示区第二列的培养基质控孔中不添加菌悬液；

[0031] 将接种好的药敏板用透明塑料上盖密封，置37℃培养箱培养8天取出，在生长指示孔添加5～10％Alamar Blue 25-50μl，37℃过夜培养，于第二天观察，两孔同时为蓝色，说明菌体生长还未达到显色剂变色浓度，需要在生长指示区域第二行再加入5～10％Alamar Blue 25-50μl，37℃培养24小时，再另行观察。

[0032] 检测实施例4：

[0033] 将密闭微孔卡卡体上排列的48个测试微孔(4行12列)分为三个区域：药敏鉴定区9列；菌型鉴定区1列；生长指示区2列：一列为菌体生长指示孔，一列为培养基质控孔；在药敏鉴定区第一列分别加入用结核分支杆菌液体培养基溶解的莫西沙星(6μg/ml)、氧氟沙星(8μg/ml)、加替沙星(2μg/ml)、卷曲霉素(4μg/ml)200ml(对不溶于水的抗生素用二甲基亚砜溶解后再添加培养基)，在后面的微孔中依次用结核分枝杆菌液体培养基对抗生素进行倍比稀释，在鉴定孔中复孔添加含有PNB和TCH的结核分枝杆菌鉴定培养基，在生长指示区的各孔中添加和药敏鉴定区相同但不含抗生素的液体培养基；

[0034] 将经过分离纯化的结核分枝杆菌用生理盐水稀释到2个麦氏浊度的浓度，每孔添加20μl，其中生长指示区第二列的培养基质控孔不添加菌悬液；

[0035] 将接种好的药敏板用透明塑料上盖密封，置37℃培养箱培养5天取出，在生长指示孔添加Alamar Blue，37℃过夜培养，于第二天观察，生长指示孔颜色由原来的蓝色变为粉红色或无色，培养基质控孔保持蓝色，证明菌体达到使变色剂变色的浓度，在药敏鉴定区和菌型鉴定区加入相同量的Alamar Blue，37℃培养过夜，于第二天观察变色情况。最小抑制浓度为相邻粉红色微孔颜色为蓝色的微孔药物浓度为最小抑制浓度，结果为莫西沙星的MIC为0.25μg/ml，氧氟沙星的MIC为2μg/ml，加替沙星的MIC为0.5μg/ml，卷曲霉素的MIC为0.5μg/ml。