一种安来霉素产生菌及利用大孔树脂提取的方法

摘要

本发明公开了一种安来霉素产生菌及利用大孔树脂提取安来霉素的方法。属于由发酵后菌丝体提取安来霉素的技术。该方法通过发酵法获得安来霉素，以发酵后的菌丝体为原料，经过细胞破碎、安来霉素粗提物的制备、大孔树脂的吸附、梯度洗脱和浓缩干燥的过程得到安来霉素。其特征在于安来霉素粗提物的制备是将菌丝体破碎后恒温震荡提取，提取液在真空下减压浓缩得粗提物，粗提物用大孔树脂进行吸附；静止吸附后梯度洗脱，再经过减压浓缩得到产品。本发明工艺简单，生产周期短，生产成本低，适合于工业化生产，具有一定的社会、经济效益。

权利要求

1.一种用大孔树脂提取安来霉素的方法，具体步骤如下：A、发酵法生产安来霉素的过程为：(1)斜面培养：将链霉菌Streptomyces sp.NJWGY3665菌种，中科院微生物菌种保藏中心编号CGMCC No.2410，接到葡萄糖营养培养基中，进行斜面培养，葡萄糖营养培养基的重量百分配比为葡萄糖0.5～1％、牛肉膏0.5～1％、蛋白胨0.5～1％、NaCl0.3～0.5％或K2HPO4 0.1～0.2％、琼脂1.5～2％、水余量，pH 6.0～9.0，培养温度28～37℃，培养时间2天～6天；(2)种子培养：用无菌水将斜面上培养的孢子制成单孢子悬液，并接种到

50ml种子培养基中培养，种子培养基的重量百分配比为葡萄糖1～3.0％、玉米浆1～3％、CaCO3 1～2％、酵母粉0.5％、NaCl 0.1～0.8％、水余量，pH为6.0～9.0，温度为28～

32℃，转速为200rpm，培养2天～6天；(3)发酵培养：将种子液接种到发酵培养基中培养，发酵培养基的重量百分配比为葡萄糖2.0～5.0％、淀粉0.5～2.0％、玉米浆0.5～3.0％、酵母膏0.1～0.5％、黄豆饼粉0.5～2％、NaCl 0.5～1.0％、CaCO3 1～2％、NH4Cl 0.5％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸铵0.3％、水余量，温度控制在28～37℃，pH控制在6.0～9.0，转速180～220rpm，发酵5～9天；B、将发酵后的安来霉素产生菌，用KQ-100型超声机进行微生物细胞破碎，得到含有安来霉素的混合物；C、用水稀释成体积分数为30％～100％的萃取剂振荡提取B中所述的混合物0.5～2.5小时，体系的pH值控制在4.0～8.5之间，获得含有安来霉素的提取液；其中的萃取剂为乙醇、甲醇、盐酸、氯化钠的甲醇水溶液、盐酸的甲醇水溶液；D、将含有安来霉素的提取液离心，收集含有安来霉素的上清液，将上清液在

30～40℃下减压浓缩至无液体，得到安来霉素粗提品；E、大孔树脂预处理后，将浓缩后的安来霉素粗提品用溶剂溶解，经过大孔树脂静止吸附2～5小时后，用洗脱剂进行梯度洗脱、浓缩干燥后得到安来霉素纯品；其中梯度洗脱时，洗脱剂为甲醇体积分数30％～90％的甲醇水溶液、氯化钠摩尔浓度为0.03～0.09mol/L及甲醇体积分数为40％～70％的氯化钠甲醇水溶液、盐酸摩尔浓度为0.003～0.009mol/L及甲醇体积分数为40％～70％的盐酸甲醇水溶液或摩尔浓度为1～3mol/L的盐酸中的任意两种；两种洗脱剂的体积比为

1∶9～5∶5。

2.按权利要求1所述的用大孔树脂提取安来霉素的方法，其特征在于：萃取剂中的乙醇为无水乙醇、甲醇为分析纯，盐酸的摩尔浓度为1～5mol/L，氯化钠甲醇水溶液中氯化钠摩尔浓度为0.03～0.09mol/L、甲醇体积分数为40％～70％，盐酸甲醇水溶液中盐酸摩尔浓度为0.003～0.009mol/L、甲醇体积分数为40％～70％。

3.按权利要求1所述的用大孔树脂提取安来霉素的方法，其特征在于：步骤C中安来霉素产生菌的菌丝体质量/萃取剂体积为1/10～1/150。

4.按权利要求1所述的用大孔树脂提取安来霉素的方法，其特征在于：提取体系的pH为5.0～7.5。

5.按权利要求1所述的用大孔树脂提取安来霉素的方法，其特征在于：选用的大孔树脂为大孔树脂D101，安伯莱特XAD-2，安伯莱特XAD-4或安伯莱特XAD-16。

说明书

一种安来霉素产生菌及利用大孔树脂提取的方法

技术领域

[0001] 本发明属于分离工程技术领域，涉及一种安来霉素产生菌及利用大孔树脂提取的方法。

背景技术

[0002] 自1945年青霉素的发现到现在各种抗生素的广泛使用，抗生素不仅在人类疾病的治疗和预防中发挥着巨大的作用，在农业尤其是畜牧业中也有举足轻重的地位。我国是一个农业大国，畜牧业作为农业的重要支柱产业发展迅速，近几年(2006年)畜牧业产值占农业比重达到35％。畜牧业对抗生素的依赖性很大，目前国内每年抗生素花费约5亿美元，并且随着新的抗生素品种不断被研制开发，抗生素在配合饲料中的用量逐渐扩大，目前我国平均每年已有约6000t的抗生素用作饲料添加剂。

[0003] 然而，随着抗生素的广泛使用，逐渐出现药物残留与耐药性问题，当人类食用含有抗生素残留物的肉制品、奶制品时，带来的隐患和弊端极其严重，要消除已有的耐青霉素、沙星类的病菌，需要人类长达100年左右彻底不再使用这两种药物，耐药性菌株的出现，必将缩小未来抗生素的使用范围。此外，由于饲料而引发的肉食品安全问题，如疯牛病、二噁英污染、法国污水饲料等事件，至今还令人心有余悸。因而，欧盟禁止在饲料中添加螺旋霉素、维吉尼亚霉素、杆菌肽锌和泰乐菌素等抗生素。同时，抗生素残留超标严重制约我国畜产品的出口，鸡肉氯羟吡啶残留超标，蜂产品“杀虫眯”和氯霉素残留超标，遭到封杀并要求销毁，给我国造成经济损失。为此，抗生素饲料添加剂的使用对畜牧业和人类健康产生严重的负面影响。然而，相关报告显示，禁止在饲料中添加抗生素或其他抗菌促生长剂的国家会造成畜牧业生产成本增加、盈利减少，同时也有可能引发诸如生态环境及国家之间的贸易战等问题。面临当前的严峻形势，开发研制具有促生长作用、低药物残留和无交叉耐药性的抗生素新品种已成为刻不容缓的事请。

[0004] 安来霉素是一种广谱、高效、安全的新型饲料添加剂，作为饲料添加剂，安来霉素具有如下优点：(1)对饲料只添加微量的安来霉素就能促进对畜禽的增重。(2)具有对革兰氏阳性菌强烈的抗微生物活性。(3)不会残留于畜禽体内。(4)与临床上现有的抗生素或抗菌药之间不存在交叉耐药性。敏感菌几乎不对安来霉素产生耐药性，在实验条件下，耐药性的产生也非常缓慢，即使出现，耐药性也不稳定，而且极易丢失。(5)在饲料里面可以保持稳定性。此外，安来霉素对乙肝病毒(HBV)抗原和乙肝e抗原(HBeAg)也有较好的抑制效果。正是由于安来霉素具有高效、安全、无残留等优点，在中国上市的短时间内，市场份额迅速上升，已成为抗菌促生长饲料添加剂的一线产品，但目前国内尚未见安来霉素生产的相关报道，课题组通过大量的实验研究，确定了安来霉素的最佳分离提取工艺。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种安来霉素产生菌(链霉菌)、发酵生产安来霉素的过程及应用大孔树脂提取安来霉素的方法。

[0006] 本发明的技术方案：一种链霉菌，其分类命名为链霉菌，菌种的拉丁学名是Streptomyces sp.NJYWG3665，保藏日期是2008年3月21日，保藏中心登记入册编号是CGMCC NO.2410。

[0007] 本发明还提供了一种用大孔树脂提取安来霉素的方法，具体步骤如下：A、发酵法生产安来霉素的过程为：(1)斜面培养：将链霉菌Streptomyces sp.NJWGY3665菌种，中科院微生物菌种保藏中心编号CGMCC No.241 0，接到葡萄糖营养培养基中，进行斜面培养，葡萄糖营养培养基的重量百分配比为葡萄糖0.5～1％、牛肉膏0.5～1％、蛋白胨0.5～1％、NaCl 0.3～0.5％或K2HPO4 0.1～0.2％、琼脂1.5～2％、水余量，pH 6.0～9.0，培养温度28～37℃，培养时间2天～6天；(2)种子培养：用无菌水将斜面上培养的孢子制成单孢子悬液，并接种到50ml种子培养基中培养，种子培养基的重量百分配比为葡萄糖1～
3.0％、玉米浆1～3％、CaCO3 1～2％、酵母粉0.5％、NaCl 0.1～0.8％、水 余量，pH为
6.0～9.0，温度为28～32℃，转速为200rpm，培养2天～6天；(3)发酵培养：将种子液接种到发酵培养基中培养，发酵培养基的重量百分配比为葡萄糖2.0～5.0％、淀粉0.5～
2.0％、玉米浆0.5～3.0％、酵母膏0.1～0.5％、黄豆饼粉0.5～2％、NaCl0.5～1.0％、CaCO3 1～2％、NH4Cl 0.5％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸铵0.3％、水 余量，温度控制在28～
37℃，pH控制在6.0～9.0，转速180～220rpm，发酵5～9天；B、将发酵后的安来霉素产生菌，用KQ-100型超声机进行微生物细胞破碎，得到含有安来霉素的混合物；C、用水稀释成体积分数为10％～100％的萃取剂振荡提取B中所述的混合物0.5～4小时，体系的pH值控制在4.0～8.5之间，获得含有安来霉素的提取液；D、将含有安来霉素的提取液离心，收集含有安来霉素的上清液，将上清液在30～40℃下减压浓缩至无液体，得到安来霉素粗提品；E、大孔树脂预处理后，将浓缩后的安来霉素粗提品用溶剂溶解，经过大孔树脂静止吸附2～5小时后，用洗脱剂进行梯度洗脱、浓缩干燥后得到安来霉素纯品。

[0008] 上述的萃取剂为萃取剂为乙醇、甲醇、盐酸、氯化钠的甲醇水溶液、盐酸的甲醇水溶液，其中所述的乙醇为无水乙醇、甲醇为分析纯，盐酸的摩尔浓度为1～5mol/L，氯化钠甲醇水溶液中氯化钠摩尔浓度为0.03～0.09mol/L、甲醇体积分数为40％～70％，盐酸甲醇水溶液中盐酸摩尔浓度为0.003～0.009mol/L、甲醇体积分数为40％～70％。

[0009] 萃取剂的体积分数为30％～100％，利用萃取剂提取的时间为0.5～2.5小时。

[0010] 上述步骤C中安来霉素产生菌的菌丝体质量/萃取剂体积为1/10～1/150。

[0011] 上述提取体系的pH为5.0～7.5。

[0012] 上述所选用的大孔树脂为大孔树脂D101、安伯莱特XAD-2、安伯莱特XAD-4或安伯莱特XAD-16。

[0013] 梯度洗脱时，洗脱剂为甲醇体积分数30％～90％的甲醇水溶液、氯化钠摩尔浓度为0.03～0.09mol/L及甲醇体积分数为40％～70％的氯化钠甲醇水溶液、盐酸摩尔浓度为0.003～0.009mol/L及甲醇体积分数为40％～70％的盐酸甲醇水溶液或摩尔浓度为1～3mol/L的盐酸中的任意两种；两种洗脱剂的体积比为1∶9～5∶5。

[0014] 上述链霉菌Streptomyces sp.NJYWG3665是由本实验室从南京工业大学江浦校区的土壤中，初筛得到47株能抑制枯草芽孢杆菌生长的放线菌；经摇瓶复筛，用HPLC(高效液相色谱)检测获得一株安来霉素产生菌，通过生理生化特性实验和16S rDNA序列相似性分析，分类鉴定命名为链霉菌，并保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其简称为CGMCC，登记入册的编号是CGMCCNo.2410，保藏日期是：2008年3月21日。以此菌种作为生产菌株。

[0015] CGMCC No.2410菌株具有下述性质：

[0016] 1、形态特征：

[0017] 菌株在高氏一号培养基上生长中度，气生菌丝生长中度，孢子丝呈波曲状，孢子成链状排列，在电子显微镜下孢子成椭圆形。

[0018] 2、培养特征：

[0019] 28℃培养7-14天，观察菌株在下列各种培养基上的特征。

[0020] 表1 CGMCC No.2410菌株的培养特征

[0021]

[0022] 3、生理生化性质：

[0023] 表2 CGMCC No.2410与S.fungicidicus NO.B5477菌株的生理生化性质比较[0024]

[0025] +++：富集生长；++：适度生长；+：生长；-：不生长

[0026] 4、16S rDNA序列分析

[0027] 用溶菌酶法从新鲜菌体提取基因组DNA，采用链霉菌通用引物进行16SrDNA扩增，PCR产物经检测、纯化后交由TAKARA公司进行测序。所测的16SrDNA序列经校对、拼接后与GenBank数据库中相关种属的序列进行BLAST比较得知，菌株Streptomyces sp.NJYWG3665(CGMCC No.2410)属于链霉菌属。

[0028] 测得16S rDNA大部分序列1650bp，具体如下：

[0029] 5’-ATTGAGTTTATCCTGGCTCAGGGTTTCTTCGGTACGCTGAGTCGAAACACCCACTTCGACGATATAGTTGCGGCTGGATCACCTCCTTAGAGTTTGATCCTGGCTCAGTGCGGCTAGATCACCTCCTTAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAACCACTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACTGACCCGCCTGGGCATCCAGGCGGTTCGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGGTGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATCGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCGCGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGAGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAAGCATTAGAGATAGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCACAACCCTTGTCCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGAAACCGTGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTTGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTAAT-3’

[0030] 有益效果：利用该菌生产安来霉素的工艺简单，单位体积发酵液安来霉素效价高，利用该方法提取安来霉素，具有提取率高、操作简单和成本低等特点，易于实现工业化，为饲料添加安来霉素的生产提供了可行的提取工艺。

具体实施方式

[0031] 下述所有范例选择的菌丝体为：Streptomyces sp.NJWGY3665，中科院微生物菌种保藏中心编号CGMCC No.2410

[0032] 实施例1

[0033] 将链霉菌Streptomyces sp.NJWGY3665菌种接到葡萄糖0.5％，牛肉膏0.5％，蛋白胨0.5％，NaCl0.5％，琼脂1.5％、水96.5％，pH6.0的葡萄糖营养培养基中，进行斜面培养，在28℃下培养2天。取斜面菌种，加入2-3ml无菌水(每18×180mm的试管斜面菌种)，用接种环轻轻将菌苔洗下，制成孢子悬液，取0.5ml孢子悬液接种到含40ml葡萄糖1.0％，玉米浆3％，CaCO3 1％、酵母膏0.5％、NaCl0.1％、水94.4％，pH7.0的液体种子培养基中培养3天，培养温度为28℃，转速为200rpm。再将5ml种子液接入到装液量为100ml含有葡萄糖4.0％，淀粉2.0％，玉米浆2.0％、酵母膏0.1％、黄豆饼粉2％、NaCl 0.5％、CaCO31.5％、NH4Cl 0.5％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸铵0.3％、水86.9％的发酵培养集中，在28℃，
180rpm，pH6.0的条件下摇床发酵培养5天，获得含有安来霉素的菌丝体，将1g发酵后的菌丝体，用去离子水清洗，悬浮在30mL乙醇中，乙醇的体积分数为70％，pH为4.5，用KQ-100型超声机进行微生物细胞破碎15min，得到含有安来霉素的混合物，将破碎后的混合物用HYG-IIa型摇瓶柜振荡(调节摇瓶柜的温度和转速分别为15℃，180rpm)提取1小时，得到含有安来霉素的提取液，然后将含有安来霉素的提取液在1500r/min的转速下离心15min，收集含有安来霉素的上清液，将上清液在30℃下减压浓缩至无液体，得到安来霉素粗提品。
将大孔树脂按照常规处理方法进行预处理后，装入带有恒温保护套的玻璃柱子，用氯化钠浓度为0.09mol/L及甲醇体积分数为70％的甲醇水溶液以60mL/h的速度泵入柱子来完成平衡。安来霉素的粗提品溶解在10mL乙醇中，放在柱子的顶端，静止吸附2小时，用0.5L的洗脱剂(甲醇/氯化钠浓度为0.09mol/L及甲醇体积分数为70％的甲醇水溶液的体积比为1∶9)梯度洗脱，将洗脱液用旋转真空蒸发器减压浓缩蒸干，产率达到60％。

[0034] 实施例2

[0035] 将链霉菌Streptomyces sp.NJWGY3665菌种接到葡萄糖0.5％，牛肉膏0.8％、蛋白胨0.8％、K2HPO4 0.1％、琼脂1.8％、水96％，pH7.0的葡萄糖营养培养基中，进行斜面培养，在37℃下培养3天。取斜面菌种，加入2-3ml无菌水(每18×180mm的试管斜面菌种)，用接种环轻轻将菌苔洗下，制成孢子悬液，取0.5ml孢子悬液接种到孢子悬液接种到含40ml葡萄糖2.0％、玉米浆2.0％、CaCO31.5％、酵母粉0.5％、NaCl0.5％、水93.5％，pH7.0的液体种子培养基中培养4天，培养温度为30℃，转速为200rpm。再将10ml种子液接入到装液量为100ml含有葡萄糖2.0％，淀粉1.5％，玉米浆0.5％、酵母膏0.3％、黄豆饼粉1.5％、NaCl0.8％、CaCO3 1.5％、NH4Cl 0.5％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸铵0.3％、水90.9％的发酵培养基中，在32℃，220rpm，pH7.0的条件下摇床发酵培养6天，获得含有安来霉素的菌丝体，将1g发酵后的菌丝体，用去离子水清洗，悬浮在90mL盐酸中，盐酸的体积分数为
50％，pH为5.0，用KQ-100型超声机进行微生物细胞破碎15min，得到含有安来霉素的混合物，将破碎后的混合物用HYG-IIa型摇瓶柜振荡(调节摇瓶柜的温度和转速分别为22℃，
200rpm)提取4小时，得到含有安来霉素的提取液，然后将含有安来霉素的提取液在1800r/min的转速下离心20min，收集含有安来霉素的上清液，将上清液在40℃下减压浓缩至无液体，得到安来霉素粗提品。将大孔树脂按照常规处理方法进行预处理后，装入带有恒温保护套的玻璃柱子，用氯化钠浓度为0.09mol/L及甲醇体积分数为50％的甲醇水溶液以55mL/h的速度泵入柱子来完成平衡。安来霉素的粗提品溶解在15mL甲醇中，放在柱子的顶端，静止吸附4小时，用1.0L的洗脱剂(体积分数为70％的甲醇水溶液/盐酸浓度为0.006mol/L及甲醇体积分数为70％的甲醇水溶液的体积比为3∶7)梯度洗脱，将洗脱液用旋转真空蒸发器减压浓缩蒸干，产率达到63％。

[0036] 实施例3

[0037] 采用肉汤培养基将链霉菌Streptomyces sp.NJWGY3665菌种接到葡萄糖1％，牛肉膏1％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，琼脂2％、水94.5％，pH9.0的葡萄糖营养培养基中，进行斜面培养，在32℃下培养5天。取斜面菌种，加入2-3ml无菌水(每18×180mm的试管斜面菌种)，用接种环轻轻将菌苔洗下，制成孢子悬液，取1ml孢子悬液接种到含50ml葡萄糖3.0％，玉米浆1％，CaCO3 2％、酵母粉0.5％、NaCl 0.8％、水92.7％，pH 9.0的液体种子培养基中培养4天，培养温度为32℃，转速为200rpm。再将将50ml种子液接种到装液量为1.5L含有葡萄糖5.0％，淀粉0.5％，玉米浆3.0％、酵母膏0.5％、黄豆饼粉0.5％、NaCl1.5％、CaCO3 1.5％、NH4Cl 0.5％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸铵0.3％、水95％的发酵培养基的2L发酵罐中，在37℃，空气以总流速为1.0L/min流入，并以400rpm搅拌混合，维持溶氧浓度(DO)为60-100％。用20％(w/v)NaOH将pH值维持在8.5-9.0，适量补糖，当细胞浓度光密度(O.D.)水平达到32时，转入微氧，维持溶氧浓度(DO)为5-10％，发酵培养9天，获得含有安来霉素的菌丝体，将1g发酵后的菌丝体，用去离子水清洗，悬浮在130mL盐酸浓度为0.006mol/L及甲醇体积分数为50％的甲醇水溶液中，盐酸浓度为0.006mol/L及甲醇体积分数为50％的甲醇水溶液中，pH为6.5，用KQ-100型超声机进行微生物细胞破碎15min，得到含有安来霉素的混合物，将破碎后的混合物用HYG-IIa型摇瓶柜振荡(调节摇瓶柜的温度和转速分别为25℃，230rpm)提取2小时，得到含有安来霉素的提取液，然后将含有安来霉素的提取液在2500r/min的转速下离心25min，收集含有安来霉素的上清液，将上清液在38℃下减压浓缩至无液体，得到安来霉素粗提品。将大孔树脂按照常规处理方法进行预处理后，装入带有恒温保护套的玻璃柱子，用氯化钠浓度为0.09mol/L及甲醇体积分数为
50％的甲醇水溶液以65mL/h的速度泵入柱子来完成平衡。安来霉素的粗提品溶解在20mL盐酸浓度为0.006mol/L及甲醇体积分数为50％的甲醇水溶液中，放在柱子的顶端，静止吸附3小时，用2.0L的洗脱剂(体积分数为70％的甲醇水溶液/盐酸浓度为0.006mol/L及甲醇体积分数为50％的甲醇水溶液的体积比为5∶5)梯度洗脱，将洗脱液用旋转真空蒸发器减压浓缩蒸干，产率达到68％。

[0038] 实施例4

[0039] 将链霉菌Streptomyces sp.NJWGY3665菌种接到葡萄糖0.5％，牛肉膏0.8％、蛋白胨0.8％、K2HPO4 0.1％、琼脂1.8％、水96％，pH7.0的葡萄糖营养培养基中，进行斜面培养，在37℃下培养3天。取斜面菌种，加入2-3ml无菌水(每18×180mm的试管斜面菌种)，用接种环轻轻将菌苔洗下，制成孢子悬液，取0.5ml孢子悬液接种到孢子悬液接种到含40ml葡萄糖2.0％、玉米浆2.0％、CaCO3 1.5％、酵母粉0.5％、NaCl0.5％、水93.5％，pH7.0的液体种子培养基中培养4天，培养温度为30℃，转速为200rpm。再将10ml种子液接入到装液量为100ml含有葡萄糖2.0％，淀粉1.5％，玉米浆0.5％、酵母膏0.3％、黄豆饼粉1.5％、NaCl0.8％、CaCO3 1.5％、NH4Cl 0.5％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸铵0.3％、水90.9％的发酵培养基中，在32℃，220rpm，pH7.0的条件下摇床发酵培养6天，获得含有安来霉素的菌丝体，将1g发酵后的菌丝体，用去离子水清洗，悬浮在50mL甲醇中，甲醇的体积分数为80％，pH为5.5，用KQ-100型超声机进行微生物细胞破碎15min，得到含有安来霉素的混合物，将破碎后的混合物用HYG-IIa型摇瓶柜振荡(调节摇瓶柜的温度和转速分别为18℃，230rpm)提取1.5小时，得到含有安来霉素的提取液，然后将含有安来霉素的提取液在2000r/min的转速下离心20min，收集含有安来霉素的上清液，将上清液在35℃下减压浓缩至无液体，得到安来霉素粗提品。将大孔树脂按照常规处理方法进行预处理后，装入带有恒温保护套的玻璃柱子，用氯化钠浓度为0.09mol/L及甲醇体积分数为50％的甲醇水溶液以60mL/h的速度泵入柱子来完成平衡。安来霉素的粗提品溶解在20mL氯化钠浓度为
0.09mol/L及甲醇体积分数为50％的甲醇水溶液中，放在柱子的顶端，静止吸附5小时，用
1.0L的洗脱剂(氯化钠浓度为0.09mol/L及甲醇体积分数为50％的甲醇水溶液/盐酸浓度为0.006mol/L及甲醇体积分数为50％的甲醇水溶液的体积比为8∶2)梯度洗脱，将洗脱液用旋转真空蒸发器减压浓缩蒸干，产率达到71％。

[0040] 序列表

[0041] <110>南京工业大学

[0042] <120>一种安来霉素产生菌及利用大孔树脂提取的方法

[0043] <160>1

[0044] <210>1

[0045] <211>1650

[0046] <212>DNA

[0047] <213>链霉菌Streptomyces sp.

[0048] <400>1

[0049] attgagttta tcctggctca gggtttcttc ggtacgctga gtcgaaacac ccacttcgac 60[0050] gatatagttg cggctggatc acctccttag agtttgatcc tggctcagtg cggctagatc 120[0051] acctccttag agtttgatcc tggctcagga cgaacgctgg cggcgtgctt aacacatgca 180[0052] agtcgaacga tgaaccactt cggtggggat tagtggcgaa cgggtgagta acacgtgggc 240[0053] aatctgccct gcactctggg acaagccctg gaaacggggt ctaataccgg atactgaccc 300[0054] gcctgggcat ccaggcggtt cgaaagctcc ggcggtgcag ggtgagcccg cggcctatca 360