人参不定根组织培养方法

摘要

本发明公开了一种人参不定根组织培养方法，包括的步骤：人参愈伤组织的诱导，人参愈伤组织的扩增与继代培养，将诱导出的愈伤组织接种于准备好的固体培养基上，加入植物生长调节剂，在无菌、23～25℃及避光条件下培养3～4周；将扩增出的愈伤组织接种于准备好的固体培养基上，加入适当的植物生长调节剂，在无菌、23～25℃及避光条件下培养3～5周后可见到不定根的形成；将已形成的不定根挑出接种于准备好的液体培养基上，加入植物生长调节剂，在无菌、室温及光照条件下培养4～5周。本发明比培养人参细胞更具有实际意义，其生长速率要比原根快很多，并且其活性次生代谢产物的产率高且比较稳定，同时又不受天灾等自然环境的影响，具有工艺过程简单，诱导率高，重复性好，不定根增殖快等特点。

权利要求

1.一种人参不定根的组织培养方法，其特征在于包括的步骤：

1)人参愈伤组织的诱导：将人参根用清水洗净后，置烘箱中烘干，在超净工作台中用酒精喷洒人参根表面，火焰灼烧至干，用灭过菌的解剖刀在根表面割一个1～2cm的切口，并从两边断开，最后把内部的组织切成0.5～1cm的小块接到事先准备好的固体培养基上，在无菌、23～25℃及避光条件下培养3～4周后可见愈伤组织的形成，本步骤所述固体培养基为含有1mg/L 2，4-D、0.1mg/L KT、30g/L蔗糖的MS固体培养基，灭菌前pH调为5.8；

2)人参愈伤组织的扩增与继代培养：将诱导出的愈伤组织接种于准备好的固体培养基上，在无菌、23～25℃及避光条件下培养3～4周，本步骤所述固体培养基为含有1mg/L2，4-D、0.1mg/L KT、30g/L蔗糖的MS固体培养基，灭菌前pH调为5.8；

3)人参不定根的诱导：将扩增出的愈伤组织接种于准备好的固体培养基上，在无菌、

23～25℃及避光条件下培养3～5周后可见到不定根的形成，本步骤所述固体培养基为含有3mg/L IBA、0.1mg/L KT、30g/L蔗糖的MS固体培养基，灭菌前pH调为5.8；

4)人参不定根的扩繁与继代培养：将已形成的不定根挑出接种于准备好的液体培养基中，在无菌、室温及避光条件下培养4～5周，即可获得人参不定根，本步骤所述液体培养基为含有3mg/L IBA、0.1mg/L KT、30g/L蔗糖的MS液体培养基，灭菌前pH调为5.8。

说明书

人参不定根组织培养方法

技术领域：

[0001] 本发明公开了一种人参不定根组织培养方法，属于中药人参组织培养领域。背景技术：

[0002] 人参(Panax ginseng)是五加科人参属多年生双子叶植物，以根入药最为常见。现代药理学研究表明，人参具有调节糖代谢、增强免疫力、延缓衰老、抗肿瘤、降血压、预防及治疗心血管疾病、保肝护肝、增强学习能力和记忆能力、益智等作用。由于多年来的过度采挖，人参赖以生存的森林生态环境遭到严重破坏，野生人参资源枯竭，目前用于药用的多为栽培人参。然而人参的栽培生产周期长，占地面积大，且其品质易受气候、栽培条件及病虫害的影响，供应难以满足市场的需求；农残超标、老参地等问题也极大地限制了人工栽培人参的发展前景。人参组织培养方法具有不受生长季节限制、不携带病毒、培养周期短等优点，且易于进行工业化大规模生产，因此具有很大的发展前途。目前我国关于人参组织培养的报道很多，但主要集中于愈伤组织以及悬浮细胞的培养，不定根的培养尚未见报道。
发明内容：

[0003] 本发明的目的在于提供一种人参不定根组织培养的方法。该方法快速可行，可以提供均一的培养物。工艺简单，成本低廉，重复性好。

[0004] 本发明在于提供的一种人参不定根组织培养的方法包括的步骤：

[0005] 步骤一，人参愈伤组织的诱导：将人参根用清水洗净后，置烘箱中烘干。在超净工作台中用酒精喷洒西洋参根表面，火焰灼烧至干。用灭过菌的解剖刀在根表面割一个1～2cm的切口，并从两边断开，最后把内部的组织切成0.5～1cm的小块接到事先准备好的固体培养基上，在无菌、23～25℃及避光条件下培养3～4周后可见愈伤组织的形成；步骤二，人参愈伤组织的扩增与继代培养：将诱导出的愈伤组织接种于准备好的固体培养基上，加入植物生长调节剂，在无菌、23～25℃及避光条件下培养3～4周；步骤三，人参不定根的诱导：将扩增出的愈伤组织接种于准备好的固体培养基上，加入适当的植物生长调节剂，在无菌、23～25℃及避光条件下培养3～5周后可见到不定根的形成；步骤四，人参不定根的扩繁与继代培养：将已形成的不定根挑出接种于准备好的液体培养基上，加入植物生长调节剂，在无菌、室温及光照条件下培养4～5周，即可获得本发明的人参不定根。

[0006] 本发明利用组织培养方法培养人参不定根，比培养人参细胞更具有实际意义，其生长速率要比原根快很多，并且其活性次生代谢产物的产率高且比较稳定，同时又不受天灾等自然环境的影响。本发明具有工艺过程简单，诱导率高，重复性好，不定根增殖快等特点。

附图说明

[0007] 图1人参愈伤组织。

[0008] 图2从人参愈伤组织上诱导不定根。

[0009] 图3在液体培养基中扩繁的人参不定根。具体实施方式：

[0010] 实例一：

[0011] 用1mol/L的HCl和NaOH溶液将100mL含有1mg/L 2，4-D、0.1mg/L KT、30g/L蔗糖的MS固体培养基调至pH 5.8，在121℃、0.1MPa的压力下灭菌15分钟备用；将东北吉林栽培人参的新鲜根(由中国农科院左家特产研究所提供)用自来水冲洗干净，至于45℃烘箱中烘干，然后在超净台中用75％的乙醇喷洒表面，用酒精灯火焰灼烧至干以消毒灭菌，之后用灭过菌的解剖刀在根表面割一个1cm的切口，并从两边断开，再把内部的组织切成0.5cm左右的小块接到事先准备好的MS固体培养基中，在无菌、23℃及避光条件下培养以诱导愈伤组织，培养4周后可见愈伤组织的形成。用1mol/L的HCl和NaOH溶液将100mL含有1mg/L 2，4-D、0.1mg/L KT、30g/L蔗糖的MS固体培养基调至pH 5.8，在121℃、0.1MPa的压力下灭菌15分钟备用；选择生长良好的愈伤组织，用事先灭菌的解剖刀和镊子接种于准备好的MS固体培养基中，在无菌、23℃及避光条件下进行人参愈伤组织的扩增与继代培养，培养周期为4周。用1mol/L的HCl和NaOH溶液将100mL含有3mg/L IBA、0.1mg/L KT、
30g/L蔗糖的MS固体培养基调至pH 5.8，在121℃、0.1MPa的压力下灭菌15分钟备用；选择生长良好的愈伤组织，用事先灭菌的解剖刀和镊子接种于准备好的MS固体培养基上，在无菌、23℃及避光条件下进行人参不定根的诱导，培养4周后可见到不定根的形成。用1mol/L的HCl和NaOH溶液将装在250mL三角瓶中的100mL含有3mg/L IBA、0.1mg/L KT、30g/L蔗糖的MS液体培养基调至pH 5.8，在121℃、0.1MPa的压力下灭菌15分钟备用；选取生长良好的不定根，用事先灭菌的解剖刀和镊子挑出接种于事先准备好的MS液体培养基中，在
100rpm速度的摇床上，无菌、室温及避光条件下进行人参不定根的扩繁与继代培养，培养周期为4周，即可获得本发明的人参不定根。如图1-3所示。

[0012] 实例二：

[0013] 用1mol/L的HCl和NaOH溶液将100mL含有2mg/L 2，4-D、0.5mg/L KT、30g/L蔗糖的MS固体培养基调至pH 5.9，在121℃、0.1MPa的压力下灭菌20分钟备用；将东北吉林栽培人参的新鲜根(由中国农科院左家特产研究所提供)用自来水冲洗干净，至于50℃烘箱中烘干，然后在超净台中用75％的乙醇喷洒表面，用酒精灯火焰灼烧至干以消毒灭菌，之后用灭过菌的解剖刀在根表面割一个2cm的切口，并从两边断开，再把内部的组织切成1cm左右的小块接到事先准备好的MS固体培养基中，在无菌、24℃及避光条件下培养以诱导愈伤组织，培养3周后可见愈伤组织的形成。用1mol/L的HCl和NaOH溶液将100mL含有2mg/L2，4-D、0.5mg/L KT、30g/L蔗糖的MS固体培养基调至pH 5.9，在121℃、0.1MPa的压力下灭菌20分钟备用；选择生长良好的愈伤组织，用事先灭菌的解剖刀和镊子接种于准备好的MS固体培养基中，在无菌、24℃及避光条件下进行人参愈伤组织的扩增与继代培养，培养周期为4周。用1mol/L的HCl和NaOH溶液将100mL含有4mg/L IBA、0.3mg/L KT、40g/L蔗糖的MS固体培养基调至pH 5.9，在121℃、0.1MPa的压力下灭菌20分钟备用；选择生长良好的愈伤组织，用事先灭菌的解剖刀和镊子接种于准备好的MS固体培养基上，在无菌、24℃及避光条件下进行人参不定根的诱导，培养4周后可见到不定根的形成。用1mol/L的HCl和NaOH溶液将装在250mL三角瓶中的100mL含有4mg/L IBA、0.3mg/L KT、40g/L蔗糖的MS液体培养基调至pH 5.9，在121℃、0.1MPa的压力下灭菌20分钟备用；选取生长良好的不定根，用事先灭菌的解剖刀和镊子挑出接种于事先准备好的MS液体培养基中，在110rpm速度的摇床上，无菌、室温及避光条件下进行人参不定根的扩繁与继代培养，培养周期为5周，即可获得本发明的人参不定根。

[0014] 实例三：

[0015] 用1mol/L的HCl和NaOH溶液将100mL含有4mg/L 2，4-D、1mg/L KT、30g/L蔗糖的MS固体培养基调至pH 6.0，在121℃、0.1MPa的压力下灭菌25分钟备用；将东北吉林栽培人参的新鲜根(由中国农科院左家特产研究所提供)用自来水冲洗干净，至于50℃烘箱中烘干，然后在超净台中用75％的乙醇喷洒表面，用酒精灯火焰灼烧至干以消毒灭菌，之后用灭过菌的解剖刀在根表面割一个2cm的切口，并从两边断开，再把内部的组织切成0.5cm左右的小块接到事先准备好的MS固体培养基中，在无菌、25℃及避光条件下培养以诱导愈伤组织，培养3周后可见愈伤组织的形成。用1mol/L的HCl和NaOH溶液将100mL含有4mg/L 2，4-D、1mg/L KT、30g/L蔗糖的MS固体培养基调至pH 6.0，在121℃、0.1MPa的压力下灭菌25分钟备用；选择生长良好的愈伤组织，用事先灭菌的解剖刀和镊子接种于准备好的MS固体培养基中，在无菌、25℃及避光条件下进行人参愈伤组织的扩增与继代培养，培养周期为4周。用1mol/L的HCl和NaOH溶液将100mL含有5mg/L IBA、0.5mg/L KT、50g/L蔗糖的MS固体培养基调至pH 6.0，在121℃、0.1MPa的压力下灭菌25分钟备用；选择生长良好的愈伤组织，用事先灭菌的解剖刀和镊子接种于准备好的MS固体培养基上，在无菌、25℃及避光条件下进行人参不定根的诱导，培养4周后可见到不定根的形成。用1mol/L的HCl和NaOH溶液将装在250mL三角瓶中的100mL含有5mg/L IBA、0.5mg/L KT、50g/L蔗糖的MS液体培养基调至pH 6.0，在121℃、0.1MPa的压力下灭菌25分钟备用；选取生长良好的不定根，用事先灭菌的解剖刀和镊子挑出接种于事先准备好的MS液体培养基中，在120rpm速度的摇床上，无菌、室温及避光条件下进行人参不定根的扩繁与继代培养，培养周期为5周，即可获得本发明的人参不定根。