L-苯基乙酰基甲醇的制备方法

摘要

一种生物工程技术领域的L-苯基乙酰基甲醇的制备方法，包括如下步骤：发酵面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)，获得酵母细胞；配制转化培养基，100ml转化培养基的组成为：苯甲醛0.9ml、乙醛0.6ml、0.1g MgSO4、0.005gCaCl2、蛋白胨0～2g、酵母粉0～2g，余量为水；调节pH为5.2；取转化培养基，每100ml转化培养基加入如下物质：Triton X-100 2～10g，酵母细胞3～15g，葡萄糖1.2～6g；得混合培养基；培养混合培养基6～24小时，得到L-苯基乙酰基甲醇。本发明在高底物/产物浓度下，利用活细胞作为生物催化剂的生物转化过程，获得高产物浓度的具有手性结构的重要医药中间体L-苯基乙酰基甲醇。

权利要求

1.一种L-苯基乙酰基甲醇的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，发酵面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)，获得酵母细胞；

步骤二，配制转化培养基，100ml转化培养基的组成为：苯甲醛0.9ml、乙醛0.6ml、0.1g MgSO4、0.005g CaCl2、蛋白胨2g、酵母粉2g，余量为水；利用Na2HPO4·12H2O和柠檬酸调节pH为5.2；

步骤三，取转化培养基，每100ml转化培养基加入如下物质：Triton X-100 8g，酵母细胞12g，葡萄糖3g；得混合培养基；

步骤四，用50ml摇瓶盛装混合培养基，盛装混合培养基的体积为摇瓶容量的20％，培养8小时。

2.一种L-苯基乙酰基甲醇的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，发酵面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)，获得酵母细胞；

步骤二，配制转化培养基，100ml转化培养基的组成为：苯甲醛0.9ml、乙醛0.6ml、0.1g MgSO4、0.005g CaCl2、蛋白胨2g、酵母粉2g，余量为水；利用Na2HPO4·12H2O和柠檬酸调节pH为5.2；

步骤三，取转化培养基，每100ml转化培养基加入如下物质：Triton X-100 8g，酵母细胞15g，葡萄糖3g；得混合培养基；

步骤四，用50ml摇瓶盛装混合培养基，盛装混合培养基的体积为摇瓶容量的20％，培养8小时。

说明书

L-苯基乙酰基甲醇的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种生物工程技术领域的制备方法，具体是一种L-苯基乙酰基甲醇的制备方法。

背景技术

[0002] 麻黄素是一种常用的药物。获得麻黄素原料的方法通常有从天然麻黄草中提取、化学合成和生物合成等途径。由于天然资源麻黄草生长受地理位置、季节等影响，尤其麻黄草为沙漠植物，过度采集对沙漠地区的生态环境造成严重影响，天然资源已经十分匮乏。因麻黄素分子存在两个手性中心，化学合成方法也不经济。利用面包酵母的脱羧酶对丙酮酸的脱羧反应和苯甲醛结合合成手性苯基乙酰基甲醇。该手性中间体苯基乙酰基甲醇进一步经化学合成得到麻黄素是一条在国外已经工业化生产的合成路线。利用面包酵母的脱羧酶对丙酮酸的脱羧反应和苯甲醛结合合成手性苯基乙酰基甲醇反应的特点是：(1)必须利用活细胞作为生物催化剂，利用活细胞的代谢产物丙酮酸；(2)利用全细胞作为生物催化剂，副反应多，虽相对苯甲醛的产物收率只有60％左右，但原料价格低、工艺简单；(3)这类反应都是以中等极性或弱极性的有机化合物作为底物/产物。高浓度的底物/产物将抑制甚至毒害微生物的生长和活性，这导致常规的水溶液系统中生物转化过程的产物浓度很低而使其缺乏工业化价值。故高产物浓度是该反应工业化追求的主要目标参数。

[0003] 常规水溶液中的生物转化因底物/产物的生物毒性而只能在低浓度下进行，导致在国内外的微生物转化文献中除采用复杂的过程控制技术外很少有产物超过10g/L的报道。为了提高催化反应的效率，介质工程已成为研究的新热点。其中水-有机溶剂两相分配系统被视为一种有效的手段，但生物催化剂在有机溶剂中，尤其是具有中等极性的有机溶剂中，生物相容性差，这导致具有中等极性的底物/产物的生物转化不能实现萃取生物转化。

[0004] 经对现有技术文献的检索发现，《Wenzhi Zhang，Zhilong Wang，WeiLi，Baohua Zhuang，Hanshi Qi，Production of L-phenylacetylcarbinol bymicrobial transformation in polyethylene glycol induced cloud pointsystem.”Applied microbiology and biotechnology.2008，78：233-239》(张文智，王志龙，李薇，张宝华，齐瀚实，“PEG诱导浊点系统微生物转化生产L-苯基乙酰基甲醇”，《应用微生物与生物技术》)报道，采用PEG诱导非离子表面活性剂胶束溶液相分离的浊点系统技术成功地实现了萃取微生物转化，但存在复杂的下游分离过程。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种L-苯基乙酰基甲醇的制备方法。本发明在高底物/产物浓度下，利用活细胞作为生物催化剂的生物转化过程，以获得高产物浓度的具有手性结构的重要医药中间体L-苯基乙酰基甲醇。

[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括如下步骤：

[0007] 步骤一，发酵面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)，获得酵母细胞；

[0008] 步骤二，配制转化培养基，100ml转化培养基的组成为：苯甲醛0.9ml、乙醛0.6ml、0.1g MgSO4、0.005g CaCl2、蛋白胨0～2g、酵母粉0～2g，余量为水；调节pH为5.2；

[0009] 步骤三，取转化培养基，每100ml转化培养基加入如下物质：Triton X-1002～10g，酵母细胞3～15g，葡萄糖1.2～6g；得混合培养基；

[0010] 步骤四，培养混合培养基6～24小时，得到L-苯基乙酰基甲醇。

[0011] 步骤一中，所述发酵具体为：发酵培养基为，100ml培养基的组成为：2g蛋白胨、2g酵母粉、2g葡萄糖，余量为水；30℃下，200rpm的摇床中培养1天。

[0012] 步骤一中，所述获得酵母细胞为，4000rpm离心发酵液，收集得到酵母细胞。

[0013] 步骤二中，所述调节pH是利用Na2HPO4·12H2O和柠檬酸进行调节的。

[0014] 步骤四中，所述培养具体为：在摇瓶中盛装为摇瓶容量的10～70％的混合培养基进行培养。

[0015] 本发明涉及面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)可通过公开市售的商业渠道得到，例如产地为湖北武汉的安琪牌面包酵母。

[0016] 本发明利用活细胞的代谢功能将葡萄糖转化为丙酮酸。在活细胞中存在丙酮酸脱羧酶实现丙酮酸脱羧反应而产生活性乙醛。活性乙醛和在转化液添加的底物苯甲醛缩合而合成具有手续结构的产物L-苯基乙酰基甲醇。

[0017] 与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明采用表面活性剂胶束溶液的萃取技术，通过考察表面活性剂胶束溶液中微生物转化的操作参数，包括微生物细胞和葡萄糖的量、溶氧水平、以及转化介质的基本组成等因素对生物转化过程中产物浓度的影响，优化了表面活性剂胶束溶液中生物转化的条件实现了高产物浓度(转化液中L-苯基乙酰基甲醇浓度接近10g/L)的生物转化，其工艺具有工业化应用价值。采用经济实用的技术实现表面活性剂胶束溶液中产品的分离将进一步推进其工业化应用的进程。

附图说明

[0018] 图1为本发明方法原理图；

[0019] 图2为实施例1最终得到的反应液的HPLC检测结果图。

具体实施方式

[0020] 以下实例将结合附图对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0021] 如图1所示，下列实施例微生物转化合成L-苯基乙酰基甲醇的原理是：利用活细胞的代谢功能将葡萄糖转化为丙酮酸。在活细胞中存在丙酮酸脱羧酶实现丙酮酸脱羧反应而产生活性乙醛。活性乙醛和在转化液添加的底物苯甲醛缩合而合成具有手续结构的产物L-苯基乙酰基甲醇。

[0022] 本发明涉及面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)可通过公开市售的商业渠道得到，例如产地为湖北武汉的安琪牌面包酵母。发酵酵母获得酵母细胞的过程为：发酵培养基为，100ml培养基的组成为：2g蛋白胨、2g酵母粉、2g葡萄糖，余量为水；30℃下，200rpm的摇床中培酵母1天；4000rpm离心发酵液，收集得到酵母细胞。

[0023] 实施例1

[0024] 步骤一，发酵面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)，获得酵母细胞；

[0025] 步骤二，配制转化培养基，100ml转化培养基的组成为：苯甲醛0.9ml、乙醛0.6ml、0.1g MgSO4、0.005g CaCl2、蛋白胨2g、酵母粉2g，余量为水；利用Na2HPO4·12H2O和柠檬酸调节pH为5.2；

[0026] 步骤三，取转化培养基，每100ml转化培养基加入如下物质：Triton X-1008g，酵母细胞3g，葡萄糖3g；得混合培养基；

[0027] 步骤四，用50ml摇瓶盛装混合培养基，盛装混合培养基的体积为摇瓶容量的20％，培养8小时。

[0028] 如图1所示，对最终得到的反应液进行HPLC检测，具体分析条件是：仪器为Waters高压液相色谱，附件为C18分离柱和Waters 2996多波长检测器。最终得到的反应液用甲醇稀释两倍作为样品溶液，以乙腈：水(体积比为70∶30)作为流动相，流速为1ml/分。在产品L-苯基乙酰基甲醇的特征吸收峰283nm处检测，L-苯基乙酰基甲醇和底物苯甲醛的停留时间分别约为9.4和18.8分钟，最终可以确认制备得到的L-苯基乙酰基甲醇浓度为4.5g/L。

[0029] 实施例2

[0030] 本实施例与实施例1的区别之处在于：步骤三中，取转化培养基，每100ml转化培养基加入如下物质：Triton X-100 2g，酵母细胞3g，葡萄糖3g；得混合培养基。其余条件与实施例1相同。

[0031] 对最终得到的反应液进行HPLC检测，最终可以确认制备得到的L-苯基乙酰基甲醇浓度为0.5g/L。

[0032] 实施例3

[0033] 本实施例与实施例1的区别之处在于：步骤三中，取转化培养基，每100ml转化培养基加入如下物质：Triton X-100 10g，酵母细胞3g，葡萄糖3g；得混合培养基。其余条件与实施例1相同。

[0034] 对最终得到的反应液进行HPLC检测，最终可以确认制备得到的L-苯基乙酰基甲醇浓度为3g/L。

[0035] 实施例4

[0036] 本实施例与实施例1的区别之处在于：步骤三中，取转化培养基，每100ml转化培养基加入如下物质：Triton X-100 8g，酵母细胞3g，葡萄糖6g；得混合培养基。其余条件与实施例1相同。

[0037] 对最终得到的反应液进行HPLC检测，最终可以确认制备得到的L-苯基乙酰基甲醇浓度为5g/L。

[0038] 实施例5

[0039] 本实施例与实施例4的区别之处在于：步骤三中，取转化培养基，每100ml转化培养基加入如下物质：Triton X-100 8g，酵母细胞3g，葡萄糖1.2g；得混合培养基。其余条件与实施例4相同。

[0040] 对最终得到的反应液进行HPLC检测，最终可以确认制备得到的L-苯基乙酰基甲醇浓度为2g/L。

[0041] 实施例6

[0042] 本实施例与实施例1的区别之处在于：步骤四中，用50ml摇瓶盛装混合培养基，盛装混合培养基的体积为摇瓶容量的10％，培养8小时。其余条件与实施例1相同。

[0043] 对最终得到的反应液进行HPLC检测，最终可以确认制备得到的L-苯基乙酰基甲醇浓度为6g/L。

[0044] 实施例7

[0045] 本实施例与实施例6的区别之处在于：步骤四中，用50ml摇瓶盛装混合培养基，盛装混合培养基的体积为摇瓶容量的70％，培养8小时。其余条件与实施例6相同。

[0046] 对最终得到的反应液进行HPLC检测，最终可以确认制备得到的L-苯基乙酰基甲醇浓度为5.5g/L。

[0047] 实施例8

[0048] 本实施例与实施例1的区别之处在于：步骤三中，取转化培养基，每100ml转化培养基加入如下物质：Triton X-100 8g，酵母细胞12g，葡萄糖3g；得混合培养基。其余条件与实施例1相同。

[0049] 对最终得到的反应液进行HPLC检测，最终可以确认制备得到的L-苯基乙酰基甲醇浓度为7.5g/L。

[0050] 实施例9

[0051] 本实施例与实施例8的区别之处在于：步骤三中，取转化培养基，每100ml转化培养基加入如下物质：Triton X-100 8g，酵母细胞15g，葡萄糖3g；得混合培养基。其余条件与实施例8相同。

[0052] 对最终得到的反应液进行HPLC检测，最终可以确认制备得到的L-苯基乙酰基甲醇浓度为7.7g/L。

[0053] 实施例10

[0054] 本实施例与实施例8的区别之处在于：步骤二中，配制转化培养基，100ml转化培养基的组成为：苯甲醛0.9ml、乙醛0.6ml、0.1g MgSO4、0.005g CaCl2、酵母粉2g，余量为水；调节pH为5.2；其余条件与实施例8相同。

[0055] 对最终得到的反应液进行HPLC检测，最终可以确认制备得到的L-苯基乙酰基甲醇浓度为8.5g/L。

[0056] 实施例11

[0057] 本实施例与实施例10的区别之处在于：步骤四中，用50ml摇瓶盛装混合培养基，盛装混合培养基的体积为摇瓶容量的20％，培养24小时。其余条件与实施例10相同。

[0058] 对最终得到的反应液进行HPLC检测，最终可以确认制备得到的L-苯基乙酰基甲醇浓度为9.7g/L。

[0059] 实施例12

[0060] 本实施例与实施例10的区别之处在于：步骤四中，用50ml摇瓶盛装混合培养基，盛装混合培养基的体积为摇瓶容量的20％，培养10小时。其余条件与实施例10相同。

[0061] 对最终得到的反应液进行HPLC检测，最终可以确认制备得到的L-苯基乙酰基甲醇浓度为9.7g/L。

[0062] 实施例13

[0063] 本实施例与实施例10的区别之处在于：步骤四中，用50ml摇瓶盛装混合培养基，盛装混合培养基的体积为摇瓶容量的20％，培养6小时。其余条件与实施例10相同。

[0064] 对最终得到的反应液进行HPLC检测，最终可以确认制备得到的L-苯基乙酰基甲醇浓度为7.5g/L。

[0065] 实施例14

[0066] 本实施例与实施例8的区别之处在于：步骤二中，配制转化培养基，100ml转化培养基的组成为：苯甲醛0.9ml、乙醛0.6ml、0.1g MgSO4、0.005g CaCl2、余量为水；调节pH为5.2；其余条件与实施例8相同。

[0067] 对最终得到的反应液进行HPLC检测，最终可以确认制备得到的L-苯基乙酰基甲醇浓度为8.4g/L。