重复利用高山被孢霉菌粕制备花生四烯酸的方法

摘要

本发明涉及一种利用高山被孢霉菌丝体制备花生四烯酸的方法，包括有下述步骤：首先在恒温摇床中将高山被孢霉接种量的深层培养；再转接于装有发酵培养基的器皿中，培养后获得发酵醪液，其中生长培养基或/和发酵培养基的氮源以高山被孢霉菌粕代替部分常用氮源，高山被孢霉菌粕中的氮源替代比以质量百分比计为10％～90％；发酵醪液经过滤，收集的霉菌生物体，经洗涤、干燥、粉碎，采用非极性溶剂进行浸提或压榨，收获油脂，收获的油脂经进一步处理获得目标产品，霉菌生物体经非极性溶剂浸提后剩余固体物质，即为可循环使用的高山被孢霉菌粕，本发明利用高山被孢霉发酵生产花生四烯酸过程中产生的废弃物得到循环利用，避免了环境污染物的排放。

权利要求

1.重复利用高山被孢霉菌粕制备花生四烯酸的方法，其特征在于包括有下述步骤：首先在恒温摇床中对装有生长培养基的器皿中的高山被孢霉进行接种量的深层培养；再将培养好的高山被孢霉转接于装有发酵培养基的器皿中，培养后获得发酵醪液，其中生长培养基或/和发酵培养基的氮源以高山被孢霉菌粕代替部分常用氮源，高山被孢霉菌粕中的氮源替代比以质量百分比计为10％～90％；获得的发酵醪液经过滤，收集的霉菌生物体，经洗涤、干燥、粉碎，采用非极性溶剂进行浸提或压榨，收获油脂，收获的油脂经进一步处理获得目标产品：花生四烯酸油脂，霉菌生物体经非极性溶剂浸提后剩余固体物质，即为可循环使用的高山被孢霉菌粕。

2.按权利要求1所述的重复利用高山被孢霉菌粕制备花生四烯酸的方法，其特征在于所述的高山被孢霉菌粕在进行循环使用前进行粉碎，再采用复合酶法对高山被孢霉菌粕进行水解处理，复合酶法中所使用的蛋白酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶或酸性蛋白酶。

3.按权利要求1所述的重复利用高山被孢霉菌粕制备花生四烯酸的方法，其特征在于所述的高山被孢霉菌粕在进行循环使用前可采用膨化法对高山被孢霉菌粕进行膨化处理，再将膨化后的高山被孢霉菌粕进行粉碎。

4.按权利要求1所述的重复利用高山被孢霉菌粕制备花生四烯酸的方法，其特征在于所述的高山被孢霉菌粕在进行循环使用前可采用膨化法对高山被孢霉菌粕进行膨化处理，进行粉碎后，再采用复合酶法对高山被孢霉菌粕进行水解处理，复合酶法中所使用的蛋白酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶或酸性蛋白酶。

5.按权利要求1至4任意一项所述的重复利用高山被孢霉菌粕制备花生四烯酸的方法，其特征在于优选的高山被孢霉菌粕的替代比以质量百分比计为30％～60％。

6.按权利要求2至4任意一项所述的重复利用高山被孢霉菌粕制备花生四烯酸的方法，其特征在于所述的高山被孢霉菌粕应粉碎至过20～100目的筛分。

7.按权利要求6所述的重复利用高山被孢霉菌粕制备花生四烯酸的方法，其特征在于优选的高山被孢霉菌粕应粉碎至过60～80目的筛分。

8.按权利要求1所述的重复利用高山被孢霉菌粕制备花生四烯酸的方法，其特征在于所述的高山被孢霉生长培养温度为25-30度，生长培养时间2-5天。

9.按权利要求8所述的重复利用高山被孢霉菌粕制备花生四烯酸的方法，其特征在于所述的高山被孢霉发酵培养温度为25-30度，发酵培养时间5-12天。

10.按权利要求8所述的重复利用高山被孢霉菌粕制备花生四烯酸的方法，其特征在于所述的高山被孢霉发酵培养采取变温培养，发酵前期在30度下培养2-3天，发酵中期以每12h 降温1度培养，发酵后期在25度下培养，发酵培养时间5-12天。

11.按权利要求1所述的重复利用高山被孢霉菌粕制备花生四烯酸的方法，其特征在于所述的常用氮源为酵母提取物、玉米浆及其干粉、大豆粉、植物蛋白水解物中的一种或多种。

12.按权利要求1所述的重复利用高山被孢霉菌粕制备花生四烯酸的方法，其特征在于所述的非极性溶剂为丁烷、己烷、乙醚、石油醚中的一种或多种。

说明书

重复利用高山被孢霉菌粕制备花生四烯酸的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种微生物发酵的生产方法，具体的讲是涉及一种利用高山被孢霉菌丝体制备花生四烯酸的方法。

背景技术

[0002] 近年来，长链多不饱和脂肪酸在人体中的生理和治疗功能得到了越来越多的重视和认同。已经有大量的资料及文献在介绍利用生物工程的方法生产，同时很多产品已经走向市场。花生四烯酸的发酵主要是利用高山被孢霉进行生产，高山被孢霉发酵获得霉菌生物体，将富集的霉菌生物体滤干并干燥、浸提获得花生四烯酸(ARA)后的微生物残体，将此微生物残体称为高山被孢霉菌粕(同大豆提油后的豆粕)。从目前相关的资料可以看到，高山被孢霉的含油率在50％左右，因此可以说每生产一吨的ARA(花生四烯酸)油脂，就会有一吨的菌粕废弃，霉菌生物体在浸提油脂的过程中，基本上只将脂质成分浸提出，其它成分几乎全部残留在生物体中，含有高山被孢霉生长的所有营养物质，通过对高山被孢霉菌粕的检测分析，该物质的含氮量高达5％以上，含氮量丰富，属于优质的氮源。目前在ARA发酵过程中所使用的原料主要包括葡萄糖为碳源，不同的公司使用了不同的氮源，例如，专利申请公开CN1786178利用气升式生物反应器高效生产高纯度花生四烯酸的方法中所使用的氮源为氨基酸和酵母浸出物；专利申请公开CN1539982花生四烯酸油脂及其微生物发酵生产方法中，所使用的氮源包括豆饼粉、酵母膏、蛋白胨、鱼粉、豆芽汁、牛肉膏、硝酸钾、硝酸钠；专利申请公开CN1696300花生四烯酸及其生产和使用方法中所使用的氮源为酵母浸出物。

[0003] 目前，高山被孢霉菌粕一般作为废弃物进行填埋处理，或者作为肥料用于蔬菜生产，或者作为饲料用于水产品的生产。现有的公开文献都没有提及到关于花生四烯酸生产中的废弃物菌粕的重复利用。

发明内容

[0004] 本发明所要解决的问题是针对上述现有技术而提供一种重复利用高山被孢霉粕作为生长培养基和发酵培养基的部分氮源进行花生四烯酸的生产方法。

[0005] 本发明为解决上述提出的问题所采用解决方案为：重复利用高山被孢霉菌粕制备花生四烯酸的方法，其特征在于包括有下述步骤：首先在恒温摇床中将装有生长培养基的器皿进行高山被孢霉接种量的深层培养；再将培养好的高山被孢霉转接于装有发酵培养基的器皿中，培养后获得发酵醪液，其中生长培养基或/和发酵培养基的氮源以高山被孢霉菌粕代替部分常用氮源，高山被孢霉菌粕中的氮源替代比以质量百分比计为10％～90％；获得的发酵醪液经过滤，收集的霉菌生物体，经洗涤、干燥、粉碎，采用非极性溶剂进行浸提或压榨，收获油脂，收获的油脂经进一步处理获得目标产品：花生四烯酸油脂，霉菌生物体经非极性溶剂浸提后剩余固体物质，即为可循环使用的高山被孢霉菌粕。

[0006] 按上述方案，所述的高山被孢霉菌粕在进行循环使用前进行粉碎，再采用复合酶法对高山被孢霉菌粕进行水解处理，复合酶法中所使用的蛋白酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶或酸性蛋白酶。

[0007] 按上述方案，所述的高山被孢霉菌粕在进行循环使用前可采用膨化法对高山被孢霉菌粕进行膨化处理，再将膨化后的高山被孢霉菌粕进行粉碎。

[0008] 按上述方案，所述的高山被孢霉菌粕在进行循环使用前可采用膨化法对高山被孢霉菌粕进行膨化处理，进行粉碎后，再采用复合酶法对高山被孢霉菌粕进行水解处理，复合酶法中所使用的蛋白酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶或酸性蛋白酶。

[0009] 按上述方案，优选的高山被孢霉菌粕的替代比以质量百分比计为30％～60％。

[0010] 按上述方案，所述的高山被孢霉菌粕应粉碎至过20～100目的筛分。

[0011] 按上述方案，优选的高山被孢霉菌粕应粉碎至过60～80目的筛分。

[0012] 按上述方案，所述的常用氮源为酵母提取物、玉米浆及其干粉、大豆粉、植物蛋白水解物中的一种或多种。

[0013] 按上述方案，所述的非极性溶剂为丁烷、己烷、乙醚、石油醚中的一种或多种。

[0014] 本发明所涉及的高山被孢霉菌粕是利用高山被孢霉发酵获得霉菌生物体，霉菌生物体经沸腾干燥、浸提获得花生四烯酸(ARA)后的微生物残体。在浸提收获花生四烯酸后的微生物残体中，含有高山被孢霉生长的所有营养物质，还含有8～10％的残油，残油主要成分是饱和或者不饱和的甘油三酯，而残油中至少含有40％以上的花生四烯酸。高山被孢霉菌粕一般作为废弃物进行填埋处理，或者作为肥料用于蔬菜生产，或者作为饲料用于水产品的生产。

[0015] 本发明的方法中，高山被孢霉菌粕作为氮源重复利用，部分替代常用氮源，在适合于生产ARA油的条件下培养霉菌生物体。例如，在摇瓶中进行高山被孢霉接种量的深层培养。摇瓶中装有生长培养基，接种高山被孢霉菌种，在恒温摇床中培养约2至3天，转接于装有发酵培养基的摇瓶中，在恒温摇床进行连续培养，培养7至10天。

[0016] 本发明的生长和发酵培养基的组成可以不相同，但都含有碳源和氮源。一般使用的碳源是葡萄糖，也可以是果糖或者糖蜜、水解淀粉以及其它用于发酵的低成本常规碳源。一般情况下，在培养过程中需要补充加入碳源。这是因为，碳源在菌丝体培养过程中消耗量较大，一次添加过多碳源往往会对菌丝体的生长产生明显不利影响。生长和发酵培养基的氮源一般是酵母提取物、玉米浆以及其干粉、大豆粉、植物蛋白水解物等。本发明所述的高山被孢霉菌粕代替部分氮源，可以成批加入，即培养前一次性全部加入，也可以分批加入。

[0017] 本发明培养过程一般在25℃至30℃培养2至3天，生长的生物体可以满足发酵摇瓶的接种要求。采用多极连续发酵罐的生物体培养物培养时间可以根据实际需要延长1天至2天。培养的温度工艺与菌种有很大的不同，也与生产的工艺有关。这是发酵领域技术人员容易控制的。例如，一级种子罐培养2天至3天，二级种子培养1天至2天，转接发酵罐进行发酵培养，发酵培养周期为5至12天。

[0018] 本发明在一般情况下，高山被孢霉接种量可以不相同，接种量可以使用1％至30％，较好的接种量为5％至25％，例如，摇瓶种子接种发酵摇瓶采用10％的接种量，摇瓶种子接种一级种子罐采用1％接种量，一级种子罐接种二级种子罐采用8％的接种量，二级种子罐接种发酵罐采用25％的接种量。

[0019] 在发酵培养过程中必须对营养物质水平进行监测。发酵摇瓶培养过程中不需要补充碳源和氮源。发酵罐培养过程中当葡萄糖水平降低至5g/l时，应流加补充葡萄糖。在一个完整的培养周期使用每升超过80克葡萄糖和超过10克的酵母提取物。在培养过程中氮源将提前耗尽，有利于促使高山被孢霉产生油脂。

[0020] 对上述发酵摇瓶培养的霉菌生物体进行后续处理，对产品的后续处理我们主要采取对霉菌生物体进行干燥提油的工艺，主要包括霉菌生物体的收集、干燥及油脂提取。

[0021] 在适宜的培养条件下，进行发酵培养，根据花生四烯酸含量确定收获霉菌生物体。当高山被孢霉中的花生四烯酸含量不低于40％，可以收获霉菌生物体。其中霉菌生物体的收集前，首先需要对其进行灭活，灭活的方式主要是采用高温瞬时灭菌的方法，也可以采用
80度及以上低温灭活的方法，目的在于防止微生物在后处理中异常的生化反应。对于灭活的产品可以采用各种合适的方法收集，例如过滤、离心等。优先采用成本较低的过滤方法。
发酵醪液经高压板框过滤，霉菌生物体形成滤饼，经洗涤、粉碎干燥。干燥的工艺有很多，例如滚筒干燥、流化床干燥、粉碎干燥等。

[0022] 干燥脱水后的霉菌生物体，可以采用非极性溶剂进行浸提或压榨法，收获油脂。收获的油脂经进一步处理获得目标产品：花生四烯酸油脂。霉菌生物体经非极性溶剂浸提后剩余固体物质，即高山被孢霉菌粕。

[0023] 本发明涉及重复利用高山被孢霉菌粕生产花生四烯酸。所谓重复利用是指利用上述经非极性溶剂浸提后剩余的固体物质部分替代高山被孢霉培养基中的氮源。部分替代是指降低原培养基配方中的氮源使用量，添加高山被孢霉菌粕作为补充。高山被孢霉菌粕替代的比例可以为原氮源的10％～90％，优先采用的比例为30％～60％。

[0024] 用于替代氮源的高山被孢霉菌粕可以进行必要的处理，如进行膨化处理，然后再采用碾压、高速粉碎机粉碎、高压均质等方法，粉碎后的高山被孢霉菌粕进行筛分，可以选用过20～100目的筛分，优先选用60～80目的筛分用于培养基中，还可以通过复合酶法对粉碎后的高山被孢霉菌粕进行水解处理。

[0025] 本发明的高山被孢霉菌粕用于培养基代替部分常用氮源，其培养基的配制处理、灭菌、培养等方法是本领域熟练技术人员所熟知的，相关处理方法均可用于本发明。例如培养基灭菌时间可以采用121℃，保温30分钟。

[0026] 通过上述技术方案的实施可以达到以下效果：

[0027] 1、利用高山被孢霉发酵生产花生四烯酸过程中产生的废弃物得到循环利用，避免了环境污染物的排放；

[0028] 2、高山被孢霉菌粕通过膨化处理，使得高山被孢霉菌粕变得松散，易于粉碎，便于有效营养物质的释放从而得到应用；

[0029] 3、高山被孢霉菌粕通过复合酶处理，使得高山被孢霉菌粕中高分子物质(例如蛋白)得到降解，降解的小分子物质，能更有效地被高山被孢霉吸收利用；

[0030] 4、高山被孢霉菌粕通过一系列前处理用于花生四烯酸的发酵生产，可以显著提高花生四烯酸的产量；

[0031] 5、采用高山被孢霉菌粕循环利用于花生四烯酸的发酵生产，可以显著降低花生四烯酸的生产成本，提高生产效益。

具体实施方式

[0032] 下面结合实施例进一步介绍本发明，但是实施例不会构成对本发明技术方案的限制。

[0033] 实施例1高山被孢霉菌粕循环应用前处理：

[0034] 1.1、高山被孢霉菌粕复合酶工艺处理。高山被孢霉菌粕经粉碎，过60目筛，添加水配制成质量百分比浓度为20％的混浊液，pH保持自然，升温至50℃，添加占高山被孢霉菌粕质量百分比0.5～3％的中性蛋白酶，在50℃下保温，以每10分钟搅拌2分钟的方式间歇搅拌1～2小时。制备的高山被孢霉蛋白酶水解物，采用现有工艺将高山被孢霉蛋白酶水解物作为氮源添加在发酵培养基中，经与其它原料灭菌后用于高山被孢霉的发酵培养。

[0035] 1.2、高山被孢霉菌粕复合酶工艺处理。高山被孢霉菌粕经粉碎，过80目筛，添加水配制成质量百分比浓度为20％的混浊液，调节pH至8.0～9.0，升温至50℃～55℃，添加占高山被孢霉菌粕质量百分比0.5～3％的碱性蛋白酶，50℃保温，以每10分钟搅拌2分钟的方式间歇搅拌1～3小时。制备的高山被孢霉蛋白酶水解物，作为氮源添加在发酵培养基中，经与其它原料灭菌后用于高山被孢霉的发酵培养。

[0036] 1.3、高山被孢霉菌粕膨化工艺处理。高山被孢霉菌粕经膨化设备处理，膨化温度控制在90～100℃之间，然后粉碎，过70目筛，添加一定量的水配制成质量百分比浓度为20％的混浊液，pH保持自然，升温至50℃，添加占高山被孢霉菌粕质量百分比0.5～3％的中性蛋白酶，50℃保温，以每10分钟搅拌2分钟的方式间歇搅拌1～2小时。制备的高山被孢霉蛋白酶水解物，作为氮源添加在发酵培养基中，经与其它原料灭菌后用于高山被孢霉的发酵培养。

[0037] 实施例2

[0038] 高山被孢霉发酵配方工艺优化

[0039] 高山被孢霉菌粕经粉碎，过60目筛，添加一定量的水配制成质量百分比浓度为20％的混浊液，pH保持自然，升温至50℃，添加0.5～3％高山被孢霉菌粕质量百分比的中性蛋白酶，50℃保温，以每10分钟搅拌2分钟的方式间歇搅拌1～2小时。制备的高山被孢霉蛋白酶水解物，作为氮源添加在发酵培养基中，经与其它原料灭菌后用于高山被孢霉的发酵培养。按不同替换比例替换摇瓶培养基中的氮源。

[0040] 高山被孢霉种子摇瓶生长培养基采用原始生长培养基配方，配制后的生长培养基，121℃，保温30分钟。在洁净工作台接种高山被孢霉菌种孢子。种子摇瓶在恒温摇床培养48小时，培养温度为28℃，摇床转速220rpm。

[0041] 发酵摇瓶培养基按不同比例替换摇瓶培养基中的氮源，分别替换10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％。配制后的培养基121℃，保温30分钟。在洁净工作台接种前述培养好的霉菌种子，发酵摇瓶接种量为10％。发酵摇瓶在恒温摇床培养10天，培养温度为28℃，摇床转速180rpm。培养结束得到发酵醪液，进行相关检测。

[0042] 发酵醪液经过滤收集的霉菌生物体，经洗涤、干燥、粉碎，采用非极性溶剂丁烷或者己烷进行浸提，收获油脂，收获的油脂经碱炼、脱胶、脱色、脱溶、脱臭获得目标产品花生四烯酸油脂。霉菌生物体经非极性溶剂丁烷或者己烷浸提后剩余固体物质，即为可循环使用的高山被孢霉菌粕。

[0043]编号 替换比例 结果(AA(g/l))
1 0％ 5.52
2 10％ 5.51
3 20％ 5.57
4 30％ 5.65
5 40％ 5.83
6 50％ 5.86
7 60％ 5.54
8 70％ 5.43
9 80％ 5.37
10 90％ 5.22
11 100％ 4.98

[0044] 实施例3

[0045] 高山被孢霉发酵配方工艺优化

[0046] 高山被孢霉菌粕经粉碎，过80目筛，添加一定量的水配制成质量百分比浓度为20％的混浊液，调节pH至8.0～9.0，升温至50℃～55℃，添加高山被孢霉菌粕的质量百分比0.5～3％的中性蛋白酶，50℃保温，以每10分钟搅拌2分钟的方式间歇搅拌1～3小时。制备的高山被孢霉蛋白酶水解物，作为氮源添加在发酵培养基中，经与其它原料灭菌后用于高山被孢霉的发酵培养。按不同替换比例替换摇瓶培养基中的氮源。

[0047] 高山被孢霉种子摇瓶生长培养基采用氮源替换50％的配方，配制后的培养基，121℃，保温30分钟。在洁净工作台接种高山被孢霉菌种孢子。高山被孢霉种子摇瓶在恒温摇床培养48小时，培养温度为28℃，摇床转速220rpm。

[0048] 摇瓶发酵培养基按不同比例替换摇瓶培养基中的氮源，分别替换10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％。配制后的培养基121℃，保温30分钟。在洁净工作台接种高山被孢霉种子，发酵摇瓶接种量为10％。发酵摇瓶在恒温摇床培养10天，培养温度为28℃，摇床转速180rpm。培养结束的摇瓶菌丝体，进行相关检测。

[0049]编号 替换比例 结果(AA(g/l))
1 0％ 5.37
2 10％ 5.40
3 20％ 5.43
4 30％ 5.51
5 40％ 5.62
6 50％ 5.61
7 60％ 5.49
8 70％ 5.42
9 80％ 5.40
10 90％ 5.32
11 100％ 5.12

[0050] 实施例4

[0051] 高山被孢霉发酵配方工艺优化。

[0052] 高山被孢霉菌粕经膨化设备处理，然后粉碎，过70目筛，添加一定量的水配制成质量百分比浓度为20％的混浊液，pH保持自然，升温至50℃，添加高山被孢霉菌粕的质量百分比0.5～3％的中性蛋白酶，50℃保温，以每10分钟搅拌2分钟的方式间歇搅拌1～2小时。制备的高山被孢霉蛋白酶水解物，作为氮源添加在发酵培养基中，经与其它原料灭菌后用于高山被孢霉的发酵培养。按不同替换比例替换摇瓶培养基中的氮源。

[0053] 高山被孢霉种子摇瓶生长培养基采用氮源替换50％的配方，配制后的生长培养基，121℃，保温30分钟。在洁净工作台接种高山被孢霉菌种孢子。高山被孢霉种子摇瓶在恒温摇床培养48小时，培养温度为28℃，摇床转速220rpm。

[0054] 摇瓶发酵培养基按不同比例替换摇瓶培养基中的氮源，分别替换10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％。配制后的培养基121℃，保温30分钟。在洁净工作台接种高山被孢霉种子，发酵摇瓶接种量为10％。发酵摇瓶在恒温摇床培养10天，培养温度为28℃，摇床转速180rpm。培养结束的摇瓶菌丝体，进行相关检测。

[0055]编号 替换比例 结果(AA(g/l))
1 0％ 5.25
2 10％ 5.38
3 20％ 5.52
4 30％ 5.64
5 40％ 5.82
6 50％ 5.87
7 60％ 5.69
8 70％ 5.47
9 80％ 5.36
10 90％ 5.22
11 100％ 5.04

[0056] 实施例5

[0057] 高山被孢霉发酵中试工艺优化。

[0058] 中试70升发酵罐培养。高山被孢霉菌粕经后处理实施例1.1的处理后，按所需比例替换培养基中的氮源。

[0059] 高山被孢霉种子摇瓶生长培养基采用原始培养基配方，配制后的培养基，121℃，保温30分钟。在洁净工作台接种高山被孢霉菌种孢子。高山被孢霉种子摇瓶在恒温摇床培养48小时，培养温度为28℃，摇床转速220rpm。

[0060] 种子罐培养基采用原始培养基配方，配制后的培养基，116℃，保温30分钟。接入摇瓶高山被孢霉种子后通气培养48小时。

[0061] 发酵罐培养基(即发酵培养基)按一定比例替换培养基中的氮源，分别替换30％，40％，50％，60％，配制后的培养基116℃，保温30分钟。发酵罐接种量为20％。发酵罐接种后，通气量为1.2VVM培养温度为28℃，搅拌转速转速250rpm。培养过程进行检测，根据检测结果进行葡萄糖的流加，使培养基中葡萄糖浓度控制在一定浓度范围内，初始控制1.0％左右，逐步降低至0.1％以下，最终结果见下表：

[0062]编号 替换比例 结果(AA(g/l))
1 30％ 7.39
2 40％ 7.56
3 50％ 7.62
4 60％ 7.09

[0063] 实施例6

[0064] 高山被孢霉发酵中试工艺优化。

[0065] 中试70升发酵罐培养。高山被孢霉菌粕经后处理实施例1.2的处理后，按所需比例替换培养基中的氮源。

[0066] 高山被孢霉种子摇瓶生长培养基采用原始培养基配方，配制后的培养基，121℃，保温30分钟。在洁净工作台接种高山被孢霉菌种孢子。高山被孢霉种子摇瓶在恒温摇床培养48小时，培养温度为28℃，摇床转速220rpm。

[0067] 种子罐生长培养基采用50％氮源替代培养基配方，配制后的培养基，116℃，保温30分钟，接入摇瓶高山被孢霉种子后通气培养48小时。

[0068] 发酵罐培养基(即发酵培养基)按一定比例替换培养基中的氮源，分别替换30％，40％，50％，60％。配制后的培养基116℃，保温30分钟，发酵罐接种量为20％，发酵罐接种后，通气量为1.2VVM培养温度为28℃，搅拌转速转速250rpm。培养过程进行检测，根据检测结果进行葡萄糖的流加，使培养基中葡萄糖浓度控制在一定浓度范围内，初始控制1.0％左右，逐步降低至0.1％以下，最终结果见下表：

[0069]编号 替换比例 结果(AA(g/l))
1 30％ 7.35
2 40％ 7.68
3 50％ 7.66
4 60％ 7.29

[0070] 实施例7

[0071] 高山被孢霉发酵中试工艺优化。

[0072] 中试70升发酵罐培养。高山被孢霉菌粕经后处理方法1.3的处理后，按所需比例替换培养基中的氮源。

[0073] 高山被孢霉种子摇瓶生长培养基采用原始培养基配方，配制后的培养基，121℃，保温30分钟。在洁净工作台接种高山被孢霉菌种孢子。高山被孢霉种子摇瓶在恒温摇床培养48小时，培养温度为28℃，摇床转速220rpm。

[0074] 种子罐生长培养基采用50％氮源替代培养基配方，配制后的培养基，116℃，保温30分钟。接入摇瓶高山被孢霉种子后通气培养48小时。

[0075] 发酵罐培养基(即发酵培养基)按一定比例替换培养基中的氮源，分别替换10％，40％，60％，90％，。配制后的培养基116℃，保温30分钟。发酵罐接种量为20％。发酵罐接种后，通气量为1.2VVM培养温度为28℃，搅拌转速转速250rpm。培养过程进行检测，根据检测结果进行葡萄糖的流加，使培养基中葡萄糖浓度控制在一定浓度范围内，初始控制
1.0％左右，逐步降低至0.1％以下，最终结果见下表：

[0076]编号 替换比例 结果(AA(g/l))
1 10％ 7.45
2 40％ 7.78
3 60％ 7.64
4 90％ 5.96

[0077] 实施例8

[0078] 发酵生产大罐培养。高山被孢霉菌粕经后处理方法1.1的处理后，按所需比例替换培养基中的氮源。

[0079] 高山被孢霉种子摇瓶生长培养基采用原始培养基配方，配制后的培养基，121℃，保温30分钟。在洁净工作台接种高山被孢霉菌种孢子。高山被孢霉种子摇瓶在恒温摇床培养48小时，培养温度为28℃，摇床转速220rpm。

[0080] 一级种子罐生长培养基采用原始培养基配方，配制后的培养基，116℃，保温30分钟。接入摇瓶高山被孢霉种子后通气培养48小时。

[0081] 二级种子罐采用原始培养基配方，配制后的培养基，116℃，保温30分钟。接入摇瓶高山被孢霉种子后通气培养48小时。

[0082] 发酵罐培养基(即发酵培养基)按一定比例替换培养基中的氮源，替换30％，配制后的培养基通过连消塔，灭菌后管道输入已经空消灭菌的发酵大罐中。发酵罐接种量为20％。发酵罐接种后，通气量为0.7VVM培养温度为28℃。培养过程进行检测，根据检测结果进行葡萄糖的流加，使培养基中葡萄糖浓度控制在一定浓度范围内，初始控制1.0％左右，逐步降低至0.1％以下。在发酵大罐中培养7天，花生四烯酸的含量达到48.9％，每升发酵培养基中花生四烯酸的产量为7.86g。

[0083] 实施例9

[0084] 依照实例8方法，获得发酵所需要的高山被孢霉种子。

[0085] 发酵罐培养基(即发酵培养基)按一定比例替换培养基中的氮源，替换40％，配制后的培养基通过连消塔，灭菌后管道输入已经空消灭菌的发酵大罐中。发酵罐接种量为20％。发酵罐接种后，通气量为0.7VVM培养温度为28℃。培养过程进行检测，根据检测结果进行葡萄糖的流加，使培养基中葡萄糖浓度控制在一定浓度范围内，初始控制1.0％左右，逐步降低至0.1％以下。在发酵大罐中培养7天，花生四烯酸的含量达到49.6％，每升发酵