辅助鉴定大豆百粒重相关位点的一对专用引物及其方法转让专利
申请号 : CN200910090318.2
文献号 : CN101613753B
文献日 : 2012-06-06
发明人 : 朱保葛 , 田苗苗 , 任海红 , 陈修文 , 徐民新 , 张利明 , 周国安
申请人 : 中国科学院遗传与发育生物学研究所
摘要 :
本发明公开了辅助鉴定大豆百粒重的一对专用引物及其方法。本发明提供了辅助筛选具有高百粒重性状的大豆的方法，包括如下步骤：以待测大豆的基因组DNA为模板，用Satt126引物对进行PCR扩增，检测扩增产物，扩增产物中含有一个165-175bp之间的DNA片段的待测大豆为候选的具有高百粒重性状的大豆；所述Satt126引物对由序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸组成；所述高百粒重性状为籽粒百粒重≥25.0克的性状。本发明的方法克服了常规育种中因表型选择易受环境因素干扰而导致育种效率低等问题，可以利用Satt126标记的专用引物对大豆高百粒重相关位点进行早期世代选择鉴定而缩短育种周期，从而快速筛选出籽粒较大的高产大豆材料。本发明可应用于大豆高产育种，以提高育种效率和大豆产量水平。
权利要求 :
1.一种辅助筛选具有高百粒重性状的大豆的方法，包括如下步骤：
以待测大豆的基因组DNA为模板，用Satt126引物对进行PCR扩增，检测扩增产物，扩增产物中含有一个165-175bp之间的DNA片段的待测大豆为候选的具有高百粒重性状的大豆；所述Satt126引物对由序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸组成；所述高百粒重性状为籽粒百粒重≥25.0克的性状。
2.一种辅助鉴定大豆高百粒重性状的方法，包括如下步骤：
以待测大豆的基因组DNA为模板，用Satt126引物对进行PCR扩增，检测扩增产物，扩增产物中含有一个165-175bp之间的DNA片段的待测大豆具有高百粒重性状；所述Satt126引物对由序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸组成；所述高百粒重性状为籽粒百粒重≥25.0克的性状。
3.Satt126引物对在制备辅助鉴定大豆百粒重性状的试剂盒中的应用；所述Satt126引物对由序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸组成。
4.Satt126引物对在辅助筛选具有高百粒重性状的大豆中的应用；所述Satt126引物对由序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸组成；所述高百粒重性状为籽粒百粒重≥25.0克的性状。
5.权利要求1或2所述方法在具有高百粒重性状的大豆育种中的应用；所述高百粒重性状为籽粒百粒重≥25.0克的性状。
6.Satt126引物对在具有高百粒重性状的大豆育种中的应用；所述Satt126引物对由序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸组成。
说明书 :
辅助鉴定大豆百粒重相关位点的一对专用引物及其方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一对可以快速鉴定选择大豆百粒重相关位点的专用引物及其方法。
背景技术
[0002] 基于表型选择的常规育种方法存在选择效率低和育种周期长等缺点，迫切需要注入现代分子技术手段，辅之于高效率地基因型定向选择，才能快速高效地培育出优异大豆新品种。随着分子生物学和基因组学的迅速发展，分子标记技术的应用更加广泛。基于PCR的分子标记如微卫星或SSR(simple sequence repeat)等具有多态率高、相对稳定、检测方法简便快速及易于操作等特点而被广泛的应用。由于分子标记辅助选择不易受环境因素影响和性状显隐性干扰等，可以从分子水平定向选择目标性状基因(或称胶上选择)，同时还有可能打破不利基因之间的连锁而高效率地聚合多个优良基因于一体。通常所说的分子标记既包括目标基因的连锁标记也包括目标基因自身功能标记。分子标记辅助多基因聚合育种技术已经成为大豆等作物育种研究的一种发展趋势，运用该技术能否有效地将优质、多抗和高产等基因聚合到少数骨干品种中，关键在于能否获得足够多的与目标性状基因或主效QTL紧密连锁的实用分子标记。
[0003] 大豆籽粒产量＝单位面积株数×单株粒数×粒重。因此，荚粒数、粒大小(粒长、粒宽)、单株荚数/粒数及单株粒重等均与籽粒产量密切相关。大豆产量构成因素都是由许多微效基因或QTL控制的复杂数量性状，遗传力大都较低。但大豆百粒重(是指100粒大豆种子的重量，其数值的高低直接反映籽粒体积的大小)在产量构成因素中是一个确定的重要数量性状，品种之间差异明显，遗传力比较高(55％左右)，以加性遗传效应为主，在产量性状中其遗传规律相对简单，主要受少数主基因与若干微效基因共同控制。大粒是提高大豆产量的重要目标性状之一，但迄今很少发现该性状基因的分子标记和图谱定位的相关报道。
[0004] 吴晓雷等定位了与大豆产量相关的4个QTLs，分布于A1、C2和M等连锁群上，发现了6个与百粒重相关的QTLs分布于A2、C2、D1、D2a及G连锁群上，其中位于连锁群D2a上的QTL贡献率最高，可解释总变异的16％。Zhang等也定位了大豆产量相关的QTLs，集中分布于B1、C2和M连锁群上，而与百粒重相关的QTLs分布在A2、B1、D2连锁群上。Wang等报道了C2、E、K和M连锁群上与产量相关的QTLs。美国学者分别在10个群体中定位了53个大豆百粒重QTLs，涉及的连锁群包括A1、A2、C1、C2、D1a、E、F、G、J、K、L和M，贡献率在0.9-22％之间，而单株重量、单株粒重多集中分布于B1、C1、D1a、M等连锁群，荚粒重量在C1、D1a上也有分布。同时发现产量及其相关性状的QTL多集中于B1、C1、C2、D1a、H1、M等连锁群的特定区域。
[0005] 在大豆荚粒数性状方面，朱保葛等通过诱变方法筛选到个发生单位点突变的多粒荚(即4粒荚)突变系，使得复杂的数量遗传性状转变为简单的质量遗传性状，便于分子标记与定位分析，并利用所创造的近等基因系NIL(near isogenic line)材料研究表明，该位点能使大豆植株的4粒荚比率至少提高15％，并发现与突变位点相连锁的4个SSR标记(位于其两侧)，两侧标记Sat_107和Satt491(3.2cM和4.2cM)已经成功地用于高产材料的辅助选择。
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供用于辅助鉴定大豆百粒重相关位点的一对专用引物及其方法。
[0007] 本发明提供了一种辅助筛选具有高百粒重性状的大豆的方法，包括如下步骤：
[0008] 以待测大豆的基因组DNA为模板，用Satt126引物对进行PCR扩增，检测扩增产物，扩增产物中含有一个165-175bp之间的DNA片段的待测大豆为候选的具有高百粒重的性状的大豆；所述Satt126引物对由序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸组成；所述高百粒重性状为籽粒百粒重≥25.0克的性状。
[0009] 本发明还提供了一种辅助鉴定大豆高百粒重性状的方法，包括如下步骤：
[0010] 以待测大豆的基因组DNA为模板，用Satt126引物对进行PCR扩增，检测扩增产物，扩增产物中含有一个165-175bp之间的DNA片段的待测大豆具有高百粒重性状；所述Satt126引物对由序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸组成；所述高百粒重性状为籽粒百粒重≥25.0克的性状。
[0011] 本发明还保护一种辅助鉴定大豆百粒重性状的专用引物，是Satt126引物对；所述Satt126引物对由序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸组成。从实际应用角度出发，上述专用引物主要用于辅助鉴定大豆的高百粒重性状；所述高百粒重性状为籽粒百粒重≥25.0克的性状。
[0012] 所述专用引物在制备辅助鉴定大豆百粒重性状的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。从实际应用出发，上述专用引物主要用于制备辅助鉴定大豆高百粒重性状的试剂盒；所述高百粒重性状为籽粒百粒重≥25.0克的性状。
[0013] 本发明还保护一种辅助鉴定大豆百粒重性状的试剂盒，包括所述专用引物。从实际应用角度出发，上述试剂盒主要用于辅助鉴定大豆高百粒重性状；所述高百粒重性状为籽粒百粒重≥25.0克的性状。
[0014] 所述专用引物和所述试剂盒均可应用于筛选具有不同百粒重性状的大豆，特别是筛选具有高百粒重性状的大豆。
[0015] 由于大豆的百粒重性状与大豆产量密切相关，所述方法、所述专用引物和所述试剂盒均可应用于大豆育种，特别是培育高产大豆。
[0016] 本发明同时保护一个控制大豆百粒重性状的相关位点，定位于大豆分子遗传图谱的B2连锁群，与SSR标记Satt126之间的遗传距离为2.0cM。
[0017] 本发明发现，所述Satt126引物对可用于选择大豆的百粒重相关位点，并且得到了一个百粒重相关位点(高百粒重相关位点)，通过该位点可以辅助筛选大豆的百粒重性状(特别是高百粒重性状)和不同百粒重性状(特别是高百粒重性状)的大豆。从而，应用所述Satt126引物，可以辅助筛选大豆的百粒重性状(特别是高百粒重性状)和不同百粒重性状(特别是高百粒重性状)的大豆。因此，本发明的位点和引物对，可以应用于培育具有高产性状的大豆。
[0018] 本发明的方法克服了常规育种中因表型选择易受环境因素干扰而导致育种效率低等问题，可以利用Satt126标记的专用引物对大豆高百粒重相关位点进行早期世代选择而缩短育种周期，从而较快地筛选出籽粒较大的高产大豆材料。本发明可应用于大豆高产育种，以提高育种效率和大豆产量水平。
附图说明
[0019] 图1为大豆百粒重性状相关位点hsw3的定位情况
[0020] 图2为Satt126的专用引物对扩增大粒组和小粒组大豆材料基因组DNA的电泳分离结果；M：DNA分子量Marker(100bp DNA Ladder)。
具体实施方式
[0021] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0022] 实施例1、大豆百粒重相关位点(高百粒重相关位点)hsw3的获得
[0023] 一、引物合成
[0024] Satt126引 物对 序列 获 自SOYBASE数 据库；上 游 正向 引 物序 列 为：5’-GCTTGGTAGCTGTAGGAA-3’；下游反向引物序列为：5’-ATAAAACAAATTCG CTGATAT-3’，委托北京奥赛博生物公司合成。
[0025] 二、双亲基因组扩增检测
[0026] 用于创建大豆重组自交系(recombinant inbred line，RIL)群体的双亲分别是中黄4(国家大豆种质资源库)和中品661(国家大豆种质资源库)。中黄4为母本，其籽粒体积较大(22.0-26.5克/百粒)；中品661为父本，其籽粒体积较小(17.7-19.5克/百粒)。
[0027] 采用CTAB法提取双亲叶片的基因组DNA，以Satt 126引物对进行扩增实验。PCR2+
反应体系为：10×Buffer 2μl(含Mg )，dNTP 0.4μl(10mM)，上游正向引物和下游反向引物各2μl(5μM)，基因组DNA 1μl(40ng/μl)，Taq酶0.5μl(5U/μl)，反应体积为20μl，滴加一滴矿物油覆盖。PCR反应程序为：94℃5min；94℃60s、53.5℃60s、72℃60s，35个循环；72℃10min。
反应体系为：10×Buffer 2μl(含Mg )，dNTP 0.4μl(10mM)，上游正向引物和下游反向引物各2μl(5μM)，基因组DNA 1μl(40ng/μl)，Taq酶0.5μl(5U/μl)，反应体积为20μl，滴加一滴矿物油覆盖。PCR反应程序为：94℃5min；94℃60s、53.5℃60s、72℃60s，35个循环；72℃10min。
[0028] PCR扩增产物用9％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，快速银染法染色并在紫外灯下观察拍照。结果显示，Satt126引物对的扩增产物在双亲基因组之间呈现多态性。
[0029] 三、群体扩增检测及连锁分析定位
[0030] 用以上两个亲本进行杂交，得到杂种F1，通过“单粒传”法构建群体，获得475个F12代重组自交系。
[0031] “单粒传”法步骤如下：在父母本杂交当代从母本植株上收获的一粒种子种植后长成一个F1代单株，其自交(即自花授粉)结实收获1株F2代种子，后者种植长成一个包含分离性状的F2代株行，它的每一单株自交结实收获F3代种子，将分离的同类性状植株单收并脱粒装袋，每株种子次年单独种植一个F3株行，自交结实收获F4代种子，……，直至各家系内不同植株之间的性状完全稳定一致。像这样最初由单粒种子经过连续多代自交、分离、纯化、种植、选育及鉴定等程序，最终发展成一个由数百个甚至数千个重组自交系构成的大群体，即为“单粒传”法构建群体。其特征是各家系内不同植株之间的性状稳定一致，而家系间的性状差异较大。
[0032] 用Satt126引物对逐一扩增群体中所有株系的基因组DNA，结合计算机作图软件(MAPMAKER/EXP VER 3.0和WINQTLCART VERSION 2.5)分析，确定了一个百粒重性状相关位点，将其命名为hsw3。hsw3定位于大豆分子遗传图谱的B2连锁群，与其连锁标记Satt126间的遗传距离为2.0cM(见图1)。
[0033] 实施例2、Satt126引物对的扩增产物与粒重性状的相关性验证
[0034] 从我国不同大豆生态区征集到48份大豆资源材料(纯合品种或品系)。
[0035] 采用CTAB法分别提取每份大豆植株叶片的基因组DNA，以Satt126引物对进行2+
PCR扩增实验。PCR反应体系为：10×Buffer 2μl(含Mg )，dNTP 0.4μl(10mM)，上游正向引物和下游反向引物各2μl(5μM)，基因组DNA 1μl(40ng/μl)，Taq酶0.5μl(5U/μl)，反应体积为20μl，滴加一滴矿物油覆盖。PCR反应程序为：94℃5min；94℃60s、
53.5℃60s、72℃60s，35个循环；72℃10min。
PCR扩增实验。PCR反应体系为：10×Buffer 2μl(含Mg )，dNTP 0.4μl(10mM)，上游正向引物和下游反向引物各2μl(5μM)，基因组DNA 1μl(40ng/μl)，Taq酶0.5μl(5U/μl)，反应体积为20μl，滴加一滴矿物油覆盖。PCR反应程序为：94℃5min；94℃60s、
53.5℃60s、72℃60s，35个循环；72℃10min。
[0036] PCR扩增产物用9％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，快速银染法染色并在紫外灯下观察拍照。结果见图2。
[0037] 也可以采用琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物，观察相应的特异片段。
[0038] 对48份植株所结的籽实进行百粒重称量(设置三次重复试验，结果取平均值)，该48份大豆根据籽实的百粒重可以划分为两组：36份为大粒组(百粒重≥25.0克)，12份为小粒组(百粒重≤17.3克)，详见表1。
[0039] 表1大粒组与小粒组大豆材料的百粒重
[0040]
[0041]
[0042] *来自国家大豆种质资源库；a购自北京科遗农业科技有限公司。
[0043] 结合PCR扩增实验的结果(图2)和百粒重测量的结果(表1)，分析如下：供试大豆样本中大多数都存在一个165-175bp之间的DNA片段的等位变异，该DNA片段所代表的平均百粒重为27.8克(平均百粒重是将所有具有该片段的样本的百粒重取平均数得到的)；在全部36份大粒材料有29份能检测到该等位变异的特异带型(165-175bp之间的一个DNA片段)，符合率达到80.6％；而在12份小粒组材料中只有2份检测到该特异带型。因此，Satt126是与百粒重性状相关位点相连锁的SSR标记，可用于大豆分子辅助育种以提高产量水平。
[0044] 序列表
[0045] <110>中国科学院遗传与发育生物学研究所
[0046] <120>辅助鉴定大豆百粒重相关位点的一对专用引物及其方法
[0047] <130>CGGNARY92461
[0048] <160>2
[0049] <210>1
[0050] <211>18
[0051] <212>DNA
[0052] <213>人工序列
[0053] <220>
[0054] <223>
[0055] <400>1
[0056] gcttggtagc tgtaggaa 18[0057] <210>2
[0058] <211>21
[0059] <212>DNA
[0060] <213>人工序列
[0061] <220>
[0062] <223>
[0063] <400>2
[0064] ataaaacaaa ttcgctgata t 21