具有促进成纤维细胞生长因子受体3活性的多肽及其筛选方法和应用

摘要

本发明公开了一种具有促进成纤维细胞生长因子受体3即FGFR3活性的多肽及其筛选方法和应用，该多肽由Val-Ser-Pro-Pro-Leu-Thr-Leu-Gly-Gln-Leu-Leu-Ser所示的氨基酸序列组成；其筛选方法是将噬菌体12肽库与包被有FGFR3的酶标板共孵育，洗去非特异性结合的噬菌体，再洗脱特异性结合的噬菌体并扩增，作为下一轮淘选的投入噬菌体，重复上述步骤共进行三轮淘选，提取第三轮淘选出的噬菌体单克隆的DNA进行测序，推导出噬菌体上展示的外源多肽的氨基酸序列，合成多肽，检测其对FGFR3活性的促进作用，即得具有促进FGFR3活性的多肽；该多肽可用于制备抗FGFR3功能低下性疾病药物。

权利要求

1.具有促进成纤维细胞生长因子受体3活性的多肽，其特征在于：由Val-Ser-Pro-Pro-Leu-Thr-Leu-Gly-Gln-Leu-Leu-Ser所示的氨基酸序列组成。

说明书

具有促进成纤维细胞生长因子受体3活性的多肽及其筛选

方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种多肽，特别涉及一种具有促进成纤维细胞生长因子受体3活性的多肽，还涉及该多肽的筛选方法和应用。

背景技术

[0002] 成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth f actor receptors，FGFRs)是一类具有自身磷酸化活性的跨膜酪氨酸激酶受体，与其相应配体成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors，FGFs)结合，在组织器官发育及损伤修复过程中发挥重要作用。

[0003] 目前已发现4种FGFRs，即FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4。其中，FGFR3介导软骨内骨化的负性调节分子，在骨骼发育中具有重要作用。既往研究显示，FGFR3功能获得型基因突变导致骨骺生长板中软骨细胞的增殖和分化受到抑制，引起多种骨骼发育缺陷性遗传疾病，如软骨发育不全(ACH)、季肋发育不全(HCH)和致死性骨发育不全(TD)等；而FGFR3功能缺失型基因突变导致骨骺生长板闭合延迟、肥大软骨区增宽和长骨过度生长等。近年来研究发现，FGFR3在骨性关节炎、骨质疏松、骨折等骨骼疾病的发生、发展中也具有重要作用，促进FGFR3活性可以防治骨性关节炎、骨质疏松和骨折等骨骼疾病。

[0004] 目前虽已发现23种FGFs，但至今未见仅与FGFR3特异性结合的FGFs。因多肽具有分子量小、空间结构简单、免疫原性低等优点，故开发能与FGFR3特异性结合并促进其活性的多肽有着良好的应用前景，有望开发成为抗FGFR3功能低下性疾病的药物。

发明内容

[0005] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种具有促进FGFR3活性的多肽；目的之二在于提供所述具有促进FGFR3活性的多肽的筛选方法；目的之三在于提供所述具有促进FGFR3活性的多肽的应用。

[0006] 为达到上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种具有促进FGFR3活性的多肽，由Val-Ser-Pro-Pro-Leu-Thr-Leu-Gly-Gln-Leu-Leu-Ser所示的氨基酸序列组成。

[0007] 在本发明的第二方面，提供了所述具有促进FGFR3活性的多肽的筛选方法，包括以下步骤：

[0008] a、噬菌体12肽库的生物淘选

[0009] 将噬菌体12肽库与包被有FGFR3的酶标板共孵育，用TBST洗去非特异性结合的噬菌体，再用甘氨酸-盐酸缓冲液洗脱特异性结合的噬菌体，用Tris-HCl缓冲液中和洗脱液，得特异性结合的噬菌体，测定滴度；在宿主菌ER2738中扩增特异性结合的噬菌体，测定滴度，作为下一轮淘选的投入噬菌体；重复上述步骤共进行三轮淘选，富集能与FGFR3特异性结合的噬菌体；

[0010] b、噬菌体的DNA提取和测序

[0011] 从第三轮淘选出的噬菌体的滴度测定平板上随机挑取噬菌体单克隆，在宿主菌ER2738中扩增后，提取DNA进行测序，根据所测得的DNA序列推导出噬菌体上展示的外源多肽的氨基酸序列；

[0012] c、多肽的合成

[0013] 根据所得外源多肽的氨基酸序列，人工合成多肽；

[0014] d、多肽的促FGFR3活性检测

[0015] 检测多肽对FGFR3活性的促进作用，即得具有促进FGFR3活性的多肽。

[0016] 进一步，所述步骤a的具体方法为：用浓度为20μg/mL的FGFR3溶液包被酶标板，温度4℃包被过夜，弃去包被液，加入浓度为5mg/mL的BSA溶液，温度37℃封闭1小时，弃去封闭液，用TBST充分洗涤，加入噬菌体12肽库，室温下震荡孵育1小时，弃去非特异性结合的噬菌体，用TBST充分洗涤，加入浓度为0.2M、pH为2.2的甘氨酸-盐酸缓冲液，室温下震荡洗脱8分钟，吸取洗脱液，加入浓度为1M、pH为9.1的Tris-HCl缓冲液中和，得特异性结合的噬菌体，测定滴度；将ER2738菌接种至LB培养基中，温度37℃震荡培养至对数中期，加入特异性结合的噬菌体，温度37℃震荡培养，温度4℃离心，取上清液，再离心，取上清液，加入1/6体积的PEG/NaCl，温度4℃静置过夜沉淀噬菌体，温度4℃离心，弃去上清液，加入TBS重悬沉淀，再离心，取上清液，加入1/6体积的PEG/NaCl，冰浴沉淀90分钟，温度4℃离心，弃去上清液，加入含有浓度为0.2g/L的叠氮钠的TBS重悬沉淀，再离心，收集上清液，得扩增的特异性结合的噬菌体，测定滴度，作为下一轮淘选的投入噬菌体；重复上述步骤共进行三轮淘选，富集能与FGFR3特异性结合的噬菌体，其中，第一轮淘选时TBST中Tween-20的浓度为1mL/L，第二轮和第三轮淘选时TBST中Tween-20的浓度提高至5mL/L；

[0017] 进一步，所述步骤b的具体方法为：将ER2738菌接种至LB培养基中，温度37℃震荡培养至对数中期，加入从第三轮淘选出的噬菌体的滴度测定平板上随机挑取的噬菌体单克隆，温度37℃震荡培养，离心，取含噬菌体上清液，加入PEG/NaCl，室温放置，离心，弃上清液，沉淀重悬于碘化物缓冲液中，加入乙醇，室温孵育，离心，弃上清液，沉淀用浓度为700mL/L的乙醇洗涤，短暂真空干燥后重悬于TE中，取该溶液进行DNA序列测定，根据所测得的DNA序列推导出噬菌体上展示的外源多肽的氨基酸序列。

[0018] 在本发明的第三方面，提供了所述具有促进FGFR3活性的多肽在制备抗FGFR3功能低下性疾病的药物中的应用。

[0019] 本发明的有益效果在于：本发明多肽能与FGFR3特异性结合并促进其活性，且具有分子量小、制备简单、质量可控、免疫原性低等优点，可以用于制备抗FGFR3功能低下性疾病的药物，预防或治疗FGFR3功能低下性疾病如骨性关节炎、骨质疏松、骨折等，有着良好的潜在应用价值。

附图说明

[0020] 为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

[0021] 图1显示Western blot法检测多肽P1处理ATDC5细胞0.5、1.5、2.5小时后ERK磷酸化水平的变化；

[0022] 图2显示Western blot法检测多肽P2处理ATDC5细胞0.5、1.5、2.5小时后ERK磷酸化水平的变化；

[0023] 图3显示Western blot法检测多肽P1处理ATDC5细胞0.5、1.5、2.5小时后P38磷酸化水平的变化；

[0024] 图4显示Western blot法检测多肽P2处理ATDC5细胞0.5、1.5、2.5小时后P38磷酸化水平的变化；

[0025] 图5显示不同浓度的多肽P1处理ATDC5细胞24小时后的细胞增殖情况；

[0026] 图6显示不同浓度的多肽P1处理C3H10T1/2细胞24小时后的细胞增殖情况；

[0027] 图7显示多肽P1或P2持续处理ATDC5细胞后的细胞增殖情况。

具体实施方式

[0028] 本发明采用噬菌体展示技术筛选具有促进FGFR3活性的多肽。噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白或多肽随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。表达于噬菌体表面的外源蛋白或多肽能与靶分子特异性结合。将靶分子包被于固相载体后进行噬菌体展示肽库的筛选，就可将表达有相应外源蛋白或多肽的噬菌体从众多的噬菌体中分离纯化出来，而外源蛋白或多肽的氨基酸序列可以通过对噬菌体的DNA测序而获得。

[0029] 噬菌体展示肽库的筛选是一个亲和纯化的生物淘选(biopanning)过程。其具体过程是：将噬菌体肽库与靶分子相互作用一段时间后，洗涤除去非特异结合的噬菌体，再将特异性结合的噬菌体洗脱下来进行扩增，然后投入下一轮淘选，重复3～4轮淘选，即可获得与靶分子特异性结合的噬菌体。

[0030] 下面将参照附图，对优选实施例进行详细的描述。

[0031] 优选实施例中使用的FGFR3购自美国sigma公司，噬菌体12肽库筛选试剂盒(包括ER2738菌种)购自美国New England Lab公司。

[0032] 一、从噬菌体12肽库中筛选能与FGFR3特异性结合的多肽

[0033] 包括以下步骤：

[0034] a、噬菌体12肽库的生物淘选

[0035] 用浓度为20μg/mL的FGFR3溶液(浓度为0.1M、pH为8.6的碳酸氢钠为溶剂)150μL包被96孔灭菌聚苯乙烯酶标板，温度4℃包被过夜，弃去包被液，满孔加入浓度为5mg/mL的BSA溶液(浓度为0.1M、pH为8.6的碳酸氢钠为溶剂)，温度37℃封闭1小时，弃去封闭液，用TBST(即含有Tween-20的TBS，第一轮淘选时Tween-20的浓度为1mL/L，第11
二轮和第三轮淘选时Tween-20的浓度提高至5mL/L)洗涤6次，加入2×10 pfu的噬菌体(第一轮淘选时加入噬菌体12肽库原库10μL与TBST 1mL的混合液，第二轮和第三轮淘选时加入前一轮扩增的特异性结合的噬菌体)，室温下温和震荡孵育1小时，弃去非特异性结合的噬菌体，用TBST洗涤10次，加入浓度为0.2M、pH为2.2的甘氨酸-盐酸缓冲液200μL，室温下温和震荡洗脱8分钟，吸取洗脱液，加入浓度为1M、pH为9.1的Tris-HCl缓冲液
150μL中和，得特异性结合的噬菌体，测定滴度；将ER2738菌接种至LB培养基20mL中，温度37℃剧烈震荡培养至对数中期(OD600值约0.5)，加入特异性结合的噬菌体100μL，温度37℃剧烈震荡培养4.5小时，温度4℃、转速10,000rpm离心10分钟，取上清液，再离心
5分钟，取约80％的上层清液(下层含沉淀的清液弃去)，加入1/6体积的PEG/NaCl(由浓度为200g/L的PEG8000和浓度为2.5M的NaCl组成)，温度4℃静置过夜沉淀噬菌体，温度
4℃、转速10,000rpm离心15分钟，弃去上清液，加入TBS 1mL重悬沉淀，再离心5分钟，取上清液，加入1/6体积的PEG/NaCl，冰浴沉淀90分钟，温度4℃、转速10,000rpm离心10分钟，弃去上清液，加入含有浓度为0.2g/L的叠氮钠的TBS 200μL重悬沉淀，再离心1分钟，收集上清液，得扩增的特异性结合的噬菌体，测定滴度；

[0036] 重复上述步骤共进行三轮淘选，富集能与FGFR3特异性结合的噬菌体，第三轮淘选出的噬菌体不再扩增；各轮淘选的噬菌体回收率见表1，由表1可知，经过三轮生物淘选后，特异性结合的噬菌体的得率逐渐增大，表明所淘选的噬菌体得到了选择性的富集。

[0037] 表1、各轮淘选过程中噬菌体的回收率

[0038]

[0039] b、噬菌体的DNA提取和测序

[0040] 将ER2738菌接种至LB培养基中，温度37℃剧烈震荡培养至对数中期，分取1mL置培养管中，加入从第三轮淘选出的噬菌体的滴度测定平板上随机挑取的噬菌体单克隆，温度37℃剧烈震荡培养4.5小时，离心，取含噬菌体上清液500μL，加入PEG/NaCl 200μL，室温放置10分钟，离心10分钟，弃上清液，短暂离心，小心吸出残余上清液，沉淀重悬于碘化物缓冲液100μL中，加入乙醇250μL，室温孵育10分钟使单链噬菌体DNA沉淀而大多数噬菌体蛋白保留在溶液中，离心10分钟，弃上清液，沉淀用浓度为700mL/L的乙醇洗涤，短暂真空干燥后重悬于TE(由浓度为0.01M、pH值为8.0的Tris-HCl和浓度为1mM的EDTA组成)30μL中，取该溶液5μL，委托上海生工生物工程技术有限公司进行测序；

[0041] 本实施例随机挑取45个噬菌体单克隆进行DNA序列测定，根据所测得的DNA序列推导出噬菌体上展示的外源多肽的氨基酸序列；结果发现，23个噬菌体单克隆所展示的多肽具有同样的氨基酸序列P1：Val-Ser-Pro-Pro-Leu-Thr-Leu-Gly-Gln-Leu-Leu-Ser(SEQ ID No.1)；其余22个噬菌体单克隆所展示的多肽序列与P1之间也存在极高的同源性，其中包括P2：Val-Thr-Ser-Pro-Thr-Thr-Leu-Pro-Gln-Leu-Met-Ser(SEQ ID No.2)。

[0042] 二、人工合成多肽

[0043] 根据所得外源多肽的氨基酸序列，委托上海华大天源生物技术公司采用标准Fmoc方案固相合成多肽，所得多肽纯度均高于95％，置温度-70℃保存。

[0044] 三、ELISA法检测多肽与FGFR3的结合

[0045] 实验目的：验证筛选出的多肽与FGFR3之间的结合作用以及结合强度。

[0046] 实验方法：采用间接ELISA法，在96孔培养板中，每孔加入浓度为1mmol/μL的多肽P1或P2溶液20μL和包被液(取碳酸钠0.3g、碳酸氢钠0.58g和叠氮钠0.04g，加水溶解，调节pH至9.6，加水稀释至200mL，即得)80μL，温度4℃包被过夜，弃去包被液，满孔加入浓度为50g/L的小牛血清溶液(pH为7.4的PBS为溶剂)，温度37℃封闭40分钟，弃去封闭液，用PBST(含有浓度为0.5mL/L的吐温-20的PBS，pH为7.4)洗涤3次，加入浓度为100μg/mL的FGFR3溶液30μL和pH为7.4的PBS 70μL，温度37℃孵育1小时，用PBST洗涤3次，加入按1∶500稀释的鼠抗FGFR3抗体(美国Sigma公司，质量百分浓度为1％的BSA溶液为稀释溶剂)100μL，温度37℃孵育1小时，弃去一抗溶液，用PBST洗涤5次，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG(中杉金桥生物试剂公司)100μL，温度37℃孵育30分钟，弃去二抗溶液，用PBST洗涤5次，加入四甲基联苯二胺-过氧化氢尿素溶液100μL，温度37℃避光显色10分钟，加入浓度为2M的硫酸溶液终止反应，在波长450nm处测定OD450值，结果以3个复孔的均值表示；同时设置阴性对照组(加入多肽P1包被酶标板，但后续步骤中所有试剂均用pH为7.4的PBS代替)、P1空白对照组和P2空白对照组(不加入多肽P1或P2包被酶标板，其余操作不变)。

[0047] 实验结果：见表2，多肽P1和P2都与FGFR3有较高的结合率。

[0048] 表2、ELISA检测多肽与FGFR3的结合(X±SD)

[0049]

[0050] 四、Western blot法检测多肽对FGFR3主要下游信号通路MAPK的激活情况[0051] 目前研究已经明确，促分裂原活化蛋白激酶信号通路MAPK是FGFR3下游最主要的信号通路之一，MAPK的激活情况直接或间接影响细胞的增殖、分化、转化及凋亡等。在哺乳类细胞，目前已发现存在着下述三条并行的MAPK信号通路，分别为ERK信号通路、p38MAPK通路和JNK/SAPK通路。同一刺激因素可同时激活多条MAPK通路，如应激刺激可同时激活ERK、p38MAPK和JNK/SAPK三条通路，而EGF可同时激活ERK及JNK/SAPK二条通路。并行的MAPK通路之间通过复杂的机制既可相互区别、又能相互调节。

[0052] 实验目的：检测筛选出的多肽对FGFR3主要下游信号通路MAPK通路中信号分子的激活情况，以明确多肽调节细胞功能的机制。

[0053] 实验方法：在12孔培养板中，每孔接种1.2×105个前软骨细胞ATDC5，用含有浓度为50g/L的胎牛血清的DMEM/F12培养基在温度为37℃、CO2气体浓度为50mL/L的条件下培养24小时，待细胞贴壁后，吸除培养基，用无血清DMEM/F12培养基冲洗细胞2次，加入无血清DMEM/F12培养基1mL，培养24小时，吸除培养基，加入含有浓度为50g/L的胎牛血清的DMEM/F12培养基和浓度为10mM的多肽P1或P2溶液使多肽P1或P2的终浓度为2μM，同时设置空白对照组(不加入多肽P1或P2)，分别处理0.5、1.5、2.5小时，收集细胞，用细胞裂解液吹打裂解细胞，于冰上收集细胞匀浆液，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度；已测浓度的蛋白样品加入等体积2×上样缓冲液，煮沸5分钟，室温冷却后进行SDS-PAGE(采用浓度为50g/L的浓缩胶、浓度为90g/L的分离胶，电泳参数为80V 20分钟、120V 80分钟)，电泳结束后，将蛋白电转印(恒流300mA 60分钟)至聚偏二氟乙烯膜上，加入浓度为50g/L的脱脂奶粉溶液(TBST为溶剂)，室温封闭1小时，分别加入ERK、P-ERK(磷酸化ERK)、P38、P-P38(磷酸化P38)或β-actin的一抗，温度4℃孵育过夜，用TBST洗膜5次，加入辣根过氧化物酶标记二抗，温度37℃孵育1小时，用TBST洗膜5次，显色，曝光，定影，检测ERK或P38磷酸化水平的变化，并与总ERK或P38分子的量做对比，β-actin为内参照。

[0054] 实验结果：见图1～4，多肽P1对MAPK信号通路中ERK分子的磷酸化水平有促进作用，而对P38分子的磷酸化水平有抑制作用，多肽P2对ERK分子的磷酸化水平也有促进作用，提示多肽P1和P2有可能是通过调节ERK分子的活性来调节细胞的生理过程。

[0055] 五、MTT法检测不同浓度多肽对细胞增殖的影响情况

[0056] 实验目的：检测FGFR3表达细胞经不同浓度多肽作用后的细胞增殖情况。

[0057] 实验方法：在96孔培养板中，每孔接种8000个前软骨细胞ATDC5或间充质细胞C3H10T1/2，用含有浓度为50g/L的胎牛血清的DMEM/F12培养基在温度为37℃、CO2气体浓度为50mL/L的条件下培养24小时，待细胞贴壁后，吸除培养基，用无血清DMEM/F12培养基冲洗细胞2次，加入无血清DMEM/F12培养基1mL，培养24小时，吸除培养基，加入含有浓度为50g/L的胎牛血清的DMEM/F12培养基和浓度为10mM的多肽P1或P2溶液使多肽P1或P2的终浓度分别为1、5、10、50、100μM，同时设置空白对照组(不加入多肽P1或P2)，处理24小时，加入细胞增殖检测试剂20μL，在温度为37℃、CO2气体浓度为50mL/L的条件下避光孵育2～6小时，待孔中液体由紫色变为粉色，在570nm波长处测定OD570值，结果以3个复孔的均值表示。

[0058] 实验结果：见表3～4，多肽P1在较低浓度下对ATDC3和C3H10T1/2两种细胞的增殖均有促进作用，在较高浓度下无明显作用(见图5～6)；而多肽P2对两种细胞的增殖也有促进作用，但与多肽浓度无明显相关性。

[0059] 表3、MTT法检测多肽P1对细胞增殖的影响情况

[0060]

[0061] 表4、MTT法检测多肽P2对细胞增殖的影响情况

[0062]

[0063] 六、细胞计数法检测一定浓度多肽对细胞增殖的持续影响情况

[0064] 实验目的：检测FGFR3表达细胞经一定浓度多肽持续作用后的细胞增殖情况。

[0065] 实验方法：在96孔培养板中，每孔接种3000个前软骨细胞ATDC5，用含有浓度为50g/L的胎牛血清的DMEM/F12培养基在温度为37℃、CO2气体浓度为50mL/L的条件下培养24小时，待细胞贴壁后，吸除培养基，用无血清DMEM/F12培养基冲洗细胞2次，加入无血清DMEM/F12培养基1mL，培养24小时，吸除培养基，加入含有浓度为50g/L的胎牛血清的DMEM/F12培养基和浓度为10mM的多肽P1或P2溶液使多肽P1或P2的终浓度为2μM，同时设置空白对照组(不加入多肽P1或P2)，分别处理1、2、3、4、5天，吸除培养基，加入浓度为2.5g/L的胰酶100μL，消化5分钟，加入含有浓度为50g/L的胎牛血清的DMEM/F12培养基200μL终止消化，吹散细胞，取细胞悬液10μL进行细胞计数，结果以3个复孔的均值表示。

[0066] 实验结果：见表5和图7，多肽P1对前软骨细胞ATDC5有持续的促增殖作用。

[0067] 表5、细胞计数法检测多肽P1和P2对细胞增殖的持续影响情况

[0068]

[0069] 基于上述实验结果，可得出如下结论：本发明的多肽P1可以与FGFR3特异性结合，并对其活性有明显的促进作用，可以作为活性成分，单独使用或与其它具有药理活性的化合物和/或提取物组成复方使用，再与药学上可接受的载体按照药学领域的常规制剂方法制成各种剂型的抗FGFR3功能低下性疾病的药物，用于预防和治疗FGFR3功能低下性疾病如骨性关节炎、骨质疏松、骨折等。

[0070] 最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

[0071] 序列表

[0072] <110>中国人民解放军第三军医大学野战外科研究所

[0073] <120>具有促进成纤维细胞生长因子受体3活性的多肽及其筛选方法和应用[0074] <160>2

[0075] <210>1

[0076] <211>12

[0077] <212>PRT

[0078] <213>人工序列

[0079] <220>

[0080] <223>多肽P1

[0081] <400>1

[0082] Val Ser Pro Pro Leu Thr Leu Gly Gln Leu Leu Ser

[0083] 1 5 10

[0084] <210>2

[0085] <211>12

[0086] <212>PRT

[0087] <213>人工序列

[0088] <220>

[0089] <223>多肽P2

[0090] <400>2

[0091] Val Thr Ser Pro Thr Thr Leu Pro Gln Leu Met Ser

[0092] 1 5 10