用阳离子表面活性剂纯化蛋白质的方法

摘要

本发明提供从包含靶蛋白和污染蛋白的混合物中纯化靶蛋白的方法，该方法包括将混合物暴露在有效量的阳离子表面活性剂中，使污染蛋白优先沉淀出来并回收靶蛋白。本发明还提供根据本发明方法纯化的蛋白质。

权利要求

1.一种用于纯化靶蛋白的方法，该方法包括以下步骤：a.获得包含增溶靶蛋白、一种或多种增溶污染蛋白和碱性缓冲液的混合物的溶液，其中所述靶蛋白在碱性pH下带正电荷且等电点大于7，所述一种或多种污染蛋白具有聚阴离子电荷；

b.使所述包含增溶靶蛋白、一种或多种增溶污染蛋白和碱性缓冲液的混合物的溶液与一种或多种阳离子表面活性剂接触，所述阳离子表面活性剂的量有效地使一种或多种污染+蛋白优先沉淀出来，其中所述一种或多种阳离子表面活性剂是选自通式QN 的季铵化合物、+通式RNH3 的烷烃链伯铵化合物及其盐的两亲性铵化合物，因此，保留在溶液中由靶蛋白所代表的蛋白质的比例增大；和c.回收增溶靶蛋白。

2.权利要求1的方法，其中所述两亲性铵化合物选自十六烷基吡啶 盐、硬脂酰胺-甲基吡啶 盐、月桂基吡啶 盐、十六烷基喹啉 盐、月桂基氨基丙酸甲酯盐、月桂基氨基丙酸金属盐、月桂基二甲基甜菜碱、硬脂基二甲基甜菜碱、月桂基二羟乙基甜菜碱和苄索铵盐。

3.权利要求2的方法，其中所述两亲性铵化合物选自氯化十六烷基吡啶 、醋酸地喹铵、氯化十六烷基三甲基铵、混合氯化正烷基二甲基苄基铵、氯化N,N-二甲基-N-[2-[2-[4-(1,1,3,3,-四甲基丁基)-苯氧基]乙氧基]乙基]苯甲铵、氯化烷基-二甲基苄基-铵和氯化二氯-苄基二甲基-烷基铵、溴化十四烷基三甲基铵、溴化十二烷基三甲基铵、溴化十六烷基三甲基铵、月桂基二甲基甜菜碱、硬脂基二甲基甜菜碱和月桂基二羟乙基甜菜碱。

4.权利要求2的方法，其中所述两亲性铵化合物是十六烷基吡啶 盐。

5.权利要求4的方法，其中所述十六烷基吡啶 盐是卤化盐。

6.权利要求5的方法，其中所述十六烷基吡啶 卤化盐是氯化十六烷基吡啶 。

7.权利要求6的方法，其中所述两亲性铵化合物具有至少1条含6-20个碳原子的脂族链。

8.权利要求7的方法，其中所述脂族链具有8-18个碳原子。

9.权利要求1的方法，其中所述溶液还包含一种或多种细胞组分。

10.权利要求9的方法，其中所述一种或多种细胞组分来源于微生物。

11.权利要求10的方法，其中所述微生物是细菌。

12.权利要求11的方法，其中所述细菌是大肠杆菌。

13.权利要求9的方法，其中所述一种或多种细胞组分是一种或多种蛋白质。

14.权利要求1的方法，其中所述靶蛋白是重组蛋白。

15.权利要求14的方法，其中所述重组蛋白是酶。

16.权利要求14的方法，其中所述靶蛋白选自抗体、尿酸氧化酶、因子X抑制剂、酸性脱氧核糖核酸酶II、弹性蛋白酶、溶菌酶、木瓜蛋白酶、过氧化物酶、胰核糖核酸酶、胰蛋白酶原、胰蛋白酶、细胞色素c、半环扁尾蛇毒素、金黄色葡萄球菌肠毒素C1、干扰素和单胺氧化酶A。

17.权利要求16的方法，其中所述靶蛋白是尿酸氧化酶。

18.权利要求17的方法，其中所述尿酸氧化酶是哺乳动物尿酸氧化酶。

19.权利要求18的方法，其中所述哺乳动物尿酸氧化酶是猪尿酸氧化酶。

20.权利要求14的方法，其中所述靶蛋白是抗体。

21.权利要求20的方法，其中所述抗体是单链抗体。

22.权利要求14的方法，其中所述靶蛋白是干扰素。

23.权利要求22的方法，其中所述干扰素是干扰素β。

24.权利要求1的方法，其中加入所述一种或多种阳离子表面活性剂至浓度为

0.001%-5.0%。

25.权利要求24的方法，其中加入所述一种或多种阳离子表面活性剂至浓度为

0.01%-0.5%。

26.权利要求24的方法，其中加入所述一种或多种阳离子表面活性剂至浓度为

0.03%-0.2%。

27.权利要求1的方法，其中所述接触进行5分钟至48小时。

28.权利要求27的方法，其中所述接触进行10分钟至24小时。

29.权利要求1的方法，其中所述接触在4℃-36℃的温度下进行。

30.权利要求29的方法，其中所述接触在4℃-26℃的温度下进行。

31.权利要求1的方法，其中所述溶液不含聚阴离子。

32.权利要求1的方法，其中所述溶液不含固相支持体。

33.权利要求1的方法，其中所述溶液不含污染蛋白与其它分子的聚集体。

34.权利要求1的方法，其中所述溶液不含聚阴离子、固相支持体和污染蛋白与其它分子的聚集体。

35.权利要求32、33或34中的方法，其中所述阳离子表面活性剂是十六烷基吡啶盐。

36.权利要求35的方法，其中所述十六烷基吡啶 盐是氯化十六烷基吡啶 。

37.权利要求17的方法，其中所述尿酸氧化酶得自细菌细胞，其中所述细菌细胞包含编码尿酸氧化酶的DNA，所述DNA通过表达产生尿酸氧化酶。

38.权利要求37的方法，其中所述尿酸氧化酶从由细菌细胞所产生的包含体中回收。

39.一种纯化增溶靶蛋白的方法，该方法包括以下步骤：a.获得包含增溶靶蛋白、一种或多种增溶污染蛋白和碱性缓冲液的溶液，其中所述靶蛋白在碱性pH下带正电荷且等电点大于7，所述一种或多种污染蛋白具有聚阴离子电荷；

b.使所述包含增溶靶蛋白、一种或多种增溶污染蛋白和碱性缓冲液的溶液与一种或多种阳离子表面活性剂接触，其中所述一种或多种阳离子表面活性剂是选自通式QN+的季铵化合物、通式RNH3+的烷烃链伯铵化合物及其盐的两亲性铵化合物，其量有效地使一种或多种污染蛋白优先沉淀出来；

c.回收增溶靶蛋白。

40.一种提高蛋白质溶液中靶蛋白百分比的方法，该方法包括以下步骤：a.获得大量蛋白质的溶液，其中所述溶液中的蛋白质包含靶蛋白、一种或多种污染蛋白和碱性缓冲液，所述靶蛋白占溶液中总蛋白的重量百分比为第一百分比，其中所述靶蛋白在碱性pH下带正电荷且等电点大于7，所述一种或多种污染蛋白具有聚阴离子电荷；

b.使溶液与一种或多种阳离子表面活性剂接触，所述表面活性剂的量有效地使污染蛋+白优先沉淀出来，其中所述一种或多种阳离子表面活性剂是选自通式QN 的季铵化合物、通+式RNH3 的烷烃链伯铵化合物及其盐的两亲性铵化合物；

其中步骤b溶液中的靶蛋白占总蛋白的重量百分比为第二百分比，所述第二百分比大于所述第一百分比。

说明书

用阳离子表面活性剂纯化蛋白质的方法

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2005年4月11日申请的美国临时申请顺序号60/670,520的优先权，该临时申请的公开内容通过引用结合到本文中。发明领域

[0003] 本申请涉及使用表面活性剂进行蛋白质纯化的领域。

[0004] 发明背景

[0005] 生物大分子、尤其是蛋白质的生产，通常包括基于物理性质和物理化学性质来提高纯度的步骤。在这些工艺步骤中所遇到的困难包括但不限于能够使可溶性和不溶性分子分离的决定性条件、在处理步骤后所需分子的回收率相对较低、工艺过程中生物活性丧失以及蛋白质对工艺步骤条件(例如pH)较敏感。

[0006] 表面活性剂一直用于生物大分子的处理。阳离子表面活性剂是公认的一类表面+活性剂，它包括两亲性铵化合物。两亲性铵化合物包括通式为QN 的季铵化合物和通式为+
RNH3 的烷烃链伯铵化合物。这两种类型的两亲性铵化合物包括优选具有至少6个碳原子的长脂族链的长链铵表面活性剂(Scott(1960)Methods Biochem.Anal.8：145-197，该文献的内容通过引用全部结合到本文中)。已知长链季铵表面活性剂与生物大分子发生相互作用。长链季铵化合物在氮上具有至少1个取代基，取代基由6-20个碳原子的直链烷基链组成。这类化合物最著名的代表为烷基二甲基苄基铵盐(苯扎铵盐，benzalkonium salt)(氯化烷基二甲基苄基铵(苯扎氯铵)和溴化烷基二甲基苄基铵(苯扎溴铵))、氯化十六烷基吡啶 醋酸地喹铵(hexadecylpyridinium chloride dequalinium acetate)、溴化十六烷基二甲基铵(CTAB)、氯化十六烷基吡啶 (CPCl)和氯化异辛基苯氧基乙氧基乙基苄基二甲基铵(苄索氯铵，benzethonium chloride)。季铵表面活性剂包括盐，例如十六烷基吡比啶 盐(例如氯化十六烷基吡啶 (CPC))、硬脂酰胺-甲基吡啶 盐、月桂基吡啶盐、十六烷基喹啉 盐、月桂基氨基丙酸甲酯盐、月桂基氨基丙酸金属盐、月桂基二甲基甜菜碱硬脂基二甲基甜菜碱、月桂基二羟乙基甜菜碱和苄索铵盐(benzethonium salt)。烷基吡啶 盐包括硬脂基-三甲基铵盐、氯化烷基-二甲基苄基-铵和氯化二氯-苄基二甲基-烷基铵。

[0007] 阳离子表面活性剂用于生物大分子纯化的已知用途包括1)聚集体(包括蛋白质聚集体)的增溶；2)结合色谱柱的生物大分子的洗脱；和3)聚阴离子的沉淀，聚阴离子例如透明质酸(HA)、核酸和肝素(以及与聚阴离子共沉淀的分子)。

[0008] 阳离子表面活性剂一直用于使蛋白质聚集体增溶。Otta和Bertini证实，可以用季铵表面活性剂Hyamine 2389使啮齿动物肝过氧化物酶体的活性尿酸氧化酶增溶(Otta和Bertini(1975)ActaPhysiol.Latinoam.25：451-457，该文献的内容通过引用全部结合到本文中)。曾经发现铵表面活性剂浓度的增加会导致尿酸氧化酶(基于酶活性)和总蛋白的溶解都增加，相对于蛋白质总量，尿酸氧化酶蛋白的相对含量却没有增加。换句话说，用阳离子表面活性剂进行增溶时，尿酸氧化酶蛋白相对于总的蛋白质没有选择性增溶，尿酸氧化酶蛋白不占总蛋白质的较高百分比。因此，在这个方法中，作为季铵表面活性剂增溶的结果，相对于蛋白质总量，尿酸氧化酶的纯度并没有明显提高。

[0009] 在另一项研究中，Truscoe研究了一组阳离子去污剂、阴离子去污剂和中性去污剂对牛肾粉尿酸氧化酶的提取功效，发现随着浓度增加，中性去污剂和阴离子去污剂可提高可溶性尿酸氧化酶活性，阳离子去污剂(例如季铵盐)则降低总酶活性(Truscoe(1967)Enzymologia 33：119-32，该文献的内容通过引用全部结合到本文中)。作者得出的结论是阳离子去污剂不能用于纯化牛肾尿酸氧化酶。

[0010] 美国专利第4,797,474号、美国专利第4,992,531号、美国专利第4,966,963号和美国专利第5,008,377号介绍了用阳离子表面活性剂使以下成分增溶：重组蛋白、猪生长激素、甲硫氨酰-猪生长激素、传染性法氏囊病病毒蛋白(infectious bursal disease virusprotein)、得自大肠杆菌(E.coli)包含体或细胞的B-半乳糖苷酶融合蛋白(每个文献的内容都通过引用全部结合到本文中)。在碱性条件下，使用季铵化合物实现增溶，季铵化合物包括氯化十六烷基三甲基铵、混合氯化正烷基二甲基苄基铵、CPC、氯化N，N-二甲基-N-[2-[2-[4-(1，1，3，3，-四甲基丁基)-苯氧基]乙氧基]乙基]苯甲铵、溴化十四烷基三甲基铵、溴化十二烷基三甲基铵、溴化十六烷基三甲基铵。这些出版物中提到，在各种增溶方法后，将溶液离心，每种情况下都几乎未观察到沉淀。这一观察结果提示，大部分蛋白质或所有蛋白质不是根据靶蛋白增溶的选择性而增溶。回收蛋白的纯度未予以说明。美国专利第5,929,231号介绍了氯化十六烷基吡啶 (CPC)使含淀粉颗粒和聚集体崩解(该文献的内容通过引用全部结合到本文中)。因此，现有技术涉及阳离子表面活性剂在颗粒生物大分子的常规、非特异性增溶中的应用。现有技术的这些方法没有公开用阳离子表面活性剂增加所需靶蛋白相对于总蛋白的纯度。

[0011] 阳离子表面活性剂还用于洗脱阳离子交换树脂或含铝辅料所吸附的生物大分子 (Antonopoulos 等 (1961)Biochim.Biophys.Acta54：213-226；Embery(1976)J.Biol.Buccale 4：229-236和Rinella等(1998)J.Colloid Interface Sci.197：48-56，这些文献的内容都通过引用全部结合到本文中)。美国专利第4,169,764号介绍了用多种阳离子表面活性剂溶液洗脱羧甲基纤维素柱中的尿激酶(该文献的内容通过引用全部结合到本文中)。作者表明可优先使用四取代铵盐，其中1个烷基为最多20个碳原子的高级烷基，其它的为最多6个碳原子的低级烷基。使用这些阳离子表面活性剂能够使生物大分子从它们所附着的固体基质上脱离。

[0012] 反过来说，含阳离子表面活性剂的滤膜(例如由尼龙制成的滤膜)的浸渗作用，能够使多糖或核酸固定化(Maccari和Volpi(2002)Electrophoresis 23：3270-3277；Benitz等(1990)美国专利第4,945,086号；Macfarlane(1991)美国专利第5,010,183号，每个文献的内容都通过引用全部结合到本文中)。这种现象显然是由能够使聚阴离子沉淀的阳离子表面活性剂-聚阴离子的相互作用所致。

[0013] 已经十分清楚，两亲性铵化合物，包括通式QN+的季铵化合物和通式RNH3+的烷烃链伯铵化合物，可以在规定条件下使聚阴离子沉淀(有关综述见Scott(1955)Biochim.Biophys.Acta 18：428-429；Scott(1960)Methods Biochem.Anal.8：145-197；Laurent 等(1960)Biochim.Biophys.Acta 42：476-485；Scott(1961)Biochem.J.81：418-424；Pearce和 Mathieson(1967)Can.J.Biochemistry 45：1565-1576；Lee(1973)Fukushima J.Med.Sci.19：33-39；Balazs，(1979)美国专利第4,141,973号；Takemoto等(1982)美国专利第4,312,979号；Rosenberg(1981)美国专利第4,301,153号；Takemoto等(1984)美国专利第
4,425,431号；d′Hinterland等(1984)美国专利第4,460,575号；Kozma等(2000)Mol.Cell.Biochem.203：103-112，每个文献的内容都通过引用全部结合到本文中)。这种沉淀作用取决于具有高聚阴离子电荷密度和高分子量的各种沉淀物质(Saito(1955)Kolloid-Z
143：66，该文献的内容通过引用全部结合到本文中)。盐的存在可能干扰或逆转阳离子表面活性剂诱导的聚阴离子沉淀。

[0014] 此外，碱性pH条件下，聚阴离子可以从含有蛋白质污染物的溶液中有差异地沉淀出来。在这种情况下，与聚阴离子没有化学结合的蛋白质将保留在溶液中，而聚阴离子和其它与聚阴离子结合的分子将沉淀出来。例如，聚阴离子例如多糖和核酸的沉淀伴有与聚阴离子相互作用的分子(例如蛋白聚糖和蛋白质)的共沉淀(Blumberg和Ogston(1958)Biochem.J.68：183-188；Matsumura 等 (1963)Biochim.Biophys.Acta 69：574-576；Serafini-Fracassini 等 (1967)Biochem.J.105：569-575；Smith 等 (1984)J.Biol.Chem.259：11046-11051；Fuks和Vlodavsky(1994)美国专利第5,362,641号；Hascall和 Heinegard(1974)J.Biol.Chem.249：4232-4241、4242-4249 和 4250-4256；Heinegard和Hascall(1974)Arch.Biochem.Biophys.165：427-441；Moreno等(1988)美国专利第
4,753,796号；Lee等(1992)J.Cell Biol.116：545-557；Varelas等(1995)Arch.Biochem.Biophys.321：21-30，每个文献的内容都通过引用全部结合到本文中)。

[0015] 蛋白质的等电点(或pI)是蛋白质正电荷和负电荷数目相同时的pH。在溶液pH值接近(特别是小于)蛋白质等电点的条件下，蛋白质可与强酸性聚阴离子(例如肝素)形成稳定的盐。在促进这些聚阴离子沉淀的条件下，与聚阴离子络合的蛋白质也沉淀出来(LB Jaques(1943)Biochem.J.37：189-195；As Jones(1953)Biochim.Biophys.Acta10：607-612；JE Scott(1955)Chem and Ind 168-169；美国专利号第3,931,399号(Bohn等
1976)和美国专利号第4,297,344号(Schwinn等1981)，每个文献的内容通过引用全部结合到本文中)。

[0016] 美国专利第4,421,650号、美国专利第5,633,227号和Smith等介绍了用阳离子表面活性剂和硫酸铵(能够使聚阴离子-阳离子表面活性剂复合物离解)相继处理，随后用疏水作用色谱法分离，使聚阴离子纯化(Smith等(1984)J.Biol.Chem.259：11046-11051，每个文献的内容通过引用全部结合到本文中)。欧洲专利公布号EP055188介绍了能够从脂多糖分离RTX毒素的阳离子表面活性剂(该文献的内容通过引用全部结合到本文中)。然而，通过内毒素活性分析定量测定的脂多糖含量无质量平衡。已经证实，内毒素活性被阳离子化合物极强的相互作用中和(Cooper JF(1990)J Parenter Sci Technol
44：13-5，该文献的内容通过引用全部结合到本文中)。因此，EP055188中，用含量增加的阳离子表面活性剂处理后，沉淀物中缺乏内毒素活性，可能是由于表面活性剂-脂多糖复合物的形成使活性中和所致。

[0017] 上述方法需要中间聚阴离子、固相支持体或聚集体，该聚集体包含对阳离子表面活性剂有选择性溶解度的蛋白质，使得可以使用阳离子表面活性剂来纯化可溶性蛋白。因此，现有技术没有提供通过使蛋白质与用量足以有效优先沉淀靶蛋白以外的蛋白质(即污染蛋白)的阳离子表面活性剂接触，以纯化靶蛋白的方法，尤其是这种接触是不存在中间聚阴离子、固相支持体或蛋白质聚集体时进行的。本领域技术人员常常遇到可溶性蛋白混合物，并且没有简单有效的方法使所需蛋白质纯化的情况。本文所公开的蛋白质纯化的新方法，能够通过使用阳离子表面活性剂优先沉淀靶蛋白以外的蛋白质，有效地纯化靶蛋白。优选污染蛋白的这种沉淀是直接的，不依赖于聚阴离子、固相支持体或包含污染蛋白和其它分子的聚集体的存在。

[0018] 发明概述

[0019] 本发明提供从包含靶蛋白和污染蛋白的混合物中纯化靶蛋白的方法，该方法包括将混合物暴露在有效量的阳离子表面活性剂中，使得污染蛋白优先沉淀出来并回收靶蛋白的步骤。

[0020] 附图简述

[0021] 图1表示CPC浓度对尿酸氧化酶活性和纯度的影响。

[0022] 规定的CPC处理和离心分离后，测定哺乳动物尿酸氧化酶(得自溶解的大肠杆菌包含体)的蛋白质浓度(A)和酶活性(B)。以这些数值之比(活性/蛋白质浓度)计算出各个分离物的比活(C)。

[0023] 图2表示从包含体制备的粗制哺乳动物尿酸氧化酶，用0.075％CPC处理后的尺寸排阻HPLC色谱分析。

[0024] 尺寸排阻HPLC图A.无CPC处理时增溶的大肠杆菌包含体，图B.CPC(0.075％)沉淀过滤后，对上清液进行分析。每个峰面积和占总面积的百分比概括于紧接的下表中。

[0025] 图3表示经CPC处理的尿酸氧化酶的SDS-PAGE(15％凝胶)分析。

[0026] 按实施例1所述方法制备含尿酸氧化酶样品。不同工艺步骤得到的样品等分如下：第1泳道-溶解的IB；第2泳道-CPC处理后的上清液；第3泳道-CPC处理后的沉淀。

[0027] 图4表示用0.02％CPC处理后，粗制scFv抗体的尺寸排阻HPLC分析。

[0028] 尺寸排阻HPLC图A.参比标准BTG-271 scFv抗体，图B.增溶的包含体，图C.重折叠及CPC(0.02％)沉淀过滤后对上清液进行分析。每个峰面积和占总面积的百分比概括于紧接的下表中。

[0029] 图5表示经CPC处理的scFv抗体的SDS-PAGE(15％凝胶)分析。

[0030] 以下顺序表示得自不同工艺步骤和标准的含scFv抗体的样品：第1泳道-分子量标准品；第2泳道-溶解的IB；第3泳道-重折叠蛋白质；第4泳道-CPC沉淀；第5泳道-CPC处理后的上清液。

[0031] 图6表示CPC处理前后干扰素β的HPLC凝胶过滤色谱。

[0032] A.CPC处理前

[0033] B.CPC处理后。

[0034] 将200μl 0.1mg/ml干扰素β溶液加到柱中。

[0035] 发明详述

[0036] 蛋白质是两性电解质，具有正电荷和负电荷。溶液pH和与蛋白质相互作用的带电荷分子对该蛋白质的净电荷产生影响。当蛋白质的净电荷为中性(等电点)时，蛋白质之间可发生强相互作用。当溶液pH小于蛋白质等电点时，蛋白质带净正电荷，而且包括其它蛋白质在内的阳离子分子间可存在静电排斥。

[0037] 本发明的目的是提供从包含靶蛋白和污染蛋白的混合物的溶液中纯化出增溶的靶蛋白的方法，该方法包括使增溶的混合物与有效量的阳离子表面活性剂接触并回收靶蛋白。阳离子表面活性剂是带正电荷的表面活性分子。一般而言，这些化合物还具有至少1个非极性脂族基。优选靶蛋白的等电点＞7。在一个具体的实施方案中，溶液pH与靶蛋白等电点大致相同。在一个优选的实施方案中，溶液pH＜靶蛋白等电点。在一个具体的实施方案中，当溶液pH＞靶蛋白等电点时，溶液pH在靶蛋白等电点的1-2个pH单位范围内。在一个具体的实施方案中，当溶液pH＞靶蛋白等电点时，溶液pH在靶蛋白等电点的1个pH单位范围内。

[0038] 在一个具体的实施方案中，一种或多种污染蛋白优先沉淀出来，因此，保留在溶液中由靶蛋白所代表的蛋白质的比例增大。例如，从靶蛋白和污染蛋白的溶液开始，其中靶蛋白占溶液总蛋白的20％，可以采用所提供的方法纯化靶蛋白，得到的溶液中，靶蛋白占保留在溶液中总蛋白的30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上。

[0039] 本文所用术语“优先沉淀”是指一种蛋白质或一组蛋白质沉淀的程度大于另一种蛋白质或另一组蛋白质。例如，就靶蛋白和污染蛋白的混合物而论，当20％以上的污染蛋白沉淀，而小于20％的靶蛋白沉淀时，污染蛋白相对于靶蛋白优先沉淀。优选高百分比的污染蛋白沉淀，而低百分比的靶蛋白沉淀。在优选的实施方案中，30％以上的污染蛋白沉淀，而小于30％的靶蛋白沉淀；40％以上的污染蛋白沉淀，而小于40％的靶蛋白沉淀；50％以上的污染蛋白沉淀，而小于50％的靶蛋白沉淀；60％以上的污染蛋白沉淀，而小于60％的靶蛋白沉淀；70％以上的污染蛋白沉淀，而小于70％的靶蛋白沉淀；80％以上的污染蛋白沉淀，而小于80％的靶蛋白沉淀；90％以上的污染蛋白沉淀，而小于90％的靶蛋白沉淀；95％以上的污染蛋白沉淀，而小于95％的靶蛋白沉淀。优选小百分比的靶蛋白沉淀。例如小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％或小于1％的靶蛋白沉淀。

[0040] 在一个具体的实施方案中，在实施本发明的纯化方法之前，溶液中蛋白质的总量(靶蛋白加上污染蛋白)为0.1-10mg/ml。在具体的实施方案中，在实施本发明的纯化方法之前，溶液中蛋白质的总量为0.1-3mg/ml、0.3-2mg/ml、0.5-2mg/ml、0.5-1mg/ml、1-2mg/ml或约1mg/ml。

[0041] 在具体的实施方案中，污染蛋白的优先沉淀是直接的，不依赖或基本不依赖聚阴离子的存在。在另一个实施方案中，污染蛋白的优先沉淀是直接的，不依赖或基本不依赖固相支持体的存在。在另一个实施方案中，污染蛋白的优先沉淀不依赖或基本不依赖污染蛋白和其它分子之间聚集体的存在。例如，如果分别除去组分(例如聚阴离子、固相支持体或污染蛋白和其它分子的聚集体)不影响或基本不影响污染蛋白的优先沉淀，则污染蛋白的优先沉淀不依赖或基本不依赖该组分。除去组分非实质性影响的实例可能是，当组分存在和不存在时，污染蛋白都优先沉淀。另一个实例可能是，当组分存在或不存在时，污染蛋白都以相同程度优先沉淀。优选组分不存在或基本不存在时，污染蛋白的沉淀量与组分存在时相同或基本相同。

[0042] 在另一个实施方案中，在聚阴离子不存在或缺乏足够量的聚阴离子时，实施该方法。在另一个实施方案中，在固相支持体不存在或缺乏足够的固相支持体时，实施该方法。在另一个实施方案中，在污染蛋白和其它分子间的聚集体不存在，或缺乏足够量的污染蛋白和其它分子间的聚集体时，实施该方法。优选在由聚阴离子、固相支持体和污染蛋白和其它分子间的聚集体组成的一组成分中，2个或3个成分不存在或缺乏足够量的2个或3个成分时，实施该方法。

[0043] 本发明的方法一旦给定，按惯例本领域技术人员要选择具体所用的表面活性剂和条件(例如pH、温度、盐浓度、阳离子表面活性剂浓度、总蛋白浓度)，在此条件下实施该方法以提高具体靶蛋白的纯化效率。例如，可以比较不同pH值和表面活性剂浓度下进行的纯化，以确定最佳纯化条件。在下面的实施例部分给出了该方法的实例。在一个具体的实施方案中，在基本不减少靶蛋白回收量时，选择尽可能高的溶液pH。

[0044] 本发明另一个目的是提供测定条件的方法，该条件能够在因受阳离子表面活性剂影响的溶解度的基础上使靶蛋白得到有效纯化。

[0045] 阳离子表面活性剂的有效量是引起污染蛋白优先沉淀的表面活性剂的量。在具体的实施方案中，有效量的表面活性剂使40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的污染蛋白沉淀出来。

[0046] 在本发明的一个实施方案中，加入阳离子表面活性剂的浓度为0.001％-5.0％，优选加入阳离子表面活性剂的浓度为0.01％-0.5％，更优选加入阳离子表面活性剂的浓度为0.03％-0.2％。在具体的实施方案中，加入阳离子表面活性剂的浓度为0.01％-0.1％、0.01％-0.075％、0.01％-0.05％或0.01％-0.03％。

[0047] 在本发明的一个实施方案中，当阳离子表面活性剂是两亲性铵化合物时，实施上述方法。

[0048] 在一个优选的实施方案中，污染蛋白优先沉淀后，要对增溶靶蛋白作进一步加工处理。这样的进一步加工处理可包括另外的纯化步骤、活性或浓度测定、透析、色谱法(例如HPLC、尺寸排阻色谱法)、电泳、透析等。

[0049] 本文所用两亲性铵化合物包括具有阳离子和非极性组分且通式为QN+或RNH3+的化合物。Q表示该氮为季铵(与4个有机基共价结合，有机基彼此间可结合或不结合)。当有机基相互结合时，可以形成环脂族化合物或芳族化合物，这取决于形成环状结构各组分+间键的电子排布。如果所选的两亲性铵化合物具有通式RNH3，则化合物为伯胺，其中R为脂族基。脂族基为开链有机基。

[0050] 在本发明的一个实施方案中，所选择的两亲性铵化合物可与卤化物成盐。卤化物盐通常是指包含氟离子、氯离子、溴离子和碘离子的盐。

[0051] 在本发明的一个实施方案中，两亲性铵化合物具有至少1条含有6-20个碳原子的脂族链，优选两亲性铵化合物具有至少1条含有8-18个碳原子的脂族链。

[0052] 在本发明的一个实施方案中，所选择的两亲性铵化合物选自十六烷基吡啶 盐、硬脂酰胺-甲基吡啶 盐、月桂基吡啶 盐、十六烷基喹啉 盐、月桂基氨基丙酸甲酯盐、月桂基氨基丙酸金属盐、月桂基二甲基甜菜碱、硬脂基二甲基甜菜碱、月桂基二羟乙基甜菜碱和苄索铵盐。

[0053] 可以使用的两亲性铵化合物包括但不限于氯化十六烷基吡啶 、醋酸地喹铵、氯化十六烷基吡啶 、氯化十六烷基三甲基铵、混合氯化正烷基二甲基苄基铵、氯化十六烷基吡啶 (CPC)、氯化N，N-二甲基-N-[2-[2-[4-(1，1，3，3，-四甲基丁基)-苯氧基]乙氧基]乙基]苯甲铵、氯化烷基-二甲基苄基-铵和氯化二氯-苄基二甲基-烷基铵、溴化十四烷基三甲基铵、溴化十二烷基三甲基铵、溴化十六烷基三甲基铵、月桂基二甲基甜菜碱硬脂基二甲基甜菜碱和月桂基二羟乙基甜菜碱。

[0054] 在本发明的一个实施方案中，两亲性铵化合物是十六烷基吡啶 盐，例如氯化十六烷基吡啶 。

[0055] 在本发明的一个实施方案中，含有所需蛋白质的混合物还包含细胞组分，例如来源于微生物(例如细菌例如大肠杆菌)的细胞组分。

[0056] 在本发明的一个实施方案中，细胞组分是一种或多种蛋白质。

[0057] 在本发明的一个实施方案中，靶蛋白可以是重组蛋白，例如酶。

[0058] 可以使用本发明的方法来纯化多种蛋白质。这些蛋白质可包括但不限于抗体、尿酸氧化酶、干扰素β、水蛭因子X抑制剂、酸性脱氧核糖核酸酶II、弹性蛋白酶、溶菌酶、木瓜蛋白酶、过氧化物酶、胰核糖核酸酶、胰蛋白酶原、胰蛋白酶、细胞色素c、半环扁尾蛇毒素、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)肠毒素C1、单胺氧化酶A和其它在碱性条件下带正电荷的蛋白质。

[0059] 在本发明的一个实施方案中，靶蛋白可以是抗体、受体、酶、转运蛋白、激素或它们的片段或者缀合物(例如与第二种蛋白质或化学药品或毒素缀合的缀合物)。

[0060] 抗体包括但不限于单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、双特异性抗体、Fab片段、F(ab′)2片段、Fab表达文库所产生的片段、抗独特型(抗Id)抗体以及上述任何抗体或片段的表位结合片段，前提条件是纯化条件下抗体是带正电荷的。

[0061] 为了制备单克隆抗体，可以使用通过细胞系连续培养来提供抗体分子产生的任何技术。这些技术包括但不限于杂交瘤技术(参见Kohler和Milstein，1975，Nature256，495-497和美国专利第4,376,110号)、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983，ImmunologyToday 4，72；Cole 等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80，2026-2030) 及 产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole等，1985，MonoclonalAntibodies And Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，第77-96页)。

[0062] 这些抗体可以用作克隆的基础，从而重组表达每条重链和轻链。两条链可在同一细胞中进行重组表达或者分别表达和纯化后在体外结合。对于多聚体蛋白的表达，可将编码所需重链或轻链的核酸或编码包含所需重链或轻链可变区的分子的核酸(例如质粒载体核酸)转染到细胞中，该细胞表达独特的抗体重链或轻链或者包含抗体重链或轻链的分子。或者，重链或者包含重链可变区或重链CDR的分子可任选在互补轻链或轻链可变区不存在时进行表达和使用。在其它实施方案中，这些抗体和蛋白质可以是N端或C端修饰的，例如通过C端酰胺化或N端乙酰化。

[0063] 嵌合抗体是从各种不同动物物种中获得的不同部分的分子，例如具有从鼠mAb获得的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体分子(参见例如Cabilly等，美国专利第4,816,567号和Boss等，美国专利第5,816,397号)。用于产生嵌合抗体的技术包括将来自适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与具有适当生物活性的人抗体分子的基因剪接在一起(参见例如Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.，81，6851-6855；Neuberger等，
1984，Nature 312，604-608；Takeda等，1985，Nature 314，452-454)。

[0064] 人源化抗体是具有一个或多个非人类的互补决定区(CDR)和人免疫球蛋白分子的构架区的非人类抗体分子。用于产生人源化抗体的技术参见例如Queen，美国专利第5,585,089号和Winter，美国专利第5,225,539号。构架区和CDR的长度已有明确定义(参见″Sequences of Proteins of Immunological Interest″，Kabat，E.等，U.S.Department of Health and Human Services(1983))。

[0065] 单链抗体是将Fv区的重链片段和轻链片段通过氨基酸桥连接产生单链多肽而形成的。用于产生单链抗体的技术参见例如美国专利第4,946,778号；Bird，1988，Science242，423-426；Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，5879-5883和Ward等，1989，Nature 334，544-546)。

[0066] 双特异性抗体是识别两种类型的靶标(例如(1)特异性表位和(2)“触发”分子例如骨髓细胞的Fc受体)的基因工程抗体。这种双特异性抗体可以通过化学缀合、杂交瘤或重组分子生物学技术来制备。

[0067] 抗体片段包括但不限于F(ab′)2片段和F(ab′)片段，其中F(ab′)2片段是用胃蛋白酶消化抗体分子而产生的，F(ab′)片段是通过还原F(ab′)2片段的二硫桥而产生的。或者，可以构建Fab表达文库(Huse等，1989，Science 246，1275-1281)，以快速容易地鉴定出具有所需特异性的单克隆Fab片段。

[0068] 在本发明一个实施方案中，蛋白质是尿酸氧化酶。

[0069] 在本发明另一个实施方案中，尿酸氧化酶是哺乳动物尿酸氧化酶。

[0070] 在本发明另一个实施方案中，哺乳动物尿酸氧化酶是变异的哺乳动物尿酸氧化酶。

[0071] 在本发明另一个实施方案中，哺乳动物尿酸氧化酶是猪尿酸氧化酶。

[0072] 在本发明另一个实施方案中，变异的猪尿酸氧化酶是指定的PKSΔN尿酸氧化酶。

[0073] 在本发明另一个实施方案中，蛋白质是抗体。

[0074] 在本发明另一个实施方案中，抗体是单链抗体。

[0075] 在本发明另一个实施方案中，蛋白质是干扰素。

[0076] 在本发明另一个实施方案中，干扰素是干扰素β。在一个具体的实施方案中，干扰素是干扰素β1b。Nagola，S等，Nature，284：316(1980)；Goeddel，D.V.等，Nature，287：411(1980)；Yelverton，E.等，Nuc.Acid Res.，9：731(1981)；Streuli，M.等，Proc.Nat′l Acad.Sci.(U.S.)，78：2848(1981)；1981年5月6日公布的欧洲专利申请第28033号；1981年7月15日公布的欧洲专利申请第321134号；1981年8月26日公布的欧洲专利申请第
34307号和1981年7月1日授权的比利时专利第837379号，记载了各种应用重组DNA技术生产β干扰素的方法。由细菌产生的IFN的回收和纯化方法参见美国专利号4,450,103、
4,315,852、4,343,735和4,343,736；Derynck等，Nature(1980)287：193-197及Scandella和Kornberg，Biochemistry，10：4447(1971)。

[0077] 在一个具体的实施方案中，靶蛋白是水蛭因子Xa。水蛭因子Xa可通过本领域技术人员已知的任何方法产生，例如美国专利第6,211,341号和国际专利公布号WO94/23735中记载的方法。

[0078] 在本发明一个实施方案中，接触是在以下时间内完成的：约1分钟至约48小时，更优选约10分钟至约24小时、约30分钟至约12小时、约30分钟至约8小时、约30分钟至约6小时、约30分钟至约4小时、约30分钟至约2小时、约30分钟至约1小时或约1小时至约2小时。

[0079] 在本发明一个实施方案中，接触是在温度约4℃至约36℃、更优选约4℃至约26℃时完成的。

[0080] 本发明还提供用阳离子表面活性剂作为单一成分在碱性条件下，纯化等电点＞7的蛋白质。

[0081] 本发明还提供在碱性条件下，向混合物中添加氯化十六烷基吡啶 ，从混合物中提纯的尿酸氧化酶。

[0082] 在本发明一个实施方案中，通过包括处理细菌细胞使之表达DNA，产生尿酸氧化酶并回收尿酸氧化酶的方法，从包含尿酸氧化酶编码DNA的细菌细胞获得尿酸氧化酶。

[0083] 在本发明一个实施方案中，尿酸氧化酶是从细菌细胞的沉淀中回收的。

[0084] 本发明还提供纯化的尿酸氧化酶，用于制备尿酸氧化酶-多聚体缀合物。

[0085] 本发明还提供等电点大于7的纯化蛋白质，可通过以下方法获得：在蛋白质带正电荷或具有正电荷区域的条件下，使含有蛋白质的混合物与有效量的阳离子表面活性剂接触，并回收蛋白质。

[0086] 本发明还提供使用十六烷基吡啶 盐来纯化等电点大于7的蛋白质。

[0087] 至于pH，在靶蛋白带正电荷的条件下，使混合物与有效量的阳离子表面活性剂接触的实施方案中，pH将随靶蛋白的性质而变化。然而，pH优选在pH7和pH11之间；优选的范围约为pH7-pH10、pH7-pH9、pH8-pH11、pH8-pH10或pH8-pH9。

[0088] 实施例

[0089] 下面提到的实施例有助于理解本发明，但无意也不应当解释为以任何方式限制本发明的范围。

[0090] 实施例1.应用CPC来纯化重组哺乳动物尿酸氧化酶

[0091] 1.1.背景

[0092] 药用级尿酸氧化酶必须基本上不含非尿酸氧化酶蛋白。大肠杆菌产生的哺乳动物尿酸氧化酶(等电点8.67)在胞内类似于被称为包含体(IB)的细胞器中以沉淀累积，它可容易地分离作进一步纯化。与IB含有颠倒/错折叠表达蛋白的传统观点相反，这些IB样元件在沉淀形式中含有正确折叠的尿酸氧化酶。尿酸氧化酶IB样元件暴露在碱性pH(例如约pH 9-11)时，沉淀的蛋白质会重新溶解。增溶IB样元件中尿酸氧化酶的含量约40-60％，需要进一步纯化以获得均质的尿酸氧化酶制品。因此，我们证实了可以用多种方法评价用CPC纯化尿酸氧化酶和其它蛋白质的情况。例如，可以通过测定比活、SDS-PAGE凝胶电泳和染色后显现的条带数目及尺寸排阻HPLC后色谱图中出现的峰数和大小，评价哺乳动物尿酸氧化酶的纯度。

[0093] 1.2.材料与方法

[0094] 1.2.1.50mM NaHCO3缓冲液(pH 10.3)

[0095] 将NaHCO3溶解至终浓度为50mM，来制备缓冲液。调节pH至10.2-10.4。可使用0.1M HCl或1N NaOH，视起始pH而定。

[0096] 1.2.2.10％CPC溶液

[0097] 将CPC溶于蒸馏水中至终浓度为10g/100ml，制备10％CPC。

[0098] 1.2.3.重组猪尿酸氧化酶表达

[0099] 使重组哺乳动物尿酸氧化酶在大肠杆菌K-12菌株W3110F-中进行表达，参见国际专利公布号WO00/08196(Duke University)和美国专利临时申请号60/095,489，这些文献的内容都通过引用全部结合到本文中。

[0100] 1.2.4.产尿酸氧化酶细菌的培养和收获

[0101] 37℃下，将细菌在生长培养基中进行培养，培养基中含有酪蛋白水解物、酵母提取物、盐、葡萄糖和氨。

[0102] 培养后，通过离心收获积累尿酸氧化酶的细菌，用水洗涤除去残余的培养基。

[0103] 1.2.5.细胞破碎和回收

[0104] 将收获的细胞沉淀悬浮于50mM Tris缓冲液(pH 8.0)和10mM EDTA中，使终体积约为细胞干重(DCW)的20倍。在混合的同时，将溶菌酶按2000-3000单位/ml的浓度加入到悬浮的沉淀物中，然后于4-8℃保温16-20小时。

[0105] 然后，通过高剪切力混合，随后用超声处理，对细胞裂解物进行处理。悬液用等体积去离子水稀释后离心。含有尿酸氧化酶包含体的沉淀用去离子水(重量/重量)稀释后离心，进一步除去杂质。保留从最后这一洗涤步骤所得到的沉淀物留待进一步加工处理，并弃去上清液。

[0106] 1.2.6.溶解

[0107] 将包含体(IB)沉淀悬浮于50mM NaHCO3缓冲液(pH10.3±0.1)中。悬液于25±2℃温度下保温约0.5-2小时，使得自IB的尿酸氧化酶增溶。

[0108] 1.2.7.CPC处理

[0109] 充分混合下，将10％CPC溶液等分地加入到匀浆的IB(pH10.3)中，得到所需的CPC浓度。样品按规定保温1-24小时，在此期间形成絮片状沉淀。将样品以12,000Xg离心15分钟。将沉淀和上清液分开，沉淀用50mM NaHCO3缓冲液(pH 10.3)悬浮至原体积。测定各个级分的酶活性，浓缩各级分，透析除去残余的CPC。

[0110] 1.2.8.蛋白质测定

[0111] 采用改进的Bradford方法，测定等分的处理和未处理IB样品的蛋白质含量(Macart和Gerbaut(1982)Clin Chim Acta 122：93-101)。

[0112] 1.2.9.尿酸氧化酶测定

[0113] 1.2.9.1.酶活性

[0114] 通过UV方法测定尿酸氧化酶活性(Fridovich，I.(1965)Thecompetitive inhibition of uricase by oxonate and by related derivatives ofs-triazines.J Biol Chem，240，2491-2494；通过掺入1mg/ml BSA后的改进方法)。通过测量292nm下由尿酸氧化成尿囊素所产生吸光度的降低，测定酶促反应速率，样品一式两份。一个活性单位定义为规定条件下，于25℃每分钟氧化1μmol尿酸所需要的尿酸氧化酶的量。尿酸氧化酶功效用活性单位/mg蛋白质(U/mg)表示。

[0115] 292nm、1cm光程长度下，1mM尿酸的消光系数为12.2。因此，每ml反应混合物氧化1μmol尿酸，导致12.2mA292的吸光度降低。根据曲线的直线部分求出随时间的吸光度变化(ΔA292/分钟)。然后，如下计算尿酸氧化酶活性：

[0116]

[0117] 其中：DF＝稀释倍数；

[0118] VRM＝反应混合物总体积(μl)

[0119] Vs＝反应混合物中所用稀释样品的体积(μl)

[0120] 1.2.9.2.Superdex 200 HPLC分析

[0121] 根据用Superdex 200柱的HPLC所得到的洗脱图，定量测定天然尿酸氧化酶以及可能的污染物的含量和相对百分比。将一式两份的尿酸氧化酶溶液样品注入柱中。自动计算出各个峰面积和占总面积的百分比并概括于紧接的下表中。

[0122] 1.2.10.SDS-PAGE分析

[0123] 含有～20μg蛋白质/泳道的样品中的蛋白质用15％SDS-PAGE凝胶进行分离。所得凝胶用考马斯亮蓝染色。

[0124] 1.3.结果

[0125] CPC(0.005-0.075％)处理(1-24小时)对上清液中回收的尿酸氧化酶活性及其纯度的影响见表1和图1。CPC处理(pH 10.3)前，蛋白质浓度为1.95mg/ml，酶比活为3.4-4.67 U/mg。图1B所示结果表明在各温育期间，随CPC浓度增加，上清液的蛋白质浓度降低。小于0.04％CPC时，观察到对蛋白质浓度的影响相对较小。CPC浓度为0.04％-0.075％时，可能降低蛋白质浓度至原浓度的约50％。

[0126] 与CPC对总蛋白浓度的影响相反，CPC浓度和温育时间增加，总可溶性尿酸氧化酶活性未受明显影响(图1A)。在各温育期内，酶比活在0.04％-0.075％范围内随CPC浓度变化而始终增加(图1C)。这种增加是特异性除去非尿酸氧化酶蛋白的结果。因为最终纯化酶的酶比活约9U/mg，所以通过CPC沉淀除去了大多数的污染蛋白。事实上，所进行的HPLC和SDS-PAGE分析支持这个结论。

[0127] 表1.CPC暴露对尿酸氧化酶比活和纯度的影响

[0128]

[0129] 1.4.证实CPC可提高尿酸氧化酶纯度

[0130] 如第1.3节所述，分离出含IB的尿酸氧化酶并使之增溶。CPC处理前及CPC沉淀蛋白过滤后，对可溶性物质样品进行分析。

[0131] 1.4.1.0.075％CPC处理后非尿酸氧化酶蛋白的HPLC分析

[0132] 增溶IB的HPLC分析表明，尿酸氧化酶相关峰(保留时间(RT)～25.5分钟)包含约46％的粗制IB样品蛋白质(图2A)。CPC处理后，尿酸氧化酶相关峰增加至约92％的蛋白质(图2B)，并且伴有RT 15-22分钟间洗脱污染物的显著减少(图2A)。尿酸氧化酶的峰面积约为图2A峰面积的70％。因此，这些结果表明由CPC处理后除掉非尿酸氧化酶蛋白所致的尿酸氧化酶纯度加倍。

[0133] 1.4.2.0.075％CPC对酶活性的影响

[0134] 结果(见表2)表明，在处理过程中，尿酸氧化酶活性保持质量平衡。发现暴露于CPC使溶液中所有蛋白质的60％沉淀出来。溶液中超过85％的酶活性依然保持，因此，除去外来蛋白质使上清液所产生的比活增加110％以上。同许多纯化方法一样，某些所需活性保留在沉淀中。在这种情况下，沉淀中仅保持最初活性的17.6％(用50mM碳酸氢钠(7mSi，pH 10.3)提取用于分析目的)，它占总量相对较少的部分。

[0135] 表2.CPC处理对尿酸氧化酶活性的影响

[0136]

[0137] 1.4.3.0.075％CPC处理后的SDS-PAGE分析

[0138] 用SDS-PAGE方法对以下含有等量蛋白质的成分进行分析：暴露于CPC之前粗制尿酸氧化酶样品；可溶性和不溶性物质分离后，经CPC处理，级分离心分离后的级分；离心后所得沉淀重构成分。结果(见图3)显示，CPC处理前存在污染蛋白。CPC处理后，沉淀物含有大多数的污染蛋白，而上清液则含有导致单条主要蛋白质带的尿酸氧化酶。

[0139] 实施例2.CPC对单链(scFv)抗体纯化的影响

[0140] 2.1.材料与方法

[0141] 2.1.1.缓冲液

[0142] 2.1.1.1.包含体溶解缓冲液

[0143] 溶解缓冲液含有6M尿素、50mM Tris、1mM EDTA和0.1M半胱氨酸。缓冲液pH滴定至8.5。

[0144] 2.1.1.2.折叠缓冲液

[0145] 折叠缓冲液含有1M尿素、0.25mM NaCl、1mM EDTA和0.1M半胱氨酸。缓冲液pH滴定至10.0。

[0146] 2.1.2.scFv抗体在细菌中的表达

[0147] 使scFv抗体(pI 8.9)在用scFv编码载体转化的大肠杆菌中进行表达，scFv在C端具有半胱氨酸-赖氨酸-丙氨酸-赖氨酸，见PCT公布号WO 02/059264，该文献的内容通过引用全部结合到本文中。

[0148] 2.1.3.产scFv抗体细菌的培养和收获

[0149] 诱导前5小时内，将含scFv的细菌细胞在基本培养基(pH7.2)中进行培养，培养基补充有L-精氨酸，终浓度为0.5％。通过限制培养基的葡萄糖含量，诱导scFv表达。用超滤法从培养物中收获含scFv的细菌细胞。

[0150] 2.1.4.细胞破碎和包含体回收

[0151] 将所收获的细胞沉淀悬浮于50mM Tris缓冲液(pH 8.0)和10mM EDTA中，使终体积约为细胞干重(DCW)的20倍。在混合的同时，将溶菌酶按2000-3000单位/ml的浓度加入到悬浮的沉淀物中，然后于4℃保温16-20小时。

[0152] 然后，通过高剪切力混合，随后用超声处理，对细胞裂解物进行处理。通过离心(10,000Xg)，回收含scFv抗体的包含体。沉淀用去离子水(重量/重量)稀释约16倍，离心进一步除去杂质。保留从最后这一洗涤步骤所得到的沉淀留待进一步加工处理。

[0153] 2.1.5.溶解和重折叠

[0154] 将富含IB的沉淀悬浮于包含体溶解缓冲液中(参见上文)，室温下温育5小时，在精氨酸/氧化谷胱甘肽型溶液中进行体外重折叠。重折叠后，蛋白质经过透析，用切向流过滤对含尿素/磷酸缓冲液进行浓缩。

[0155] 2.1.6.CPC处理

[0156] 将10％CPC溶液加入到scFv重折叠混合物至终浓度为0.02％，室温下1-2小时温育后，过滤除去沉淀。上清液中含有scFv抗体。

[0157] 2.2.结果

[0158] 2.2.1.CPC浓度对可回收scFv抗体的影响

[0159] CPC(pH 7.5或pH10)对scFv抗体纯度和回收的影响见表3。CPC处理前，如HPLC分析(Superdex 75)测定，IB蛋白的最初含量为73mg，含有15.87mg scFv抗体。含scFv抗体峰的保留时间(RT)约20.6分钟。结果表明，随CPC浓度增加，总蛋白的回收通常减少，当CPC浓度＜0.03％时，scFv抗体的回收率保持在＞80％。相对于pH10，pH 7.5时可更有效地除去污染蛋白。因此，通过用0.01-0.03％CPC处理实现了scFv抗体纯化。

[0160] 表3.CPC处理对scFv抗体回收率和纯度的影响

[0161]

[0162] 2.3.证实CPC可提高scFv抗体纯度

[0163] 2.3.1.CPC处理后scFv回收的HPLC分析

[0164] 重折叠蛋白的HPLC分析表明，scFv抗体相关峰(保留时间(RT)～20.6分钟)包含占总蛋白约22.7％的蛋白质(图4B)。图4C色谱图表明，0.02％CPC处理后，上清液的scFv抗体相关峰包含占所注入总蛋白的约75.9％，纯化3.3倍。因此，CPC处理除去了scFv抗体溶液中的蛋白质杂质。

[0165] 2.3.2.CPC处理后scFv回收的SDS-PAGE分析

[0166] 结果(见图5)表明，CPC处理前，样品包含大量的多种蛋白质。同样，CPC处理后，沉淀也包含很多蛋白质。相比之下，CPC处理后上清液包含一条主要的蛋白质条带，即scFv抗体条带。

[0167] 实施例3.CPC对重组干扰素β纯化的影响

[0168] 用已知方法使干扰素β(IFN-β，pI 8.5-8.9)在大肠杆菌中进行表达。Nagola，S. 等，Nature，284：316(1980)；Goeddel，D.V. 等，Nature，287：411(1980)；Yelverton，E.等，Nuc.Acid Res.，9：731(1981)；Streuli，M.等，Proc.Nat′l Acad.Sci.(U.S.)，78：2848(1981)；1981年5月6日公布的欧洲专利申请第28033号；1981年7月15日公布的欧洲专利申请第321134号；1981年8月26日公布的欧洲专利申请第34307号；1981年7月1日授权的比利时专利第837379号中，记载了各种应用重组DNA技术生产β干扰素的方法。
由细菌产生的IFN的回收和纯化方法参见美国专利号4,450,103、4,315,852、4,343,735和 4,343,736；Derynck 等，Nature(1980)287：193-197 及 Scandella 和 Kornberg，Biochemistry，10：4447(1971)。分离出含有IFN-β的包含体并使之溶解。

[0169] 所得溶液用CPC处理。图6所示结果表明CPC处理后，污染蛋白存在的水平大为降低。CPC处理后，IFN-β的实际含量(峰下面积)没有明显变化。

[0170] 表4概括了CPC处理的作用。总蛋白(Bradford法)降低40％，UV吸光度降低约40％，但IFN-β的含量则保持不变。

[0171] 表4.

[0172]

[0173] a Vydac C4柱定量测定

[0174] b 包含数个峰的SEC图。经CPC处理，13分钟(保留时间13分钟)时的洗脱峰减小，并相当于高分子量蛋白质及其变异体洗脱的区域。

[0175] 实施例4. CPC对因子Xa抑制剂纯化的影响

[0176] 使用CPC来纯化水蛭因子Xa抑制剂。水蛭因子Xa抑制剂(FXaI，pI 8.4-9.1)的生产参见美国专利第6,211,341号和国际专利公布号WO94/23735。分离出含FXaI的包含体(IB)后，基本上按实施例1所述方法，从IB中纯化出FxaI。IB沉淀溶解后，制备物与10％CPC溶液一起保温。然后，将混合物以12,000Xg离心15分钟。使沉淀和上清液分开。
将沉淀用50mM NaHCO3缓冲液悬浮至原体积。沉淀和上清液分别经浓缩和透析以除去残余的CPC。测定蛋白质含量及活性，发现FxaI为上清液的主要组分，沉淀中则基本不存在。结果表明，CPC处理提高了所回收的FxaI的回收效率和纯度。

[0177] 实施例5.通过CPC纯化羧肽酶B(CPB)

[0178] 使从表达CPB克隆获得的等量的包含体在8M尿素(pH9.5)中增溶(对照和试样)。CPB的产生参见国际专利公布号WO96/23064和美国专利第5,948,668号。测试样品用0.11％CPC处理，过滤澄清后重折叠。所得溶液用重折叠缓冲液按1∶8进行稀释，使对照和测试样品进行重折叠。室温下，用内切蛋白酶处理过夜后，将等量对照和测试溶液加到DEAE琼脂糖凝胶柱中。洗柱，活性酶随后用60mM氯化钠/20mM Tris缓冲液(pH8)洗脱。

[0179] 表5.

[0180]

[0181] (*)通过Bradford法进行蛋白质测定。

[0182] (**)重折叠之前蛋白质无活性。

[0183] 表5所示结果显示，CPC处理物的总OD下降49.5％，总蛋白含量减少44.5％。有趣的是，CPC处理样品回收的总酶活性增加79％，提示CPC除去了部分抑制活性酶产生的组分。

[0184] 本文所引用的所有参考文献的内容都通过引用全部结合到本文中并用于所有目的，其程度与每个独立出版物或专利或专利申请具体而单独指明通过引用全部结合到本文中用于所有目的一样。

[0185] 在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明进行许多修改和变动，这对本领域技术人员而言是显而易见的。本文所述的具体实施方案仅以实施例的方式给出，且仅通过所附权利要求书以及该权利要求书中要求的等同内容的全部范围限制本发明。