一组含γ-核心模序的新型环化抗菌肽及其制备方法和应用

摘要

本发明提供了一组含γ-核心模序的新型环化抗菌肽，这些抗菌肽含有遗传进化标志，具有抗菌效果好、毒性低、稳定性好以及不易耐药的优点。本发明还公开了该组抗菌肽的固相化学制备和空气氧化的方法。本发明合成的抗菌肽可用于制备抗多重耐药菌感染的药物。

权利要求

1.一种含γ-核心模序的新型环化抗菌肽DS34，其特征在于，其氨基酸序列为：亮氨酸，Lys赖氨酸，Met蛋氨酸，Phe苯丙氨酸，Pro脯氨酸，Ser丝氨酸，Thr苏氨酸，Tyr酪氨酸，Val缬氨酸。

2.一种根据权利要求1中的含γ-核心模序的新型环化抗菌肽的制备方法，其特征在于：所述的多肽是以固相化学合成方法产生、空气氧化法环化，其羧基末端进行酰胺化。

3.一种根据权利要求1所述的含γ-核心模序的新型环化抗菌肽用于制备抗多重耐药菌药物的用途。

说明书

一组含γ-核心模序的新型环化抗菌肽及其制备方法和应

用

技术领域

[0001] 本发明涉及一组含γ-核心模序的新型环化抗菌肽及其制备方法和治疗多重耐药菌感染的应用。

背景技术

[0002] 截至目前，600多条抗菌肽(又称之为阳离子宿主防御肽，AMPs)已经被证实不仅能够杀死革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、病毒、原虫和真菌等致病微生物，而且在招募巨噬细胞和增强先天免疫系统作用中发挥重要作用。与传统的抗生素相比，抗菌肽杀灭细菌的速度快的多，涉及到细菌细胞内多个靶点。它们能够作为抗菌剂而被单独使用，也能结合其它的抗生素而发挥协同效应，或者作为免疫调节剂和中和内毒素物质。最值得关注的是，抗菌肽被公认为是不可能产生完全耐药性的。因为它主要是通过物理渗透作用于细菌胞膜，微生物很难改变自身的胞膜(磷脂双分子层)结构，从而使微生物不易对其产生耐药性。另外，抗菌肽在微生物体内有多个作用靶点，减少胞内任何一个作用靶点，都不会使其耐药性增加很多。同时，抗菌肽和其它的抗菌肽或传统的抗生素联合应用，不会发生交叉耐药。抗菌肽不易产生耐药性的优越性质，为人们寻找理想的抗菌药物提供了新的领域，为人类战胜耐药微生物带来了新的契机，抗菌肽也因此具有巨大的研发和应用的潜力。

[0003] 尽管自然界发现的天然抗菌肽和人工改造、设计合成的抗菌肽种类繁多，但是抗菌肽应用于临床的成功率却很低。其主要原因是抗菌肽在研发中还存在一些亟待解决的问题：第一，毒性问题是其不能应用于全身的主要原因。抗菌肽主要通过破坏细菌细胞膜而发挥杀菌作用，选择性不高，非选择性的细胞毒作用易使红细胞膜破裂溶血。如多粘菌素类和短杆菌肽S在临床使用中毒性太大，不能作为抗菌剂或抗内毒素剂全身使用，只能被局部联合使用。第二，稳定性问题是其临床应用的第二大难点。抗菌肽是小分子量的蛋白质，易被蛋白酶水解，体内半衰期短。第三，抗菌肽体内外活性存在差异。尽管许多抗菌肽在体外显示出明显的抗菌活性，但在生理盐浓度和血浆条件下，许多抗菌肽的活性丧失。而有些宿主防御肽在体外无抗菌活性，在体内却能通过免疫调节而发挥抗菌作用。第四，生产成本昂贵是限制其临床应用的直接原因。抗菌肽的来源十分困难：天然提取资源有限，分离纯化工艺复杂，成本高；化学合成相对于抗生素来说，成本也高得多，产业化困难；基因工程表达则抗菌活性差、易导致宿主细胞自杀，难以用常用的细菌、病毒做表达体系，且表达产量不高。因此，急需改造分子量大、生产成本高的天然肽为分子量小、生产成本相对低的人工肽，从而最终降低其生产成本。

[0004] 最近在含半胱氨酸稳定的抗微生物多肽、毒素、毒液、kinocidins和宿主防御肽等许多多肽中发现了一个结构模序——γ-核心模序。它是一个具有遗传进化标志的保守三维结构模序，是由特定氨基酸序列组成的双向定向结构。Thanatin是目前发现的具有γ-核心模序的最简单的抗菌肽。对革兰氏阴性菌具有较强的抗菌活性，毒性低，稳定性好。本发明通过截短、替换、移位和环化对thanatin序列进行改造，得到具有不同抗菌谱、低毒、稳定的含γ-核心模序的新型环化抗菌肽。

发明内容

[0005] 本发明需要解决的技术问题之一是提供一组新型抗菌肽。

[0006] 本发明需要解决的技术问题之二是提供一组新型抗菌肽的制备方法。

[0007] 本发明需要解决的技术问题之三是公开所述抗菌肽的应用。

[0008] 本发明的构思如下：改造设计的主要思路是保持thanatin的遗传进化标志(γ-核心模序)，用6条天然存在的含γ-核心模序抗菌肽β隆起部位的氨基酸序列替换thanatin的相应部位序列，得到一系列新的序列；截掉这些序列N-末端的8个氨基酸，又得到一系列新的序列；在此基础上再截掉这些序列C-末端的1个氨基酸，又得到仅保留γ-核心的一系列新的序列，上述所有多肽链的C-末端均进行酰胺化，肽链内的两个半胱氨酸均环化形成一个胱氨酸。经过改造后筛选到以下37条序列具有不同的抗菌活性，而溶血毒性基本没有变化，非常有希望用于治疗细菌感染的新药的开发。

[0009] 本发明提供的抗菌肽是在对天然抗菌肽的序列、结构分析的基础上设计合成的，它们的这一系列序列被命名为DS，序列如下：

[0010] Thanatin

[0011] DS01

[0012] DS02

[0013] DS03

[0014] DS04

[0015] DS05

[0016] DS06

[0017] DS07

[0018] DS08

[0019] DS09

[0020] DS10

[0021] DS11

[0022] DS12

[0023] DS13

[0024] DS14

[0025] DS15

[0026] DS16

[0027] DS17

[0028] DS18

[0029] DS19

[0030] DS20

[0031] DS21

[0032] DS22

[0033] DS23

[0034] DS24

[0035] DS25

[0036] DS26

[0037] DS27

[0038] DS28

[0039] DS29

[0040] DS30

[0041] DS31

[0042] DS32

[0043] DS33

[0044] DS34

[0045] DS35

[0046] DS36

[0047] DS37

[0048] 所述的含γ-核心模序的新型环化抗菌肽为12、13和21个氨基酸，羧基末端全部酰胺化修饰，肽链内的两个半胱氨酸均环化形成一个胱氨酸。

[0049] 本发明提供的一组抗菌肽，其制备方法是固相化学合成。先用MALDI-TOF质谱仪测定多肽粗品的分子量；再用RP-HPLC色谱仪对多肽粗品进行分离纯化；最后用ESI质谱仪测定多肽纯品的分子量，并用RP-HPLC色谱仪对多肽纯品进行纯度分析。对于环化的多肽链，采用空气氧化的方法形成分子内二硫键。多肽氧化过程中，用反向高效液相色谱法(RP-HPLC)不断分析多肽氧化色谱峰与还原色谱峰面积的变化；监测多肽氧化的进程并对氧化后的多肽进行RP-HPLC纯化；最后用ESI质谱仪测定氧化前后多肽纯品的分子量。

[0050] 采用试管法检测多肽的杀菌曲线，以抗生素氨苄西林和头孢他啶为对照，进行杀菌活性的检测。结果表明本发明制备出的抗菌肽其杀菌活性强于所述两种抗生素的杀菌活性。杀菌曲线结果显示，抗菌肽对革兰氏阳性耐药菌耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)有明显的杀菌作用，随着作用时间的延长，细菌数逐渐降低。

[0051] 采用试管法检测不同浓度多肽的剂量效应曲线，以抗生素氨苄西林为对照，进行杀菌活性的检测。浓度效应关系结果显示，不同浓度抗菌肽对MRSE有显著的杀灭作用，且具有浓度依赖效应。

[0052] 抗菌肽在高效杀菌的同时也有可能作用于高等有机体包括人体细胞，因为抗菌肽的作用方式主要是在细胞膜上穿孔使得细胞发生渗漏死亡。所以把抗菌肽能否使红细胞发生渗漏作为其是否有毒性的一个标准，如果抗菌肽能使红细胞中的血红蛋白发生渗漏，就可以通过检测OD540值确定毒性的大小。因此本发明还检测了抗菌肽对人体红细胞的溶血活性，实验表明在128μg/ml时，抗菌肽的溶血率值仍为零，证实本发明抗菌肽抗菌肽的溶血毒性极小，它们？的半效溶血浓度(HC50)值远高于阳性对照Melittin。

[0053] 为了明确多肽在血浆中的稳定性，我们进行了50％血浆稳定性实验，结果表明抗菌肽与血浆孵育6h后，其MIC值不变，表明它们在血浆中稳定，而对照抗菌肽S4(1-16)的MIC值明显增高，说明它在血浆中被严重降解。

[0054] 耐药性实验结果证明，MRSE与药物相互作用15代后，对所用抗生素红霉素、头孢曲松和苯唑西林均产生了严重的耐药，而对抗菌肽均没有产生耐药性。

附图说明

[0055] 现结合附图和实施例对本发明的内容作进一步说明。

[0056] 图1是抗菌肽US34粗品的MALDI-TOF质谱图；

[0057] 图2是抗菌肽US34纯品的ESI-MS质谱图；

[0058] 图3是抗菌肽US34纯品的RP-HPLC色谱图；

[0059] 图4是抗菌肽US32纯品空气氧化不同时间后的RP-HPLC色谱图；

[0060] 图5是抗菌肽US32环化前后纯品的ESI-MS质谱图和RP-HPLC色谱图；

[0061] 图6是抗菌肽DS34纯品的ESI-MS质谱图；

[0062] 图7是抗菌肽DS34纯品的RP-HPLC色谱图；

[0063] 图8是抗菌肽DS34的杀菌曲线；

[0064] 图9是不同剂量DS34作用后平板克隆形成实验结果的统计图；

[0065] 图10是抗菌肽DS34的溶血曲线；

[0066] 图11是抗菌肽DS34的耐药性实验；

[0067] 图12是抗菌肽DS34的50％血浆稳定性实验。

具体实施方式

[0068] 下面通过具体实施例，以DS34为例，进一步详述本发明。

[0069] 实施例1 抗菌肽的制备及分离纯化。在本实施例中，按上述序列制备DS1到DS37，同时制备Melittin和K4-S4(1-16)作为对照。本实施例以HOBt/DIC为缩合剂，在Rink树脂上，采用Fmoc保护α氨基酸，从C-端(羧基端)向N-端(氨基端)手动固相合成C-末端酰胺化的多肽链。合成的多肽经过高浓度TFA剪切后，先用MALDI-TOF质谱仪测定多肽粗品的分子量；再用RP-HPLC色谱仪对多肽粗品进行分离纯化；最后用ESI质谱仪测定多肽纯品的分子量，并用RP-HPLC色谱仪对多肽纯品进行纯度分析。采用空气氧化的方法形成分子内二硫键。

[0070] Melittin的序列：

[0071] Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-NH2。

[0072] K4-S4(1-16)的序列：

[0073] Ala-Leu-Trp-Lys-Thr-Leu-Leu-Lys-Lys-Val-Leu-Lys-Ala-Ala-Ala-Lys-NH2。

[0074] 具体试验步骤如下。

[0075] 第一步，抗菌肽的固相合成(以34号样品为例)。制备的多肽从C端到N端逐个进行。首先称量0.5gRink Amide-AM树脂装柱，加2.5ml二氯甲烷(CHCl2)，使其溶胀，20％哌啶/二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱保护，DMF清洗。9-笏甲氧羰基(Fmoc)保护的第一个氨基酸、羟基苯并三唑(HOBt)和二异丙基碳二亚胺(DIC)溶解于适量DMF，活化后与脱保护后的树脂在柱上循环偶合反应30min～2h，DMF洗涤。以后连接的氨基酸重复以上活化、缩合、脱保护和洗涤的过程，直到制备结束。

[0076] 第二步，抗菌肽的剪切(以34号样品为例)。取下反应后的树脂，加入切割液(90％三氟乙酸，5％苯甲硫醚，3％苯甲醚，2％乙二硫醇)，室温反应3-4小时，过滤，滤出液中加入10倍体积的预冷无水乙醚，3500转/分钟离心5分钟，收集沉淀并室温干燥。

[0077] 第三步，抗菌肽的MALDI-TOF质谱鉴定(以34号样品为例)。取0.5μl多肽样品溶液的氧化铁分散液点于MALDI靶板上，再点上0.5μL的有机基质溶液，待靶板上的点样液干燥、结晶后，将靶板放进质谱仪，进行质谱测定。结果如图1所示，制备的US34经过MALDI-TOF分析，在质谱图中显示的分子量测定值(1642.0KD)与多肽序列计算出的理论值(1641.9KD)一致，说明制备的多肽即为设计的抗微生物肽。

[0078] 第四步，抗菌肽的RP-HPLC纯化(以34号样品为例)。称量一定量干燥后的多肽，溶于0.1％三氟乙酸，样品处理后经反向柱梯度分离(洗脱液为含0.1％三氟乙酸的20％-80％的乙腈)，收集洗脱峰。

[0079] 第五步，抗菌肽的ESI-MS质谱鉴定(以34号样品为例)。称量一定量干燥后的多肽，溶于甲醇，样品处理后以电喷雾电离负离子、多反应监测方式检测。结果如图2所示，纯化后的US34经过ESI-MS鉴定，在质谱图中显示的分子量测定值(1641.6KD)与多肽序列计算出的理论值(1641.9KD)一致，说明纯化后的多肽即为US34。

[0080] 第六步，抗菌肽的RP-HPLC分析(以34号样品为例)。称量一定量干燥后的多肽，溶于0.1％三氟乙酸，样品处理后经反向色谱柱梯度分析(洗脱液为含0.1％三氟乙酸的20％-80％的乙腈)，计算多肽纯品的纯度。结果如图3所示，纯化后的US34经过RP-HPLC分析，在色谱图中显示其纯度为98.11％，明显达到95％以上。

[0081] 第七步，抗菌肽的分子内环化(以32号样品为例)。用去离子水(pH 6.5-8.5)溶解多肽，使多肽浓度为0.01-0.1mg/ml；持续在反应的溶液中通空气；每隔3h用HPLC检测多肽链的氧化进程。图4中，A、B、C分别为32号样品氧化前、中、后的色谱图结果，从中可以看出，随着空气氧化时间的延长，32号样品中氧化峰面积逐渐增高，还原峰面积逐渐降低，说明环化多肽的含量逐渐增多。当样品大部分氧化完时(反应时间约24h)，终止反应。图5所示，上面的图为氧化前US32的色谱图和质谱图；下面的图为氧化后DS32的色谱图和质谱图。从图中可以看出，氧化前、后，经纯化的32号样品的纯度分别为96.27％和96.04％，均达到95％以上。氧化前、后US32和DS32的分子量分别为1495.0KD和1493.0KD，仅相差
2，表明正确形成分子内二硫键。

[0082] 第八步，环化后多肽的RP-HPLC纯化(以34号样品为例)。称量一定量干燥后的多肽，溶于0.1％三氟乙酸，样品处理后经反向柱梯度分离(洗脱液为含0.1％三氟乙酸的20％-80％的乙腈)，收集洗脱峰。

[0083] 第九步，环化后多肽的ESI-MS质谱鉴定(以34号样品为例)。称量一定量干燥后的多肽，溶于甲醇，样品处理后以电喷雾电离负离子、多反应监测方式检测。结果如图6所示，纯化后的DS34经过ESI-MS鉴定，在质谱图中显示的分子量测定值(1640.0KD)与多肽序列计算出的理论值(1639.9KD)一致，说明纯化后的多肽即为DS34。

[0084] 第十步，环化后多肽的RP-HPLC分析(以34号样品为例)。称量一定量干燥后的多肽，溶于0.1％三氟乙酸，样品处理后经反向柱梯度分析(洗脱液为含0.1％三氟乙酸的20％-80％的乙腈)，计算多肽纯品的纯度。结果如图7所示，纯化后的DS34经过RP-HPLC分析，在色谱图中显示其纯度为97.28％，明显达到95％以上。

[0085] 实施例2 抗菌肽杀菌曲线的测定。

[0086] 第一步，取无菌锥形瓶4个，分别标记为“生长对照管、药物1、药物2和药物3(阳性对照药)”。每瓶分别加入6ml营养肉汤。

[0087] 第二步，在各锥形瓶中分别加入定量的测试药物，其含量为6MIC浓度，生长对照组加同等体积的去离子水。

[0088] 第三步，在各锥形瓶中加入60μl浓度为0.5麦氏比浊标准的待测菌液，各管菌液6
的最终浓度约为10CFU/ml。

[0089] 第四步，加菌后立即将4个锥形瓶均匀涡旋15s，10倍比连续稀释1000倍后，分别取0.1ml菌液接种于M-H琼脂平板上(各接种两份)，用L型玻棒均匀涂布接种，35℃孵育过夜后做菌落计数，并取其平均数。

[0090] 第五步，37℃分别培养0.5，1，2，4，6h后，将4个锥形瓶均匀涡旋15s，同上法10倍0 7
比连续稀释10 ～10 倍后，分别取0.1ml菌液接种于M-H琼脂平板上(各接种三份)，35℃孵育过夜后，取菌落数在30-300之间的平板计数，并取其平均数。

[0091] 第六步，CFU＝三块板的菌落平均数×稀释倍数，即为原液中每毫升菌液中的活菌数。肉眼计数不同时间点的菌落，并求其平均值，从而在对数坐标纸绘制不同时间点的杀菌曲线图。

[0092] 结果如图8所示，可以看出，与对照组相比，DS34作用后的MRSE的生长受到明显的抑制。随着作用时间的延长，DS34组的MRSE的菌落数逐渐减少；头孢他啶组MRSE的菌落数逐渐增多，但比空白对照组少；氨苄西林组MRSE的生长与空白对照组相比没有明显的差异。说明DS34对MRSE有快速、明显的杀灭作用，而MRSE对头孢他啶和氨苄西林都产生了严重的耐药。

[0093] 实施例3 抗菌肽浓度效应关系的测定。

[0094] 第一步，取无菌试管5个，分别标记为“生长对照管、高浓度药物、中浓度药物、低浓度药物和氨苄西林组”。

[0095] 第二步，在各锥形瓶中分别加入1ml的不同浓度的药物，生长对照组加同等体积的去离子水。

[0096] 第三步，在各锥形瓶中加入1ml浓度为0.5麦氏比浊标准的待测菌液，各管菌液的7
最终浓度约为5×10CFU/ml。

[0097] 第四步，37℃培养1h后，将5个试管均匀涡旋15s，10倍比连续稀释100～107倍后，分别取0.1ml菌液接种于M-H琼脂平板上(各接种三份)，35℃孵育过夜后，取菌落数在30-300之间的平板计数，并取其平均数。

[0098] 第五步，CFU＝三块板的菌落平均数×稀释倍数，即为原液中每毫升菌液中的活菌数。肉眼计数不同浓度组的菌落，并求其平均值，从而在对数坐标纸上绘制不同药物浓度的效应曲线。

[0099] 结果如图9所示，可以看出，DS34三个剂量组(4、12和24μg/ml)MRSE的CFU都减少了一到两个数量级，减少率都高达95％以上(P＜0.01)；随着DS34浓度的增加，MRSE的CFU减少越明显。而氨苄西林组(氨苄西林)MRSE的CFU与空白对照组相比无显著性的减少(P＞0.05)，没有统计学差异。实验结果表明DS34对MRSE有明显的杀灭作用，且具有剂量依赖关系；而氨苄西林对MRSE没有杀灭作用。

[0100] 实施例4 抗菌肽的溶血毒性的测定。

[0101] 第一步，取抗凝的新鲜人外周血，3000r/min离心10min，分层后吸取下层的血细胞，加入0.01M PBS缓冲液重悬、洗涤以去除血浆和棕黄色血膜层，重复3次，最后重悬于不同体积的0.01M PBS中，得到4％和20％的红细胞悬液。

[0102] 第二步，取100μl重悬的红细胞和100μl二倍梯度稀释的抗菌肽(红细胞终浓度为2％和10％)，在37℃的孵箱中孵育。

[0103] 第三步，1h后，将反应液离心，540nm处测其光密度值。

[0104] 第四步，红细胞悬液与等体积0.01M PBS孵育的OD540作为0％溶血，与等体积Triton-100(终浓度1％)孵育的OD540100％对照。以抗菌肽浓度为横坐标，ΔOD％为纵坐标绘制曲线，求得50％溶血的抗菌肽浓度HC50。

[0105] 结果如图10所示，可以看出，抗菌肽DS34和Melittin与人红细胞悬液(终浓度为2％和10％)共孵育1、3、6h后，DS34在128μg/ml时均没有发生溶血，而Melittin在2.5μg/ml时(人红细胞悬液终浓度为2％)，就发生明显的溶血反应。DS34的HC50远高于阳性对照抗菌肽Melittin。

[0106] 实施例5 抗菌肽的50％血浆稳定性测定。

[0107] 第一步，取抗凝的新鲜人外周血，3000r/min离心10min，分层后吸取上层血浆，冻于-20℃。试验前用0.01M PBS稀释为50％的血浆。

[0108] 第二步，抗菌药物与0.5ml 50％血浆在37℃分别孵育0、3、6h，抗菌药物的浓度为64MIC。

[0109] 第三步，检测与血浆共孵育的药物的MIC。与生长对照孔中细菌生长特性相比较，无肉眼可见生长的最低药物浓度为测定药物对检测菌的MIC。

[0110] 1)抗菌药物的梯度稀释方法：称取2mg抗菌药物加入1ml稀释液中混匀，药物原液浓度为2mg/ml。原液稀释好以后用过滤法除菌，小量分装备用。原液在-20℃以下可保存3个月，但在4℃下只能保存一周。512μl原液加入488μl M-H肉汤培养基中，混合后抗菌药物的最高浓度为2048μg/ml。吸取100μl最高浓度的药物加入每排第1号孔内，1号孔经混合后吸出100μl，加入2号内，依次倍比稀释至10号后，吸出100μl弃去，这样药物的梯度浓度依次为1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2μg/ml。

[0111] 2)检测菌和标准菌的准备：取冻存于-20℃的检测菌，划线接种于M-H琼脂培养基，在孵箱(35±2℃)中孵育20～24h。次日挑取单克隆菌落，接种于2ml营养肉汤中，180rpm、37℃摇菌过夜。处于对数生长期的细菌菌液，用M-H肉汤培养基校正浓度至0.5麦
6
氏比浊标准，再用M-H肉汤1∶100稀释(含菌量约10CFU/ml)。稀释后的菌液应在15min内接种。标准菌大肠埃希菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC29213的准备过程同上。

[0112] 3)检测菌和标准菌的接种：用微量加样器取100μl稀释后的菌液依次加到96孔5
板中，最终接种细菌浓度为每孔5×10/ml。这时从第1孔到第10孔药物的浓度依次为512、
256、128、64、32、16、8、4、2、1μg/ml。将96孔板置微型振荡器上振荡1min，使各孔内菌液混匀，微孔板加盖以减少孵育过程中的蒸发，并置湿盒内35℃孵育16～20h。同时每组设无药生长对照孔(即第11孔内只加100μl M-H肉汤和100μl复苏后的菌液，不加药物)和无菌对照孔(即第12孔内只加200μl M-H肉汤)。

[0113] 4)结果判断：无菌对照孔在整个试验过程中应始终保持清亮，表明整个实验是无菌操作。与生长对照孔中细菌生长特性(如微孔内肉汤呈混浊状，孔底出现沉淀等)相比较进行判断，无肉眼可见生长的最低药物浓度为测定药物对检测菌的MIC。

[0114] 结果如图11所示，可以看出，DS34与50％血浆孵育后，MIC值不变，表明DS34在血浆中稳定；S4(1-16)与血浆孵育后MIC明显增高，说明它在血浆中被降解。

[0115] 实施例6 抗菌肽的耐药性测定。

[0116] 第一步，测定抗菌药物对MRSE的MIC值，方法同上。

[0117] 第二步，稀释上面1/2MIC孔内的细菌，使其浓度为5×105CFU/ml，此为次代培养的细菌。再次测定抗菌药物对MRSE的MIC值，方法同上。

[0118] 第三步，连续15天，每天测定一次抗菌药物对MRSE的MIC值，方法如上。

[0119] 第四步，计算抗菌药物对15代培养细菌的MIC与第1代培养细菌的MIC的相对值。

[0120] 结果如图12所示，可以看出，MRSE与抗菌药物Erythromycin(红霉素)、Ceftriaxone(头孢曲松)、苯唑西林(Oxacillin)和DS34共孵育，连续15代培养的MIC与第1代培养的MIC的相对值分别是100、10、10和1。表明MRSE容易对抗生素产生耐药性，不容易对DS34产生耐药性。