一种猪胃蛋白酶的提取方法

摘要

本发明涉及一种猪胃蛋白酶的提取方法。该方法包括下列步骤：选择成年猪胃，剥取猪胃基底部粘膜厚约2～3mm，绞碎，在绞碎的粘膜内加入1∶2～4倍的pH 2.5的盐酸浸提液，加入浓度为5mg/mL～15mg/mL的吐温-80，之后将上述混合液放在超声波药品处理机内利用超声波在冰浴中处理，超声波功率为220±20W～320±20W，超声波频率为23kHz～43kHz，超声波处理时间为90s～150s，然后立即转移到45℃的水浴中浸提58min，离心取上清液即得到蛋白酶。该超声辅助酸法提取猪胃蛋白酶的最高比活力达5.82U/mg，传统的酸法浸提比活力仅为3.5U/mg，浸提时间减少1.5h左右。

权利要求

1.一种猪胃蛋白酶的提取方法，包括下列步骤：选择成年猪胃，剥取猪胃基底部粘膜厚2～3mm，绞碎，在绞碎的粘膜内加入pH 2.5的盐酸浸提液，粘膜与盐酸浸提液的质量体积比为1∶2～4，加入浓度为5mg/mL～15mg/mL的吐温-80，之后将上述混合液放在超声波药品处理机内利用超声波在冰浴中处理，超声波功率为220±20W～320±20W，超声波频率为23kHz～43kHz，超声波处理时间为90s～150s，然后立即转移到45℃的水浴中浸提

58min，离心取上清液即得到蛋白酶。

2.根据权利要求1所述的猪胃蛋白酶的提取方法，其特征在于：绞肉机绞碎至0.2～

0.3mm。

3.根据权利要求1所述的猪胃蛋白酶的提取方法，其特征在于：超声波功率为220W、超声频率为27kHz、超声时间为111s、粘膜与盐酸浸提液的质量体积比为1∶3.5、吐温-80的添加浓度为11mg/mL。

说明书

一种猪胃蛋白酶的提取方法

技术领域：

[0001] 本发明涉及一种猪胃蛋白酶的提取方法。背景技术：

[0002] 胃蛋白酶(pepsin)属于天冬氨酸蛋白水解酶，是胃消化蛋白水解酶类，其前体物质是胃蛋白酶原。胃蛋白酶原合成于脊椎动物的胃基底部粘膜，在胃液的酸性条件下
转化成胃蛋白酶。目前，国内外市场上的胃蛋白酶主要提取于猪胃粘膜，猪胃蛋白酶(EC
3.4.23.1)的分子量为31～36ku。我国对猪胃蛋白酶的提取方法主要是应用传统的酸法
提取配合有机溶剂分离，粗酶液再经乙醚脱脂、浓缩干燥，得到的产品酶活力仅为1948.5U，
而且此法生产周期长，生产技术参数不宜把握，得到的猪胃蛋白酶活力低且不稳定。国外对
猪胃蛋白酶的提取是将酸法制备的粗提液通过有机溶剂和盐析沉淀，最终得到了商业结晶
胃蛋白酶。但此工艺耗时较长，提取率也相对较低。
发明内容：

[0003] 为了解决背景技术中的问题，本发明目的是提供一种猪胃蛋白酶的提取方法，该超声辅助酸法提取猪胃蛋白酶的最高比活力达5.82U/mg，传统的酸法浸提比活力仅
为3.5U/mg，超声辅助酸提法较酸法提取猪胃蛋白酶的比活力提高近70％，浸提时间减少
1.5h左右，超声波辅助酸法提取猪胃蛋白酶优于传统的酸法浸提。

[0004] 本发明的技术方案是：该猪胃蛋白酶的提取方法包括下列步骤：选择成年猪胃，剥取猪胃基底部粘膜厚约2～3mm，绞碎，在绞碎的粘膜内加入1∶2～4(质量与体积比)
倍的pH 2.5的盐酸浸提液，加入浓度为5mg/mL～15mg/mL的吐温-80，之后将上述混合液
放在超声波药品处理机内利用超声波在冰浴中处理，超声波功率为220±20W～320±20W，
超声波频率为23kHz～43kHz，超声波处理时间为90s～150s，然后立即转移到45℃的水浴
中浸提58min，离心取上清液即得到蛋白酶。

[0005] 上述的绞肉机绞碎至0.2～0.3mm；超声波功率为220W、超声频率为27kHz、超声时间为111s、粘膜与盐酸浸提液的质量体积比为1∶3.5、吐温-80的添加浓度为11mg/
mL。。

[0006] 本发明具有如下有益效果：本发明采用超声波作为一种辅助提取手段，超声波不仅能通过空化作用产生的极大压力造成被破碎物细胞壁破裂，使胞内物质释放、扩散及溶
解，而且能够使酶分子的构象发生正向转化，从而提高酶的活性。由于猪胃蛋白酶是在胃基
底细胞内合成并在细胞内行使功能的，一旦脱离其原来的生存环境，其分子构象、反应活性
就与在细胞内时不完全相同。因此，本实验将现代超声技术应用到猪胃蛋白酶的提取工艺
中，并与传统的酸法及碱法浸提进行比较对照，超声辅助酸法提取猪胃蛋白酶的最高比活
力达5.82U/mg，传统的酸法浸提比活力仅为3.5U/mg，超声辅助酸提法较酸法提取猪胃蛋
白酶的比活力提高近70％，浸提时间减少1.5h左右，超声波辅助酸法提取猪胃蛋白酶优于
传统的酸法浸提。
附图说明：

[0007] 附图1是牛血清白蛋白标准曲线；

[0008] 附图2是酪氨酸浓度变化标准曲线；

[0009] 附图3是超声频率对猪胃蛋白酶比活力的影响关系曲线；

[0010] 附图4是超声辅助浸提时间对猪胃蛋白酶比活力的影响曲线；

[0011] 附图5是不同料液比对超声辅助比活力的影响曲线；

[0012] 附图6是不同吐温-80添加量对超声辅助浸提猪胃蛋白酶比活力的影响曲线；

[0013] 附图7是超声辅助与酸提法猪胃蛋白酶比活力的对照实验结果。具体实施方式：

[0014] 下面结合实验对本发明作进一步说明：

[0015] 实验材料：

[0016] 猪胃粘膜.

[0017] 试剂：

[0018] 实验中主要试剂见表1。

[0019] 主要试剂 表1

[0020]序号 试剂名称 规格 成产厂家
1 标准牛血清蛋白(BSA) BR 美国Sigma公司
2 氯化钠 AR 沈阳华东试剂厂
3 磷酸氢二纳 AR 沈阳市华东试剂厂
4 磷酸二氢钾 AR 天津市大茂化学试剂厂
5 乙酸 AR 天津市科密欧化学试剂开发中心
6 氢氧化钠 AR 沈阳新兴试剂厂
7 硫酸铵 AR 北京北化精细化学品有限公司
8 无水碳酸钠 AR 天津市红岩化学试剂厂
9 钨酸钠 AR 天津大茂化学试剂厂
10 硫酸铜 AR 天津市大茂化学试剂厂
11 钼酸钠 AR 天津市大茂化学试剂厂
12 EDTA AR 上海润丰化工有限公司
13 氯化钡 AR 安徽省肖县化学试剂厂
14 浓盐酸 AR 沈阳市华东试剂厂
15 磷酸 AR 沈阳市华东试剂厂
16 硝酸银 AR 天津市福晨化学试剂厂
17 无水乙醇 AR 天津市科密欧化学试剂开发中心
18 三氯醋酸 AR 天津市科密欧化学试剂开发中心
19 乳酸 AR 天津市科密欧化学试剂开发中心
20 乳酸钠 AR 天津市科密欧化学试剂开发中心
21 考马斯亮蓝G-250 UP 北京索莱宝科技有限公司
22 酪蛋白 UV Sigma
23 吐温-80 AR 沈阳市东华试剂厂
24 酪氨酸 UV Sigma

[0021] 仪器设备：

[0022] 实验中所用仪器设备见表2所示。

[0023] 主要仪器设备 表2

[0024]

[0025] 试剂的配制：

[0026] 1moL/L盐酸溶液的配制：量取8.6mL的浓盐酸，加蒸馏水定容至100mL，即为1moL/L盐酸溶液。

[0027] 0.4moL/L三氯醋酸溶液的配制：称取三氯醋酸65.4g，用蒸馏水定容至1000mL，即为0.4moL/L三氯醋酸溶液。

[0028] 0.4moL/L碳酸钠溶液的配制：

[0029] 称取无水碳酸钠42.4g，定容至1000mL，即为0.4moL/L碳酸钠溶液的配制。0.05moL/L pH2.5乳酸-乳酸钠缓冲溶液的配制：A液：称取10.6g 80％～90％的乳酸加蒸
馏水定容至1000mL，即为A液。B液：称取16.0g 70％的乳酸钠加蒸馏水定容至1000mL，即
为B液。取A液16mL，B液1mL稀释1倍即成0.05moL/L pH2.5乳酸-乳酸钠缓冲溶液。

[0030] 2％的酪蛋白底物的配制：

[0031] 准确称取酪蛋白2.000g，加2～3滴乳酸润湿，用玻璃棒碾碎。再加入90mL乳酸缓冲溶液，磁力加热搅拌直至完全溶解。调节pH至2.5，加乳酸缓冲溶液定容至100mL，即
为2％的酪蛋白底物。储存在4℃冰箱内，有效期3d。

[0032] 福林-酚试剂乙的配制：

[0033] 100gNa2WO4·2H2O，25gNa2MoO4·2H2O，700mL水，加50mL85％的磷酸，100mL浓盐酸加热回流10h，再加150g硫酸锂，待其溶解后，加水50mL并带有数滴溴水，开水煮沸15min，
冷却后加水定容至1000mL，即为福林-酚试剂乙，在4℃下可保存一年。

[0034] 考马斯亮蓝染色液的配制：

[0035] 准确称取考马斯亮蓝G-250100mg溶于50mL 95％的乙醇，加入100mL 85％的磷酸，用蒸馏水定容至1000mL，滤纸过滤。最终试剂中含0.01％(W/V)考马斯亮蓝G-250，
4.7％(W/V)乙醇，8.5％(W/V)的H3PO4。

[0036] 0.15moL/L NaCl溶液的配制：

[0037] 准确称取NaCl 8.85g，用蒸馏水定容至1000mL，即0.15moL/LNaCl溶液。

[0038] 标准牛血清蛋白溶液的配制：

[0039] 纯的牛血清蛋白，预先用微量凯氏定氮法测定蛋白含氮量，根据其纯度，准确称取0.100g的牛血清蛋白，用0.15moL/L NaCl配成100μg/mL蛋白溶液

[0040] 100μg/mL的酪氨酸溶液的配制：

[0041] 精确称取预先于105℃干燥2～3h的酪氨酸0.100g，逐步加入1moL/LHCl 6mL溶解，用0.2moL/L的盐酸定容至100mL，即得1mg/mL的酪氨酸溶液。取此浓溶液10mL，用
0.2mol/L的盐酸定容至100mL，即成100μg/mL的酪氨酸溶液，此溶液配成后应及时使用或
放入冰箱内保存(保质期为3天)。

[0042] pH2.5的盐酸溶液的配制：

[0043] 量取4.0mL的浓盐酸，缓慢加入到100mL去离子水中，搅拌均匀，用酸度计测定其pH，并使用去离子水调pH至2.5。

[0044] 检测方法：

[0045] pH值的测定：用PB-10型酸度计直接测定。

[0046] (一)、蛋白含量的测定：

[0047] 采用考马斯亮蓝法进行测定。考马斯亮蓝G-250是一种甲基取代的三苯基甲烷，分子中含有磺酸基的蓝色染料，在465nm处有最大吸收值。考马斯亮蓝G-250能与蛋白质
通过范德华力相互作用形成蛋白质——考马斯亮蓝复合物蓝色溶液，引起该染料的最大吸
收波长的位置发生红移，在595nm处有最大吸收值。由于蛋白质——考马斯亮蓝复合物在
595nm处的光吸收远高于考马斯亮蓝在465nm处的光吸收，因此，可大大的提高蛋白质的测
定灵敏度。蛋白质——考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。利用溶
液的颜色差异进行比色测定，适合于蛋白质类的定量分析，尤其适合于稀有蛋白质的微量
分析。考马斯亮蓝G-250试剂呈色反应颜色稳定、灵敏度高，最低测试蛋白质量在1μg作
用。

[0048] (1)蛋白标准曲线的绘制：

[0049] 取21支试管分成三组编号(即三组平行样)，按标准曲线制备表3依次加入各管中，再按照空白标准操作法操作。分别加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL标准蛋白质溶
-1
液(浓度为100μg·mL )。用0.15moL/L NaCl补足至1.0mL，然后每支试管加入5mL考马
斯亮蓝试剂，立即混匀，1h内以1号管为空白对照，在波长595nm处比色。取三组平行样的
平均值。以吸光光度值(OD)为横坐标，标准牛血清白蛋白浓度为纵坐标，绘制标准曲线，作
为定量分析的依据。

[0050] 按照上述“蛋白标准曲线的绘制”方法测得的数据如表3。

[0051] 蛋白标准曲线数据 表3

[0052]名称 1 2 3 4 5 6 7
BSA/μg·mL-1 0 10 20 30 40 50 60
吸光光度值(OD)1 0 0.075 0.181 0.262 0.303 0.394 0.423
吸光光度值(OD)2 0 0.075 0.180 0.264 0.302 0.390 0.424
吸光光度值(OD)3 0 0.075 0.182 0.266 0.304 0.389 0.425

[0053] 由表3可得拟合后牛血清白蛋白的回归方程：y＝135.88x-1.7775，R值为0.9818，所做曲线相关性良好，以蛋白含量为纵坐标，OD值为横坐标，绘制标准曲线，标准蛋
白曲线见图1。将样品的OD值(方法同标准蛋白测定)即x代入标准曲线方程，求出y，即
得到样品中的蛋白含量，此曲线作为猪胃蛋白酶定量分析的依据。

[0054] (2)、蛋白含量的测定与计算：

[0055] 取一定量的样品，用0.15moL/L NaCl配成100mL样品溶液。取四支试管，其中一支加入0.15moL/L NaCl溶液1mL(空白对照)，另三支中加入样品1mL，然后每支试管加入
5mL考马斯亮蓝试剂，立即混匀，1h内以1号管为空白对照，在波长595nm处比色，并通过标
准曲线确定蛋白含量。

[0056] (二)、猪胃蛋白酶活力测定：

[0057] 采用酸性蛋白酶的测定方法，用干酪素作为底物。测定原理是：蛋白酶在一定温度和pH条件下，水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸(如酪氨酸等)。在碱性条件下，含有酚
基的氨基酸可以将福林试剂还原，生成钼蓝和钨蓝，用分光光度计测定反应液的颜色强度，
对照标准曲线计算酪氨酸的产生量和酶活力。此法用于监测生产过程中间产品的粗测、研
究提取和分离情况。

[0058] 标准曲线的绘制。取7支试管编号，按表4分别吸取不同浓度的酪氨酸1mL，各加入0.4moL/L的碳酸钠5mL，再加入稀的福林试剂1mL。摇匀置于水浴锅中40℃保温发色
20min，应用722-型分光光度计，在波长660nm处测定OD值，用0.2moL/L盐酸调整零点。按
照“猪胃蛋白酶活性测定”方法测得的数据如表4。

[0059] 不同浓度酪氨酸OD值结果表 表4

[0060]试剂 管1 管2 管3 管4 管5 管6 管7
按表2-4制备的不同浓度的酪氨酸mL 1 1 1 1 1 1 1
0.4moL/L碳酸钠mL 5 5 5 5 5 5 5
福林试剂mL 1 1 1 1 1 1 1
1 0.041 0.149 0.256 0.366 0.459 0.563 0.652
OD值 2 0.046 0.143 0.258 0.358 0.462 0.566 0.651
3 0.046 0.159 0.261 0.365 0.462 0.569 0.653
4 0.044 0.150 0.258 0.363 0.461 0.566 0.652
净OD值 0.000 0.106 0.214 0.319 0.417 0.522 0.608

[0061] 由表4可得拟合后酪氨酸浓度的回归方程：y＝97.853x-0.558，R值为0.9991，所做曲线相关性良好，以蛋白含量为纵坐标，OD值为横坐标，绘制标准曲线见图2。测定样品
的OD值(方法同猪胃蛋白酶活性测定)即x代入标准曲线方程，求出y，即得到样品的活
性，此曲线作为猪胃蛋白酶定量分析的依据。

[0062] (三)、比活力计算：

[0063] 通过猪胃蛋白酶的活力和蛋白酶含量，计算比活力；计算公式如下：

[0064] 猪胃蛋白酶比活力/U·mg-1＝猪胃蛋白酶的活力/蛋白含量

[0065] (四)、超声辅助酸提法与传统酸法、碱法浸提对照试验：

[0066] (1)原料的预处理：

[0067] 选择成年猪胃，剥取猪胃基底部粘膜厚约2～3mm，绞碎冷冻备用。

[0068] (2)超声辅助酸提法：

[0069] 准确称取处理后的猪胃粘膜500g，加入1750mL pH 2.5的盐酸浸提液，将其中一组样品在超声波下处理，超声波处理在冰浴-4℃-0℃中进行，声强为220W、超声功率为
33kHz、超声处理时间为120s、吐温-80的添加量为11mg/mL，每1mL上述粗提液加入11mg
吐温-80，然后立即转移到45℃的水浴中浸提，分别在30min、45min、60min、75min、90min、
105min、120min测定上清液酶活、蛋白含量，计算比活力。

[0070] (3)酸法浸提：

[0071] 准确称取处理后的猪胃粘膜500g，加入1750mL pH 2.5的盐酸浸提液，于45℃的水浴中浸提，分别在30min、45min、60min、75min、90min、105min、120min、135min、150min、
160min测定上清液酶活、蛋白含量，计算比活力。

[0072] (4)碱法浸提：

[0073] 猪胃蛋白酶的前体是猪胃蛋白酶原，存在于猪胃基底主细胞中。采用0.5mol/LpH7.3磷酸盐碱性缓冲溶液对处理后的猪胃粘膜匀浆，低温浸提12h，过滤，将滤饼再次用
1/4体积的0.5mol/L pH7.3的磷酸盐缓冲溶液二次浸提4h，过滤合并滤液，用盐酸溶液调
pH2.5左右将猪胃蛋白酶原激活(在此pH条件下，酶原自动转化成猪胃蛋白酶)，测定其比
活力。

[0074] 将超声辅助酸提法与酸法、碱法浸提得到的猪胃蛋白酶比活力进行对比，选择比活力最高的作为猪胃蛋白酶的最佳提取方法。

[0075] (五)、超声辅助酸提法的单因素试验：

[0076] 影响超声辅助酸提法效果的主要因素有超声输出功率、超声频率、超声处理时间、料液比、保护剂吐温-80的添加量。故试验中以猪胃蛋白酶比活力为指标，选取这五个因素
进行单因素试验，每组试验设置三个平行样，对实验数据进行One-Way-ANOVA单因素方差
分析以及Duncan分析。

[0077] (1)不同超声波输出功率对猪胃蛋白酶比活力影响的单因素试验：

[0078] 准确称取两组处理后的猪胃基底部粘膜各500g，加入pH2.5左右盐酸溶液，将超声波输出功率分别设定在强(320±20W)、弱(220±20W)两个水平，频率设定在30kHz，超声
处理时间为120s，料液比为1∶2，吐温-80的添加量为10mg/mL，测定提取液的猪胃蛋白酶
活力及蛋白含量，计算比活力，研究不同超声波输出功率对猪胃蛋白酶比活力的影响，确定
超声波输出功率优化实验的范围。

[0079] 不同超声功率对猪胃蛋白酶比活力的影响结果：

[0080] 超声功率对猪胃蛋白酶比活力的影响结果见表5。在超声波输出功率为220W左右时，猪胃蛋白酶的比活力普遍高于超声波输出功率为320W时的比活力。一般情况，较低强
度的超声作用可以产生稳态空化作用，这种空化作用较为缓和且有规律，形成的空化泡能
够使其周围的酶分子受到微流产生的切力的作用，这也许对疏通酶内外扩散的传质通道有
利；而较高强度的超声则会产生瞬态空化作用，瞬态空化作用激烈而短暂，当瞬态空化产生
的空化泡崩裂时，会产生5000℃以上的高温和50000kPa的高压，导致大量自由基的产生，
同时在均相液体介质中伴有强大的冲击波，在非均相介质中伴有射流。高能量的自由基将
直接攻击酶分子，使酶分子内部化学键发生断裂，导致酶分子活性下降甚至失活。而酶分子
在强大的冲击波或射流的作用下，分子结构容易被破坏甚至被剪切成小碎片而表现出活力
下降甚至失活。

[0081] 超声波输出功率对猪胃蛋白酶比活力的影响 表5

[0082]功率 y1 y2 y3
320±20 1.987 2.020 1.994
220±20 3.172 3.123 5.098

[0083] 当处于低超声波输出功率时，不断溶出的猪胃蛋白酶分子的构象发生正向转化，加速酶转化反应，从而提高了酶的活性；当超声功率增大时，过高的空化作用，会产生局部
高温，使酶分子失活，不利提取，故本实验确定将超声波输出功率220±20W作为固定化因
素，进行下一步工艺条件的优化。

[0084] (2)不同超声频率对猪胃蛋白酶比活力影响的单因素试验：

[0085] 准确称取六组处理后的猪胃基底部粘膜500g，加入pH2.5左右盐酸溶液，将超声波频率分别设定在23kHz、33kHz、43kHz、53kHz、63kHz等5个水平，超声功率为220±20W，超
声处理120s，料液比为1∶2，吐温-80的添加量为10mg/mL，测定提取液的猪胃蛋白酶比活
力及蛋白含量，计算比活力，研究不同超声频率对猪胃蛋白酶比活力的影响，确定超声频率
优化实验的范围。

[0086] 超声频率对猪胃蛋白酶比活力的影响结果：

[0087] 对超声波影响猪胃蛋白酶比活力的实验结果进行One-Way-ANOVA分析以及Duncan分析见表6，根据所得数据绘制出比活力与超声频率的关系曲线图3。

[0088] 不同超声波处理频率的方差分析及Duncan多重比较结果 表6

[0089]水
％5 平 E C A B D F

10
F＞ 00.0
rP ＜

09.
值F 476

S 321. 200.
M 1 0
f 2 7
d 5 1 1
5 0 5
SS 16.5 20.0 36.5

源来 ecr 间 内 异
异变 uoS 理处 理处 变总

均 Y 915 090 080 192 349 973
平 值 .3 .4 .5 .4 .3 .3
3 105. 001. 090. 032. 249. 543.
y 3 4 5 4 3 3
4 0 0 7 9 8
2 y 35.3 11.4 11.5 72.4 89.3 63.3

225 080 050 663 798 424
1 y .3 .4 .5 .4 .3 .3
率频 zHk 0 32 33 34 35 36

[0090] 由表6可以看出，在0kHz～63kHz超声频率的三次重复因素分析中，F值为674.9，P值小于0.0001，相关系数为0.9965，说明不同超声波处理频率对猪胃蛋白酶比活力的影
响有显著差异。在0kHz～33kHz超声处理条件下，猪胃蛋白酶的比活力不断上升，在33kHz
时猪胃蛋白酶的比活力最高，当超过33kHz时猪胃蛋白酶比活力开始呈下降趋势。

[0091] 低强度的超声波可以提高酶的活性，促进酶的催化反应。而高强度的超声波会抑制酶的活性，甚至使酶失活。据此可以认为超声波频率对酶的影响主要是由于空化作用或
温度作用引起的。

[0092] 超声辅助酸法提取猪胃蛋白酶时，当超声波的频率大于33kHz时，酶活下降较快，这因为体系热效应增加，空化作用加强，使酶失活，而在相对较低的超声功率下会促进酶促
反应的正向转化，故将超声波处理频率的范围确定在23kHz、33kHz、43kHz三个水平作为二
次回归正交旋转组合试验的范围值。

[0093] (3)、不同超声波处理时间对猪胃蛋白酶比活力影响的单因素试验：

[0094] 准确称取六组处理后的猪胃基底部粘膜各500g，加入pH2.5左右盐酸溶液，分别用超声波处理0s、30s、60s、90s、120s、150s、180s，超声功率设定为220±20W，超声频率为
33kHz，料液比为1∶2，吐温-80的添加量为10mg/mL，测定超声提取液的猪胃蛋白酶活力
及蛋白含量，计算比活力，研究不同超声辅助浸提时间对猪胃蛋白酶比活力的影响，确定超
声波处理时间优化实验的范围。

[0095] 不同超声处理时间对猪胃蛋白酶比活力的影响结果：

[0096] 对不同超声处理时间影响猪胃蛋白酶比活力的实验结果进行One-Way-ANOVA分析以及Duncan分析见表7，根据所得数据绘制出比活力与超声处理时间的关系曲线见图4。

[0097] 不同超声波处理时间的方差分析及Duncan多重比较标记结果表7

[0098]水
％5 平 G F E B A C D

1
F 000.
＞ 0
rP ＜
值 4.70
F 3
0 8
S 078. 200.
M 0 0
f 4 0
d 6 1 2
10 69 89
SS 22.5 30.0 52.5

异 源 ecru 间理 内理 异变
变 来 oS 处 处 总
均 Y 503. 815. 137. 803. 309. 302. 720.
平 值 4 4 4 5 5 5 5
13 23 94 00 52 47 98
y 3 3.4 5.4 7.4 3.5 9.5 1.5 9.4

932 424 547 673 009 212 700
y 2 .4 .4 .4 .5 .5 .5 .5
1 643. 895. 896. 742. 588. 322. 680.
y 4 4 4 5 5 5 5
S
理 间 0 0 0
处 时 0 03 06 09 21 51 81

[0099] 由表7可以看出，在不同超声浸提时间0s～180s的重复因素分析中，F值为307.4，P值小于0.0001，相关系数为0.9925，说明不同超声波处理时间对猪胃蛋白酶比活
力有显著差异。在0s～120s猪胃蛋白酶的比活力不断上升，在120s时猪胃蛋白酶的比活
力最高，当超过120s时猪胃蛋白酶比活力开始呈下降趋势。

[0100] 超声预处理可能缩短酶被激活所需的时间，并使其充分激活，加速酶反应。其作用机制是由于超声处理一方面促进了活性中心的打开，减少了酶分子被激活所需的时间，
另一方面超声预处理过程能够疏通酶分子内扩散的传质通道，有助于底物与活性位点的结
合。

[0101] 当超声波法提取猪胃蛋白酶时，酶分子在120s作用的处理时间内，酶促反应发生了正向转化，活性中心暴露，而长时间暴露会由于空化作用和过热失活，故将超声波处理时
间的范围确定在90s、120s、150s三个水平作为二次回归正交旋转组合试验范围值。

[0102] (4)不同液料比对超声波辅助浸提猪胃蛋白酶比活力影响的单因素试验：

[0103] 准确称取六组处理后的猪胃基底部粘膜各500g，分别加入pH2.5左右盐酸溶液，使其料液比为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，超声功率为220±20W，超声频率为33kHz，
吐温-80的添加量为10mg/mL，超声辅助浸提时间为120s，测定超声提取液的猪胃蛋白酶活
力及蛋白含量，计算比活力，研究不同料液比对超声辅助浸提猪胃蛋白酶比活力的影响，确
定料液比优化实验的范围。

[0104] 超声处理时不同料液比对猪胃蛋白酶比活力的影响结果：

[0105] 不同料液比影响超声辅助提取猪胃蛋白酶比活力实验结果进行One-Way-ANOVA分析以及Duncan分析见表8，根据所得数据绘制出比活力与超声处理时间的关系曲线图，
见图5。

[0106] 不同超声波处理料液比的方差分析及Duncan多重比较标记结果 表8

[0107]水
％5 平 C B B A A

10
F＞ 00.0
rP ＜

70
值F .75

5621 2200
SM .0 .0
fd 4 01 41
9 2 1
S 505. 220. 825.
S 0 0 0
来 ecr 间 内 异
异变 源 uoS 理处 理处 变总

均 Y 52 806 936 737 687
平 值 .5 3 .5 .5 .5 .5
3 982. 416. 756. 397. 477.
y 5 5 5 5 5
7 2 4 9 2
y2 91.5 26.5 76.5 27.5 28.5

472 785 585 886 807
y 1 .5 .5 .5 .5 .5
1 2 3 4 5
液 ∶ ∶ ∶ ∶ ∶
料 比 1 1 1 1 1

[0108] 由表8可以看出，在不同料液比超声处理的三次重复试验因素分析中，F值为57.07，P值小于0.0001，相关系数为0.9580，说明不同料液比超声波处理时对猪胃蛋白酶
比活力有显著差异。在料液比为[1∶1，1∶5]的范围内猪胃蛋白酶的比活力不断上升，
说明随着溶剂的量的增加，猪胃蛋白酶的溶出效果很好，但较高的料液比会影响后续纯化
工艺，故选择在粘度适中，且比活力较高的料液比(1∶2、1∶3、1∶4)作为正交实验范围
值。

[0109] (5)、不同吐温-80浓度对超声辅助提取猪胃蛋白酶比活力影响的单因素试验：

[0110] 准确称取六组处理后的猪胃基底部粘膜各500g，加入pH2.5左右盐酸浸提液，并加入不同浓度的吐温-80(0mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL)，超声功率
为220±20W，超声频率为33kHz，料液比为1∶2，超声辅助浸提时间为120s，测定超声提取
液的猪胃蛋白酶活力及蛋白含量，计算比活力。研究不同吐温-80浓度对超声辅助浸提猪
胃蛋白酶比活力的影响，确定吐温-80优化实验的范围。

[0111] 超声处理时不同吐温-80浓度对猪胃蛋白酶比活力的影响结果：

[0112] 超声处理时，不同吐温-80浓度对猪胃蛋白酶比活力的One-Way-ANOVA分析以及Duncan分析见表9，根据所得数据绘制出比活力与吐温-80浓度的关系曲线见图6。

[0113] 不同吐温-80浓度的方差分析及Duncan多重比较标记结果 表9

[0114]％5 水 平 D C B A A A

F＞ 1000.0
rP ＜

值F 8.8681
S 051. 200.
M 4 0
f 2 7
d 5 1 1
94 7 67
SS 7.02 20.0 7.02

异 源 ecru 间理 内理 异变
变 来 oS 处 处 总
9 2 0 3 4 7
均平 Y值 32.3 42.5 28.5 22.6 32.6 52.6

92 58 91 73 47 86
y 3 2.3 2.5 8.5 2.6 2.6 2.6

232 541 408 671 891 302
y 2 .3 .5 .5 .6 .6 .6
1 652. 692. 238. 752. 922. 103.
y 3 5 5 6 6 6
温 08 Lm/g 0 5 0 5
吐 - m 0 5 1 1 2 2

[0115] 由表9可以看出，在添加不同吐温-80浓度的超声辅助浸提的因素分析中，F值为1868.8，P值小于0.0001，相关系数为0.9987，说明添加不同吐温80对超声辅助浸提猪胃
蛋白酶比活力有显著差异。随着吐温-80浓度不断增加，猪胃蛋白酶的比活力也不断上升，
即吐温-80用量的增加与酶比活力的提高成正比趋势，但过量的吐温-80并不能无限提高
酶的比活力，因为当表面活性剂浓度超过其临界胶束浓度后，再增加表面活性剂浓度，只能
增加液相主体内胶束的浓度，而界面吸附量并无多大改变，此时已达到最佳乳化效果，故再
增加吐温-80对提高酶的活性无明显作用。此外，表面活性剂浓度过大时会影响酶的稳定
性，因此选择吐温-80添加量为5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL作为正交试验的范围。

[0116] 本研究也曾采用其他自由基清除剂进行对照实验，如甘露醇、己醇等，但所得猪胃蛋白酶粗提液的比活力相对较低，这一点也说明吐温-80有效的抑制了超声空化作用。吐
温-80对胃蛋白酶活有明显保护作用。

[0117] 超声辅助酸法提取猪胃蛋白酶技术参数优化结果：

[0118] 在上述单因素的基础上，进行二次回归旋转正交组合试验，以猪胃蛋白酶比活力为指标，确定超声辅助提取猪胃蛋白酶的最佳工艺条件。

[0119] 根据单因素试验所确定的水平范围，以SAS System 8.2为辅助设计手段，做四因素五水平的二次回归正交旋转组合设计试验，见表10、表11。

[0120] 试验因素水平对照表 表10

[0121]) no
08- 0 itar
温吐 8-ne tnec 5
(4X ewT noC 51 .21 01 5.7 5

)比液料(3X dilos-duqiL 4∶1 5.3∶1 3∶1 5.2∶1 2∶1

emi
T no
isuf
)间时声超( fiD cinosart 0 5 0 5
2X lU 51 31 21 01 09
yc
neuq
)率频声超( erF cinosart sevaW
1X lU fo 34 83 33 82 32
平 leve 1 2
水 L 2 1 0 - -

[0122] 二次回归正交旋转组合试验结果 表11

[0123]试验号
Test X1 X2 X3 X4 比活力
1 38 135 1∶3.5 12.5 4.789
2 38 135 1∶3.5 7.5 4.651
3 38 135 1∶2.5 12.5 4.785
4 38 135 1∶2.5 7.5 4.722
5 38 105 1∶3.5 12.5 4.954
6 38 105 1∶3.5 7.5 4.877
7 38 105 1∶2.5 12.5 4.896
8 38 105 1∶2.5 7.5 4.554
9 28 135 1∶3.5 12.5 5.298
10 28 135 1∶3.5 7.5 4.959
11 28 135 1∶3.5 12.5 5.475
12 28 135 1∶3.5 7.5 5.022
13 28 105 1∶2.5 12.5 5.286
14 28 105 1∶2.5 7.5 5.245
15 28 105 1∶2.5 12.5 5.508
16 28 105 1∶2.5 7.5 5.492
17 43 120 1∶3 12.5 4.566
18 23 120 1∶3 7.5 5.212
19 33 150 1∶3 12.5 4.964
20 33 90 1∶3 7.5 4.947
21 33 120 1∶4 12.5 5.396
22 33 120 1∶2 7.5 5.079
23 33 120 1∶3 15 5.586
24 33 120 1∶3 5 5.127
25 33 120 1∶3 10 5.561
26 33 120 1∶3 10 5.567
27 33 120 1∶3 10 5.572
28 33 120 1∶3 10 5.570
29 33 120 1∶3 10 5.569
30 33 120 1∶3 10 5.543
31 33 120 1∶3 10 5.557
32 33 120 1∶3 10 5.502
33 33 120 1∶3 10 5.566
34 33 120 1∶3 10 5.528
35 33 120 1∶3 10 5.329
36 33 120 1∶3 10 5.574

[0124] 利用实验结果和二次回归旋转组合设计统计方法分析进行编程，

[0125] Y＝-14.136115+0.283814*X1+0.172433*X2+3.603645*X3+0.020431*X4-0.006288*X1*X1+0.000917*X2*X1-0.000764*X2*X2-0.012967*X3*X1-0.014236*X3*X2-0.198399*X3*X3+0
.000691*X4*X1+0.001904*X4*X2-0.025847*X4*X3-0.007253*X4*X4

[0126] 并对结果进行分析得回归方程如下。

[0127] 回归方程各项的方差分析及回归方程的方差分析见表12。

[0128] 回归方程各项的方差分析表 表12

[0129]值P eulaV P 1000.＜ 1000.＜ 4550.0 8590.0 1000.＜

eu 1 8 4
值F laVF 0.93 1.15 05.2 82.2 8.62

era
和 uqS 4864 6526 8241 1977 2087 0810 8996
方均 naeM 51.0 62.0 00.0 10.0 00.0 10.0 98.0

s
erau
qS f 537 401 175 659 138 787 014
和方 o mu 885. 480. 251. 880. 421. 312. 528.
平 S 1 2 0 0 0 0 3
度
由自 FD 4 4 6 01 11 12 41

l
m mre mr edom
源来差 ecruoS nois mret elpmis ret citardauq t noitcaretni et tiffo kcal rorre erup rorre latot noisserger型方归 serg 项次 项次 项互 项拟 差误 差误 模归
回 eR 一 二 交 失 纯 总 回

[0130] 表12说明二次回归模型的F值为26.84，P＜0.0001，大于在0.01水平上的F值，决定系数为0.9471，而失拟项的F值为2.28，小于在0.05水平的F值，说明该模型拟合良
好。一次项、二次项、交互项的F值均大于0.01水平上的F值，说明各因素和各因素之间的
交互作用都对猪胃蛋白酶比活力都有显著的影响，各因素影响程度从大到小的依次顺序为
超声时间、超声频率、料液比、吐温-80添加量。最优提取条件见表13。

[0131] 最优提取条件 表13

[0132]因素 标准化 非标准化
Factor standardization no standardization
X1 -0.535365 27.646350
X2 -0.312169 110.634929
X3 0.490537 3.490537
X4 0.206069 11.030344

[0133] 以500g猪胃粘膜通过超声法浸提时，酶活力最高的超声条件为超声功率27kHz、超声时间111s、料液比为1∶3.5、吐温-80的添加量为11mg/mL。该条件下得到的最高比
活力为5.73U/mg。

[0134] 验证实验：

[0135] 按照优化的超声波法提取猪胃蛋白酶的提取工艺条件进行验证实验：取绞碎的猪胃粘膜500g，加入pH 2.5的盐酸溶液1750mL，220±20W、27kHz条件下超声处理111s，
45℃水浴58min，离心取上清液测酶活及蛋白酶含量，计算比活力，将统计分析处理得到的
预测值与之比较，实验结果见表14。采用优化的超声法提取猪胃蛋白酶的比活力可以达到
5.82U/mg。

[0136] 最优提取条件及猪胃蛋白酶活力 表14

[0137]比活力预测值 比活力实测值
因素 标准化 非标准化 predictive value true value of
factor standardization no standardization of Specific Specific
Activity Activity
X1 -0.535365 27.646350
X2 -0.312169 110.634929
X3 0.490537 3.490537 5.73U/mg 5.82U/mg
X4 0.206069 11.030344

[0138] 超声辅助酸提法与酸法、碱法浸提对猪胃蛋白酶比活力影响的对照试验结果：

[0139] 超声辅助酸提法与酸法浸提猪胃蛋白酶对照试验结果见图7。

[0140] 在30min～120min之间超声辅助效果较酸法浸提比活力高，超声辅助后在60min左右时，浸提液比活力出现最高峰，而未经超声辅助浸提的对照组在150min左右时，上清
液比活力才出现极值，但明显低于超声辅助浸提液的比活力，说明超声辅助酸法提取猪胃
蛋白酶优于酸法浸提。

[0141] 合适的超声条件可以使猪胃蛋白酶分子的构象发生正向转化，从而提高酶的活性。

[0142] 实验结果表明，超声辅助酸法提取猪胃蛋白酶的最高比活力达5.82U/mg，传统的酸法浸提比活力仅为3.5U/mg，超声辅助酸提法较酸法提取猪胃蛋白酶的比活力提高近
70％，浸提时间减少1.5h左右，超声波辅助酸法提取猪胃蛋白酶优于传统的酸法浸提。

[0143] 超声辅助酸提法与碱法浸提猪胃蛋白酶的对照实验结果如表15。

[0144] 超声辅助酸法提取较碱法浸提的比活力提高36.4％，浸提时间缩短近15h，实验结果还表明碱法浸提较酸法浸提得到的猪胃蛋白酶比活力要高，但浸提时间较长，采用超
声辅助酸提法有效的提高了酸法浸提猪胃蛋白酶的比活力，而且大大的缩短了浸提时间。

[0145] 超声辅助浸提与碱性缓冲溶液浸提的对照实验结果表 表15

[0146]浸提方法 超声辅助浸提 碱法浸提
比活力U/mg 5.82 3.7
浸提时间h 60min 16h

[0147] 实验通过对超声辅助酸法与酸法、碱法提取猪胃蛋白酶的对照试验，最终选用了超声辅助酸提法作为提取猪胃蛋白酶的最佳方法。通过比较分析可知：

[0148] (1)碱法浸提较酸法浸提获得的猪胃蛋白酶比活力高，但浸提时间较长，同时pH值的升高使猪胃粘膜中的碱性杂蛋白溶解，为后续分离带来不便，所以碱法不利于工业化
生产。

[0149] (2)超声辅助酸提法能够最大限度的保留猪胃蛋白酶活性，超声功率、超声频率对猪胃蛋白酶活力的影响都可以用空化作用或温度作用来解释；超声处理时间对猪胃蛋白
酶活力的影响是由于超声波处理促进了活性中心的打开，减少了酶分子被激活的时间；而
超声处理时料液比对猪胃蛋白酶活力的影响较小，这一点不同种类的酶的研究结果差异很
大。

[0150] 实验主要通过对猪胃蛋白酶不同提取方法比较分析，确定了超声辅助酸提法为猪胃蛋白酶的最佳提取工艺。实验以猪胃基底部粘膜为原料，猪胃蛋白酶的比活力为指标，对
影响超声辅助浸提的主要因素——超声输出功率、超声频率、超声时间、料液比、乳化剂吐
温-80添加量等条件进行优化，实验结果得出：

[0151] (1)超声辅助酸法提取猪胃蛋白酶较传统碱法浸提猪胃蛋白酶时间缩短近15倍，比活力提高36.4％，较酸法浸提猪胃蛋白酶浸提时间缩短1.5h，比活力提高近70％。

[0152] (2)超声辅助提取猪胃蛋白酶的最佳工艺参数为：超声输出功率220W±20W、超声频率27kHz、超声处理时间111s、料液比1∶3.5、吐温-80的浓度11mg/mL，在此工艺条件
下，可制得猪胃蛋白酶的比活力5.82U/mg，高于酸法、碱法提取得到的猪胃蛋白酶的比活
力。