固定化扩展青霉脂肪酶催化合成糖苷酯类化合物的方法转让专利
申请号 : CN200910041702.3
文献号 : CN101624612B
文献日 : 2012-03-07
发明人 : 李宁 , 杨荣玲 , 吴虹 , 宗敏华
申请人 : 华南理工大学
摘要 :
本发明公开了一种固定化扩展青霉脂肪酶催化合成糖苷酯类化合物的方法。该方法是在非水介质中，加入摩尔比1∶1～20∶1的糖苷和酰基供体，糖苷的浓度为1～40mg/mL；加入与糖苷的质量比为10∶1～1∶10的固定化扩展青霉脂肪酶，在温度30～60℃、振荡速度100～300rpm和常压条件下，转酯化反应0.5～72小时，得到糖苷酯类化合物。该化合物具有如下通式(I)的结构。本发明选用一种价格低廉的固定化扩展青霉脂肪酶制剂进行转酯化反应合成糖苷的酯类化合物，不但收率高达85％～98％，且成本大大降低。本发明具有反应条件温和、环境友好、区域选择性高、反应过程简单可控、产物易分离和成本低的优点。
权利要求 :
1.一种固定化扩展青霉(Penicillium expansum)脂肪酶催化合成糖苷酯类化合物的方法，其特征在于包括以下操作步骤：在非水介质中，加入摩尔比为1∶1～20∶1的酰基供体和糖苷，得到溶液，该溶液中糖苷的浓度为1～40mg/mL；加入与糖苷的质量比为
10∶1～1∶10的固定化扩展青霉脂肪酶，在温度为30～60℃、振荡速度为100～300rpm和常压条件下，转酯化反应0.5～72小时，得到糖苷酯类化合物；
所述酰基供体为羧酸乙烯酯或丁酸酐；
所述糖苷为熊果苷、天麻苷、葡萄糖豆腐果苷、高熊果苷、异高熊果苷或水杨醛-β-D-葡萄糖苷；
所述非水介质为非质子有机溶剂中的两种，或非质子有机溶剂中的一种和含低亲核性阴离子的离子液中的一种，其中含低亲核性阴离子的离子液的体积百分含量为5～95％；
所述非质子有机溶剂为四氢呋喃、丙酮、乙腈、二噁烷、叔丁醇、异丙醚、异辛烷、正己烷、正庚烷、正辛烷、正壬烷或环己烷；
所述含低亲核性阴离子的离子液中的阴离子为四氟硼酸根离子、六氟磷酸根离子或二(三氟甲基磺酰)亚胺离子；阳离子为1-烷基-2，3-二甲基咪唑离子；
所述固定化扩展青霉脂肪酶的制备包括以下操作步骤：
(1)将含有质量百分数为95％淀粉的扩展青霉脂肪酶粗酶粉溶于甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中，配制成每毫升缓冲液含有0.3g脂肪酶粗酶粉的悬浮液，在温度35℃和转速150rpm条件下搅拌1h；在温度4℃和转速6000rpm条件下离心得上清液；所述甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中甘氨酸和氢氧化钠的重量比为2.9∶1；
(2)将大孔吸附树脂D4020用质量百分数为95％的乙醇浸泡后，用去离子水洗至滤液澄清，得到滤液；
(3)将步骤(2)所得滤液添加到步骤(1)所得上清液中，加酶量为9g粗酶粉/g树脂；
在温度35℃和转速150rpm条件下搅拌4h，过滤，用甘氨酸-氢氧化钠缓冲液冲洗，抽滤后冷冻干燥，得到固定化扩展青霉脂肪酶。
说明书 :
固定化扩展青霉脂肪酶催化合成糖苷酯类化合物的方法
技术领域
[0001] 本发明属于酶化工领域，特别涉及一种利用固定化扩展青霉脂肪酶催化糖苷酰化合成糖苷酯类化合物的方法。
背景技术
[0002] 糖苷广泛存在于生物体内，其中很多糖苷因具有特殊的生物活性而担负着重要的生物功能。许多糖苷化合物，如天麻苷、熊果苷、葡萄糖豆腐果苷、高熊果苷、异高熊果苷、水杨醛-β-D-葡萄糖苷等，由于具有特定的药用价值(例如抗肿瘤、抗微生物、降血脂、抗氧化、提高机体免疫功能、镇静安眠等)而引起了人们的关注。糖苷化合物是一类活泼的化合物，结构上存在着多个羟基，可以与其它不同结构的化合物相连接，当糖环的羟基连接上脂肪族或芳香族酰基时，可以增强化合物的脂溶性，从而改善其在细胞和肠内的吸收，提高其口服生物利用度，增强药效。因此，对该类化合物的合成及修饰则成为糖苷类药物的一个主要研究方向。熊果苷除了具有抗菌、镇咳、降血糖等多种药理作用外，还是人黑色素细胞中酪氨酸酶的抑制剂，能阻断多巴以及多巴醌的合成，从而有效地抑制黑色素的生成，具有美白作用，且对皮肤没有刺激性，毒副作用小。然而在使用过程中，熊果苷存在脂溶性差、生物利用度低等问题。药理活性研究表明，熊果苷的碳十一烯酸和月桂酸酯衍生物均比亲代化合物表现出更高的抗酪氨酸酶和抗亚油酸氧化活性。糖苷类化合物糖环上羟基众多，且反应活性相似。采用一般化学方法直接酯化时，区域选择性低，易产生大量的副产物，产物分离困难；为合成确定位置酰化的产物，需要对糖环特定羟基进行保护和去保护等操作，反应步骤多、工艺复杂；同时该方法采用碱性催化剂，易产生含碱废液，对环境造成严重污染。而酶法合成避免了繁琐的保护和去保护等复杂的反应步骤，反应条件温和、对环境友好，所得产物纯度高。因此，酶催化糖苷区域选择性酰化是一条具有广阔前景的替代途径。曾有文献(Tokiwa et al.，Med.Chem.Lett.2007，17：3105-3108；Nakajima et al.，J.Biosci.Bioeng.1997，87：105-107；Watanabe et al.，Biochem.Eng.J.2009，
43：261-265；Chigorimbo-Murefu et al.，J.Mol.Catal.B：Enzym.，2009，56：277-282)公开了酶促熊果苷酯衍生物的合成方法，但其所用的酶制剂为价格昂贵的商品化蛋白酶或
脂肪酶，且催化效率不高。如利用枯草杆菌蛋白酶催化合成熊果苷碳十一烯酸酯，其反应时间较长，效率较低；利用来源于南极假丝酵母的脂肪酶催化熊果苷月桂酸酯和阿魏酸酯的合成，其最大转化率仅为50％；利用来源于洋葱假单胞菌的脂肪酶催化熊果苷肉桂酸
酯的合成，其收率仅为28％。基于不同来源的脂肪酶之结构与功能的差异，本发明选用价格低廉的固定化扩展青霉脂肪酶制剂催化糖苷酰化以制备糖苷酯化合物，其不但收率高
(85％-98％)，且成本大大降低。
43：261-265；Chigorimbo-Murefu et al.，J.Mol.Catal.B：Enzym.，2009，56：277-282)公开了酶促熊果苷酯衍生物的合成方法，但其所用的酶制剂为价格昂贵的商品化蛋白酶或
脂肪酶，且催化效率不高。如利用枯草杆菌蛋白酶催化合成熊果苷碳十一烯酸酯，其反应时间较长，效率较低；利用来源于南极假丝酵母的脂肪酶催化熊果苷月桂酸酯和阿魏酸酯的合成，其最大转化率仅为50％；利用来源于洋葱假单胞菌的脂肪酶催化熊果苷肉桂酸
酯的合成，其收率仅为28％。基于不同来源的脂肪酶之结构与功能的差异，本发明选用价格低廉的固定化扩展青霉脂肪酶制剂催化糖苷酰化以制备糖苷酯化合物，其不但收率高
(85％-98％)，且成本大大降低。
发明内容
[0003] 为了解决上述现有技术的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种固定化扩展青霉脂肪酶催化合成糖苷酯类化合物的方法。
[0004] 本发明的另一目的在于提供上述方法合成的糖苷酯类化合物。
[0005] 本发 明的 目的 通 过下 述技 术方 案 实现：一 种固 定化 扩 展青 霉(Penicilliumexpansum)脂肪酶催化合成糖苷酯类化合物的方法，包括以下操作步骤：在非水介质中，加入摩尔比为1∶1～20∶1的酰基供体和糖苷，得到溶液，该溶液中糖苷的浓度为1～40mg/mL；加入与糖苷的质量比为10∶1～1∶10的固定化扩展青霉脂肪酶，
在温度为30～60℃、振荡速度为100～300rpm和常压条件下，转酯化反应0.5～72小时，
得到糖苷酯类化合物；
在温度为30～60℃、振荡速度为100～300rpm和常压条件下，转酯化反应0.5～72小时，
得到糖苷酯类化合物；
[0006] 所述酰基供体为羧酸乙烯酯、酸酐、羧酸甲酯或羧酸乙酯；
[0007] 所述糖苷为具有如下通式(II)的化合物：
[0008]
[0009] 其中，R1为氢、羟基、甲氧基、醛基、羟甲基、甲酰基或乙酰基；R2为氢、甲基或醛基；R3为氢或甲基；
[0010] 所述非水介质为非质子有机溶剂或含低亲核性阴离子的离子液中的一种或两种。
[0011] 所述糖苷为熊果苷、天麻苷、葡萄糖豆腐果苷、高熊果苷、异高熊果苷或水杨醛-β-D-葡萄糖苷。
[0012] 所述固定化扩展青霉脂肪酶的制备包括以下操作步骤：
[0013] (1)将含有质量百分数为95％淀粉的扩展青霉脂肪酶粗酶粉(购自深圳绿微康生物工程有限公司)溶于甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中，配制成每毫升缓冲液含有0.3g脂肪
酶粗酶粉的悬浮液，在温度35℃和转速150rpm条件下搅拌1h；在温度4℃和转速6000rpm
条件下离心得上清液；所述甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中甘氨酸和氢氧化钠的重量比为
2.9∶1；
酶粗酶粉的悬浮液，在温度35℃和转速150rpm条件下搅拌1h；在温度4℃和转速6000rpm
条件下离心得上清液；所述甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中甘氨酸和氢氧化钠的重量比为
2.9∶1；
[0014] (2)将大孔吸附树脂(D4020)用质量百分数为95％的乙醇浸泡24h后，用去离子水洗至滤液澄清，得到滤液；
[0015] (3)将步骤(2)所得滤液添加到步骤(1)所得上清液中，加酶量为9g粗酶粉/g树脂；在温度35℃和转速150rpm条件下搅拌4h，用砂芯漏斗过滤，用甘氨酸-氢氧化钠缓冲液冲洗，抽滤后冷冻干燥，得到固定化扩展青霉脂肪酶；将固定化扩展青霉脂肪酶于4℃冰箱保存备用。
[0016] 所述非质子有机溶剂为四氢呋喃、丙酮、乙腈、二噁烷、叔丁醇、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、吡啶、异丙醚、异辛烷、正己烷、正庚烷、正辛烷、正壬烷或环己烷；
[0017] 所述含低亲核性阴离子的离子液中的阴离子为四氟硼酸根离子、六氟磷酸根离子、二(三氟甲基磺酰)亚胺离子或氨基酸阴离子；阳离子为1-烷基-3-甲基咪唑离子、
1-烷基-2，3-二甲基咪唑离子、季铵离子、季磷离子、氨基酸阳离子或N-烷基吡啶离子。
1-烷基-2，3-二甲基咪唑离子、季铵离子、季磷离子、氨基酸阳离子或N-烷基吡啶离子。
[0018] 所述非水介质为上述非质子有机溶剂中的两种，两种非质子有机溶剂体积比为1～19∶1。
[0019] 所述非水介质为上述非质子有机溶剂中的一种和上述含低亲核性阴离子的离子液中的一种，其中含低亲核性阴离子的离子液的体积百分含量为5～95％。
[0020] 上述方法制备的糖苷酯类化合物，具有如下通式(I)：
[0021]
[0022] 其中R为2～18个碳原子的烷酰基或9～11个碳原子的不饱和芳香酰基；R1为氢、羟基、甲氧基、醛基、羟甲基、甲酰基或乙酰基；R2为氢、甲基或醛基；R3为氢或甲基。
[0023] 所述烷酰基为直链或支链的饱和或不饱和的烷酰基；所述不饱和芳香酰基为顺式不饱和芳香酰基或反式不饱和芳香酰基。
[0024] 本发明相对现有技术，具有如下的优点及有益效果：
[0025] (1)采用廉价、高效的生物催化剂——自制固定化扩展青霉脂肪酶催化糖苷酯衍生物合成。酶促反应选择性高，产物结构易控，因此克服了传统化学方法选择性低、易生成副产物，或需要保护和脱保护操作及产率低等缺点；本发明选用价格低廉、来源于扩展青霉的固定化脂肪酶制剂催化糖苷酯衍生物的合成，与现有的酶催化熊果苷酯衍生物合成的技术相比，具有收率高(85％～98％)，成本低的优点。
[0026] (2)本发明区域选择性高，产率高、产物纯度高、反应过程简单易控，产物易分离。
[0027] (3)本发明在温度为30～60℃、振荡速度为100～300rpm、常压条件下，利用酶催化制备糖苷酯衍生物，反应条件温和、环境友好。
具体实施方式
[0028] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0029] 实施例1：熊果苷6′-丁酰酯的合成
[0030] 将熊果苷(109mg，0.4mmol)、丁酸乙烯酯(3mmol)、20mL无水四氢呋喃加入50mL具塞三角瓶中混匀后，于其中加入1000mg固定化扩展青霉脂肪酶，常压下于35℃、300rpm的恒温振荡器内振荡，利用薄层层析法(TLC)监控反应。反应1h后，过滤、真空浓缩滤液、柱层析(石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA)＝1/4，Rf＝0.25)纯化，得白色粉末产物116mg，收率13 1
为85％，纯度大于99％。结构通过 C NMR(100.5MHz)和 H NMR(400MHz)确认：
为85％，纯度大于99％。结构通过 C NMR(100.5MHz)和 H NMR(400MHz)确认：
[0031] 13C NMR：δppm 14.04(C4 ″)，18.52(C3 ″)，36.02(C2 ″)，63.99(C6 ′ )，70.64(C4′)，73.79(C2′)，74.22(C5′)，76.93(C3′)，102.05(C1′)，116.01(C3+C5)，
118.24(C2+C6)，150.70(C1)，152.91(C4)，173.17(C1″)。
118.24(C2+C6)，150.70(C1)，152.91(C4)，173.17(C1″)。
[0032] 1H NMR：δppm 0.88(t，3H，H4 ″ )，1.54(q，2H，H3 ″ )，2.27(t，2H，H2 ″ )，3.29-3.11(m，3H，H2′+H3′+H4′)，3.51(t，1H，H5′)，4.06(dd，1H，H6′)，4.33(d，1H，H6′)，4.68(d，1H，H1′)，5.14(d，1H，OH4′)，5.24(d，1H，OH3′)，5.30(d，1H，OH2′)，
6.65(d，2H，H3+H5)，6.84(d，2H，H2+H6)，9.01(s，1H，OH4)。
6.65(d，2H，H3+H5)，6.84(d，2H，H2+H6)，9.01(s，1H，OH4)。
[0033] 实施例2：熊果苷6′-丁酰酯的合成
[0034] 将熊果苷(218mg，0.8mmol)、丁酸酐(5.6mmol)、20mL正己烷/四氢呋喃(1/4，v/v)加入50mL具塞三角瓶中混匀后，于其中加入900mg固定化扩展青霉脂肪酶，常压下于40℃、200rpm的恒温振荡器内振荡，利用薄层层析法(TLC)监控反应。反应10h后，过滤、真空浓缩滤液、柱层析(石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA)＝1/4，Rf＝0.25)纯化，得白色粉末
13 1
产物230mg，收率为84％，纯度大于99％。结构通过 C NMR(100.5MHz)和 H NMR(400MHz)确认：
13 1
产物230mg，收率为84％，纯度大于99％。结构通过 C NMR(100.5MHz)和 H NMR(400MHz)确认：
[0035] 13C NMR：δppm 14.04(C4 ″)，18.52(C3 ″)，36.02(C2 ″)，63.99(C6 ′ )，70.64(C4′)，73.79(C2′)，74.22(C5′)，76.93(C3′)，102.05(C1′)，116.01(C3+C5)，
118.24(C2+C6)，150.70(C1)，152.91(C4)，173.17(C1″)。
118.24(C2+C6)，150.70(C1)，152.91(C4)，173.17(C1″)。
[0036] 1H NMR：δppm 0.88(t，3H，H4 ″ )，1.54(q，2H，H3 ″ )，2.27(t，2H，H2 ″ )，3.29-3.11(m，3H，H2′+H3′+H4′)，3.51(t，1H，H5′)，4.06(dd，1H，H6′)，4.33(d，1H，H6′)，4.68(d，1H，H1′)，5.14(d，1H，OH4′)，5.24(d，1H，OH3′)，5.30(d，1H，OH2′)，
6.65(d，2H，H3+H5)，6.84(d，2H，H2+H6)，9.01(s，1H，OH4)。
6.65(d，2H，H3+H5)，6.84(d，2H，H2+H6)，9.01(s，1H，OH4)。
[0037] 实施例3：熊果苷6′-己酸酯的合成
[0038] 将熊果苷(20mg，0.07mmol)、己酸乙烯酯(0.5mmol)、20mL异丙醚/四氢呋喃(1/19，v/v)加入50mL具塞三角瓶中混匀后，于其中加入10mg固定化扩展青霉脂肪酶，常压下于35℃、150rpm的恒温振荡器内振荡，用TLC监控反应。反应24h后，过滤、真空浓缩滤液、柱层析(石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA)＝4/1，Rf＝0.25)纯化，得白色粉末产物22.4mg，
13 1
收率为86％，纯度大于99％。结构通过 C NMR(100.5MHz)和 H NMR(400MHz)确认：
13 1
收率为86％，纯度大于99％。结构通过 C NMR(100.5MHz)和 H NMR(400MHz)确认：
[0039] 13C NMR：δppm 14.37(C6 ″)，22.34(C5 ″)，24.69(C3 ″)，31.24(C4 ″ )，34.08(C2″)，63.98(C6′)，70.62(C4′)，73.78(C2′)，74.22(C5′)，76.93(C3′)，
102.07(C1′)，116.01(C3+C5)，118.23(C2+C6)，150.71(C1)，152.92(C4)，173.32(C1″)。
102.07(C1′)，116.01(C3+C5)，118.23(C2+C6)，150.71(C1)，152.92(C4)，173.32(C1″)。
[0040] 1H NMR：δppm 0.85(t，3H，H6″)，1.25(s，4H，H4″+H5″)，1.52(q，2H，H3″)，2.28(t，2H，H2″)，3.29-3.11(m，3H，H2′+H3′+H4′)，3.50(t，1H，H5′)，4.06(dd，1H，H6′)，4.33(d，1H，H6′)，4.67(d，1H，H1′)，5.14(d，1H，OH4′)，5.23(d，1H，OH3′)，
5.31(d，1H，OH2′)，6.65(d，2H，H3+H5)，6.84(d，2H，H2+H6)，9.01(s，1H，OH4)。
5.31(d，1H，OH2′)，6.65(d，2H，H3+H5)，6.84(d，2H，H2+H6)，9.01(s，1H，OH4)。
[0041] 实施例4：熊果苷6′-己酸酯的合成
[0042] 将熊果苷(109mg，0.4mmol)、己酸乙酯(3.6mmol)、20mL异丙醚/乙腈(1/5，v/v)加入50mL具塞三角瓶中混匀后，于其中加入800mg固定化扩展青霉脂肪酶，常压下于45℃、250rpm的恒温振荡器内振荡，用TLC监控反应。反应4.5h后，过滤、真空浓缩滤液、柱层析(石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA)＝4/1，Rf＝0.25)纯化，得白色粉末产物127mg，收率为
13 1
85％，纯度大于99％。结构通过 C NMR(100.5MHz)和 H NMR(400MHz)确认：
13 1
85％，纯度大于99％。结构通过 C NMR(100.5MHz)和 H NMR(400MHz)确认：
[0043] 13C NMR：δppm 14.37(C6 ″)，22.34(C5 ″)，24.69(C3 ″)，31.24(C4 ″ )，34.08(C2″)，63.98(C6′)，70.62(C4′)，73.78(C2′)，74.22(C5′)，76.93(C3′)，
102.07(C1′)，116.01(C3+C5)，118.23(C2+C6)，150.71(C1)，152.92(C4)，173.32(C1″)。
102.07(C1′)，116.01(C3+C5)，118.23(C2+C6)，150.71(C1)，152.92(C4)，173.32(C1″)。
[0044] 1H NMR：δppm 0.85(t，3H，H6″)，1.25(s，4H，H4″+H5″)，1.52(q，2H，H3″)，2.28(t，2H，H2″)，3.29-3.11(m，3H，H2′+H3′+H4′)，3.50(t，1H，H5′)，4.06(dd，1H，H6′)，4.33(d，1H，H6′)，4.67(d，1H，H1′)，5.14(d，1H，OH4′)，5.23(d，1H，OH3′)，
5.31(d，1H，OH2′)，6.65(d，2H，H3+H5)，6.84(d，2H，H2+H6)，9.01(s，1H，OH4)。
5.31(d，1H，OH2′)，6.65(d，2H，H3+H5)，6.84(d，2H，H2+H6)，9.01(s，1H，OH4)。
[0045] 实施例5：熊果苷6′-辛酸酯的合成
[0046] 将熊果苷(109mg，0.4mmol)、辛酸乙烯酯(0.4mmol)、20mL[C4MIm]PF6/四氢呋喃(1/9，v/v)加入50mL具塞三角瓶中混匀后，于其中加入600mg固定化扩展青霉脂肪酶，常压下于40℃、250rpm的恒温振荡器内振荡，利用TLC监控反应。反应8h后，过滤、真空浓缩滤液、柱层析(石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA)＝4/1，Rf＝0.27)纯化，得白色粉末产物145mg，13 1
收率为91％，纯度大于99％。结构通过 C NMR(100.5MHz)和 H NMR(400MHz)确认：
收率为91％，纯度大于99％。结构通过 C NMR(100.5MHz)和 H NMR(400MHz)确认：
[0047] 13C NMR：δppm 14.51(C8 ″)，22.61(C7 ″)，25.01(C3 ″)，28.93(C4 ″ )，29.01(C5″)，31.68(C6″)，34.12(C2″)，63.98(C6′)，70.61(C4′)，73.79(C2′)，
74.22(C5′)，76.93(C3′)，102.08(C1′)，116.01(C3+C5)，118.22(C2+C6)，150.71(C1)，
152.93(C4)，173.32(C1″)。
74.22(C5′)，76.93(C3′)，102.08(C1′)，116.01(C3+C5)，118.22(C2+C6)，150.71(C1)，
152.93(C4)，173.32(C1″)。
[0048] 1H NMR：δppm 0.85(t，3H，H8″)，1.25(s，8H，H4″+H5″+H6″+H7″)，1.52(t，2H，H3″)，2.28(t，2H，H2″)，3.29-3.11(m，3H，H2′+H3′+H4′)3.50(t，1H，H5′)，
4.06(dd，1H，H6′)，4.31(d，1H，H6′)，4.67(d，1H，H1′)，5.14(d，1H，OH4′)，5.22(d，1H，OH3′)，5.30(d，1H，OH2′)，6.66(d，2H，H3+H5)，6.83(d，2H，H2+H6)，9.00(s，1H，OH4)。
4.06(dd，1H，H6′)，4.31(d，1H，H6′)，4.67(d，1H，H1′)，5.14(d，1H，OH4′)，5.22(d，1H，OH3′)，5.30(d，1H，OH2′)，6.66(d，2H，H3+H5)，6.83(d，2H，H2+H6)，9.00(s，1H，OH4)。
[0049] 实施例6：熊果苷6′-辛酸酯的合成
[0050] 将熊果苷(109mg，0.4mmol)、辛酸甲酯(4mmol)、20mL[C6MIm]PF6/四氢呋喃(1/9，v/v)加入50mL具塞三角瓶中混匀后，于其中加入600mg固定化扩展青霉脂肪酶，常压下于45℃、250rpm的恒温振荡器内振荡，利用TLC监控反应。反应4h后，过滤、真空浓缩滤液、柱层析(石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA)＝4/1，Rf＝0.27)纯化，得白色粉末产物145mg，收率
13 1
为91％，纯度大于99％。结构通过 C NMR(100.5MHz)和 H NMR(400MHz)确认：
13 1
为91％，纯度大于99％。结构通过 C NMR(100.5MHz)和 H NMR(400MHz)确认：
[0051] 13C NMR：δppm 14.51(C8 ″)，22.61(C7 ″)，25.01(C3 ″)，28.93(C4 ″ )，29.01(C5″)，31.68(C6″)，34.12(C2″)，63.98(C6′)，70.61(C4′)，73.79(C2′)，
74.22(C5′)，76.93(C3′)，102.08(C1′)，116.01(C3+C5)，118.22(C2+C6)，150.71(C1)，
152.93(C4)，173.32(C1″)。
74.22(C5′)，76.93(C3′)，102.08(C1′)，116.01(C3+C5)，118.22(C2+C6)，150.71(C1)，
152.93(C4)，173.32(C1″)。
[0052] 1H NMR：δppm 0.85(t，3H，H8″)，1.25(s，8H，H4″+H5″+H6″+H7″)，1.52(t，2H，H3″)，2.28(t，2H，H2″)，3.29-3.11(m，3H，H2′+H3′+H4′)3.50(t，1H，H5′)，
4.06(dd，1H，H6′)，4.31(d，1H，H6′)，4.67(d，1H，H1′)，5.14(d，1H，OH4′)，5.22(d，1H，OH3′)，5.30(d，1H，OH2′)，6.66(d，2H，H3+H5)，6.83(d，2H，H2+H6)，9.00(s，1H，OH4)。
4.06(dd，1H，H6′)，4.31(d，1H，H6′)，4.67(d，1H，H1′)，5.14(d，1H，OH4′)，5.22(d，1H，OH3′)，5.30(d，1H，OH2′)，6.66(d，2H，H3+H5)，6.83(d，2H，H2+H6)，9.00(s，1H，OH4)。
[0053] 实施例7：熊果苷6′-癸酸酯的合成
[0054] 将熊果苷(800mg，2.9mmol)、癸酸乙烯酯(14mmol)、20mL二噁烷加入50mL具塞三角瓶中混匀后，于其中加入520mg固定化扩展青霉脂肪酶，常压下于60℃、250rpm的恒温振荡器内振荡，利用TLC监控反应。反应24h后，过滤、真空浓缩滤液、柱层析(石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA)＝4/1，Rf＝0.27)纯化，得白色粉末产物1087mg，收率为88％，纯度大于13 1
99％。结构通过 C NMR(100.5MHz)和 HNMR(400MHz)确认：
99％。结构通过 C NMR(100.5MHz)和 HNMR(400MHz)确认：
[0055] 13C NMR：δppm 14.54(C10 ″ )，22.67(C9 ″)，25.01(C3 ″)，29.06(C4 ″ )，29.23(C5″)，29.28(C7″)，29.43(C6″)，31.85(C8″)，34.12(C2″)，63.99(C6′)，
70.62(C4′)，73.79(C2′)，74.23(C5′)，76.94(C3′)，102.11(C1′)，116.00(C3+C5)，
118.23(C2+C6)，150.72(C1)，152.94(C4)，173.31(C1″)。
70.62(C4′)，73.79(C2′)，74.23(C5′)，76.94(C3′)，102.11(C1′)，116.00(C3+C5)，
118.23(C2+C6)，150.72(C1)，152.94(C4)，173.31(C1″)。
[0056] 1H NMR ：δppm 0.85(t，3H，H10 ″ )，1.23(s，12H，H4″+H5″+H6″+H7″+H8″+H9″)，1.51(t，2H，H3″)，2.28(t，2H，H2″)，3.29-3.08(m，
3H，H2′+H3′+H4′)，3.50(t，1H，H5′)，4.06(dd，1H，H6′)，4.31(d，1H，H6′)，4.66(d，
1H，H1′)，5.14(d，1H，OH4′)，5.22(d，1H，OH3′)，5.30(d，1H，OH2 ′)，6.65(d，2H，H3+H5)，6.83(d，2H，H2+H6)，9.00(s，1H，OH4)。
3H，H2′+H3′+H4′)，3.50(t，1H，H5′)，4.06(dd，1H，H6′)，4.31(d，1H，H6′)，4.66(d，
1H，H1′)，5.14(d，1H，OH4′)，5.22(d，1H，OH3′)，5.30(d，1H，OH2 ′)，6.65(d，2H，H3+H5)，6.83(d，2H，H2+H6)，9.00(s，1H，OH4)。
[0057] 实施例8：熊果苷6′-月桂酸酯的合成
[0058] 将熊果苷(109mg，0.4mmol)、月桂酸乙烯酯(0.8mmol)、20mL[C6Py]NTf2/丙酮(19/1，v/v)加入50mL具塞三角瓶中混匀后，于其中加入100mg固定化扩展青霉脂肪酶，常压下于60℃、250rpm的恒温振荡器内振荡，利用TLC监控反应。反应72h后，过滤、真空浓缩滤液、柱层析(石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA)＝1/3，Rf＝0.27)纯化，得白色粉末产物
13 1
160mg，收率为88％，纯度大于99％。结构通过 C NMR(100.5MHz)和 H NMR(400MHz)确认：
13 1
160mg，收率为88％，纯度大于99％。结构通过 C NMR(100.5MHz)和 H NMR(400MHz)确认：
[0059] 13C NMR：δppm 14.51(C8″)，22.61(C7″)，25.01(C3″)，28.93(C4″)，29.01(C5″)，31.68(C6″)，34.12(C2″)，63.98(C6′)，70.61(C4′)，73.79(C2′)，74.22(C5′)，76.93(C3′)，
102.09(C1′)，116.01(C3+C5)，118.22(C2+C6)，150.71(C1)，152.93(C4)，173.32(C1″)。
102.09(C1′)，116.01(C3+C5)，118.22(C2+C6)，150.71(C1)，152.93(C4)，173.32(C1″)。
[0060] 1H NMR：δppm 0.85(t，3H，H8″)，1.25(s，8H，H4″+H5″+H6″+H7″)，1.52(t，2H，H3″)，2.28(t，2H，H2″)，3.29-3.11(m，3H，H2′+H3′+H4′)3.50(t，1H，H5′)，4.06(dd，1H，H6′)，
4.31(d，1H，H6′)，4.67(d，1H，H1′)，5.14(d，1H，OH4′)，5.22(d，1H，OH3′)，5.30(d，1H，OH2′)，
6.66(d，2H，H3+H5)，6.83(d，2H，H2+H6)，9.00(s，1H，OH4)。
4.31(d，1H，H6′)，4.67(d，1H，H1′)，5.14(d，1H，OH4′)，5.22(d，1H，OH3′)，5.30(d，1H，OH2′)，
6.66(d，2H，H3+H5)，6.83(d，2H，H2+H6)，9.00(s，1H，OH4)。
[0061] 实施例9：熊果苷6′-棕榈酸酯的合成
[0062] 将熊果苷(109mg，0.4mmol)、棕榈酸乙烯酯(4mmol)、20mL二噁烷/异辛烷(1/1，v/v)加入50mL具塞三角瓶中混匀后，于其中加入200mg固定化扩展青霉脂肪酶，常压下于50℃、200rpm的恒温振荡器内振荡，利用TLC监控反应。反应10h后，过滤、真空浓缩滤液、柱层析(石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA)＝1/3，Rf＝0.28)纯化，得白色粉末产物174mg，收
13 1
率为85％，纯度大于99％。结构通过1 C NMR(100.5MHz)和 H NMR(400MHz)确认：
13 1
率为85％，纯度大于99％。结构通过1 C NMR(100.5MHz)和 H NMR(400MHz)确认：
[0063] 13C NMR：δppm 13.97(C16″)，22.13(C15″)，24.44(C3″)，28.51(C4 ″)，28.75(C5″)，28.93(C13″)，29.07(C6″+C7″+C8″+C9″+C10″+C11″+C12″)，
31.33(C14″)，33.53(C2″)，63.43(C6′)，70.02(C4′)，73.19(C2′)，73.63(C5′)，
76.34(C3′)，101.51(C1′)，115.41(C3+C5)，117.62(C2+C6)，150.13(C1)，152.36(C4)，
172.72(C1″)。
31.33(C14″)，33.53(C2″)，63.43(C6′)，70.02(C4′)，73.19(C2′)，73.63(C5′)，
76.34(C3′)，101.51(C1′)，115.41(C3+C5)，117.62(C2+C6)，150.13(C1)，152.36(C4)，
172.72(C1″)。
[0064] 1H NMR：δppm 0.85(t，3H，H16″)1.23(s，24H，H4″+H5″+H6″+H7″+H8″+H9″+H10″+H11″+H12″+H13″+H14″+H15″)，1.50(t，2H，H3″)，2.28(t，2H，H2″)，
3.23-3.14(m，3H，H2′+H3′+H4′)，3.50(t，1H，H5′)，4.06(dd，1H，H6′)，4.29(d，1H，H6′)，4.66(d，1H，H1′)，5.17(s，1H，OH4′)，5.25(d，1H，OH3′)，5.32(s，1H，OH2′)，
6.65(d，2H，H3+H5)，6.83(d，2H，H2+H6)，9.01(s，1H，OH4)。
3.23-3.14(m，3H，H2′+H3′+H4′)，3.50(t，1H，H5′)，4.06(dd，1H，H6′)，4.29(d，1H，H6′)，4.66(d，1H，H1′)，5.17(s，1H，OH4′)，5.25(d，1H，OH3′)，5.32(s，1H，OH2′)，
6.65(d，2H，H3+H5)，6.83(d，2H，H2+H6)，9.01(s，1H，OH4)。
[0065] 实施例10：熊果苷6′-甲基丙烯酸酯的合成
[0066] 将熊果苷(109mg，0.4mmol)、甲基丙烯酸乙烯酯(6mmol)、20mL[C4MIm]BF4/乙腈(1/19，v/v)加入50mL具塞三角瓶混匀后，于其中加入600mg固定化扩展青霉脂肪酶，常压下于55℃、150rpm的恒温振荡器内振荡，利用TLC监控反应。反应72h后，过滤、真空浓缩滤液、柱层析(石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA)＝4/1，Rf＝0.25)纯化，得白色粉末产物115mg，13 1
收率为85％，纯度大于99％。结构通过 C NMR(100.5MHz)和 H NMR(400MHz)确认：
收率为85％，纯度大于99％。结构通过 C NMR(100.5MHz)和 H NMR(400MHz)确认：
[0067] 13C NMR：δppm 17.88(C4 ″)，64.05(C6 ′)，70.17(C4 ′)，73.18(C2 ′ )，73.61(C5 ′ )，76.38(C3 ′ )，101.35(C1 ′ )，115.40(C3+C5)，117.47(C2+C6)，
125.67(C3″)，135.84(C2″)，150.10(C1)，152.24(C4)，166.33(C1″)。
125.67(C3″)，135.84(C2″)，150.10(C1)，152.24(C4)，166.33(C1″)。
[0068] 1H NMR：δppm 1.89(s，3H，H4″)，3.32-3.15(m，3H，H2′+H3′+H4′)，3.59(t，1H，H5′)，4.06(dd，1H，H6′)，4.44(d，1H，H6′)，4.69(d，1H，H1′)，5.14(s，1H，OH4′)，
5.26(d，1H，OH3′)，5.29(d，1H，OH2′)，5.69(d，1H，H3″)，6.05(s，1H，H3″)，6.63(d，2H，H3+H5)，6.84(d，2H，H2+H6)，8.98(s，1H，OH4)。
5.26(d，1H，OH3′)，5.29(d，1H，OH2′)，5.69(d，1H，H3″)，6.05(s，1H，H3″)，6.63(d，2H，H3+H5)，6.84(d，2H，H2+H6)，8.98(s，1H，OH4)。
[0069] 实施例11：熊果苷6′-碳十一烯酸酯的合成
[0070] 将熊果苷(109mg，0.4mmol)、碳十一烯酸乙烯酯(6mmol)、20mL四氢呋喃加入50mL具塞三角瓶混匀后，于其中加入600mg固定化扩展青霉脂肪酶，常压下于45℃、200rpm的恒温振荡器内振荡，利用TLC监控反应。反应0.5h后，过滤、真空浓缩滤液、柱层析(石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA)＝4/1，Rf＝0.25)纯化，得白色粉末产物172mg，收率为98％，纯度13 1
大于99％。结构通过 C NMR(100.5MHz)和 H NMR(400MHz)确认：
大于99％。结构通过 C NMR(100.5MHz)和 H NMR(400MHz)确认：
[0071] 1H NMR：δppm 1.23(s，8H，H4 ′ +H5 ″ +H6 ″ +H7 ″ )，1.32-1.30(m，2H，H8 ″)，1.51(s，2H，H3 ″ )，1.99(q，2H，H9 ″)，2.27(t，2H，H2 ″ )，3.27-3.12(m，3H，H2′+H3′+H4′)，3.50(t，1H，H5′)，4.06(dd，1H，H6′)，4.31(d，1H，H6′)，4.66(d，1H，H1′)，5.00-4.90(m，2H，H11″)，5.13(s，1H，OH4′)，5.21(d，1H，OH3′)，5.29(s，
1H，OH2′)，5.82-5.72(m，1H，H10″)，6.65(d，2H，H3+H5)，6.83(d，2H，H2+H6)，8.99(s，1H，OH4)。
1H，OH2′)，5.82-5.72(m，1H，H10″)，6.65(d，2H，H3+H5)，6.83(d，2H，H2+H6)，8.99(s，1H，OH4)。
[0072] 13C NMR：δppm 24.38(C3″)，28.25(C8″)，28.41(C6″+C7″)，28.60(C5″)，28.65(C4″)，33.12(C9″)，33.52(C2″)，63.38(C6′)，70.05(C4′)，73.19(C2′)，
73.65(C5 ′ )，76.36(C3 ′ )，101.57(C1 ′ )，114.51(C11 ″ )，115.40(C3+C5)，
117.66(C2+C6)，138.77(C10″)，150.12(C1)，152.34(C4)，172.66(C1″)。
73.65(C5 ′ )，76.36(C3 ′ )，101.57(C1 ′ )，114.51(C11 ″ )，115.40(C3+C5)，
117.66(C2+C6)，138.77(C10″)，150.12(C1)，152.34(C4)，172.66(C1″)。
[0073] 实施例12：熊果苷6′-苯甲酸酯的合成
[0074] 将熊果苷(109mg，0.4mmol)、苯甲酸乙烯酯(8mmol)、20mL正辛烷/四氢呋喃(19/1，v/v)加入50mL具塞三角瓶混匀后，于其中加入700mg固定化扩展青霉脂肪酶，常压下置于60℃、200rpm的恒温振荡器内振荡，利用TLC监控反应。反应72h后，过滤、真空浓缩滤液、柱层析(石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA)＝1/4，Rf＝0.25)纯化，得产物130mg，收
13 1
率为86％，白色粉末，纯度大于99％。结构通过 C NMR(100.5MHz)和 H NMR(400MHz)确
认：
13 1
率为86％，白色粉末，纯度大于99％。结构通过 C NMR(100.5MHz)和 H NMR(400MHz)确
认：
[0075] 13C NMR：δppm 165.51(C1 ″ )，152.25(C4)，150.05(C1)，133.34(C5 ″ )，129.68(C2 ″ )，129.14(C3 ′ +C7 ″ )，128.68(C4 ″ +C6 ″ )，117.56(C2+C6)，