碱性蛋白酶

摘要

本发明的目的在于提供一种具有工业上充分的蛋白质生产力和显著的去污力的碱性蛋白酶。在所述碱性蛋白酶中，其序列号2中的(a)9位、(b)49位、(c)194位、(d)212位、(e)237位、(f)245位、(g)281位、(h)313位、(i)379位和(j)427位的氨基酸残基选自下列氨基酸残基：(a)位：谷氨酰胺、(b)位：谷氨酰胺、(c)位：赖氨酸或精氨酸、(d)位：精氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺、(e)位：天冬酰胺、(f)位：天冬酰胺、(g)位：精氨酸、(h)位：天冬酰胺、(i)位：赖氨酸、精氨酸、谷氨酸或天冬氨酸、(j)位：精氨酸。

权利要求

1.一种碱性蛋白酶，其特征在于，序列号2中的(c)194位、(d)212位、(h)313位、(i)379位和(j)427位的氨基酸残基选自下列氨基酸残基：(c)位：赖氨酸或精氨酸、(d)位：精氨酸、(h)位：天冬酰胺、(i)位：精氨酸、(j)位：精氨酸。

2.一种基因，其特征在于，编码如权利要求1所述的碱性蛋白酶。

3.一种重组载体，其特征在于，含有如权利要求2所述的基因。

4.一种转化子，其特征在于，含有如权利要求3所述的载体。

5.根据权利要求4所述的转化子，其特征在于，宿主是微生物。

6.一种洗涤剂组合物，其特征在于，含有如权利要求1所述的碱性蛋白酶。

说明书

碱性蛋白酶

技术领域

[0001] 本发明涉及作为配合到洗涤剂中的酶有效的碱性蛋白酶以及编码该酶的基因。

背景技术

[0002] 蛋白酶用于工业领域历史悠久。他们用于不同的领域，包括例如衣料用洗涤剂的洗涤剂、织物改性剂、皮革处理剂、化妆品、浴液、食品改性剂或医药品。在这些用途中，洗涤剂用蛋白酶是在工业上最大量生产的。洗涤剂用蛋白酶的例子有：Alcalase和Savinase(注册商标；Novozymes A/S公司)、Maxacal(注册商标；Genencor InternationalInc.)、BLAP(注册商标；Henkel KGaA)、以及KAP(花王公司)。

[0003] 在洗涤剂中配合蛋白酶的目的在于促进附着于衣料上的蛋白质类污渍分解为低分子量物质，并用表面活性剂进行增溶。然而，实际的污渍是复合污渍，其不仅含有蛋白质，还含有例如有机物和无机物(例如来自皮脂的脂质和固体颗粒)的多种成分的混合物。因此需要对这种复合污渍具有显著去污力的洗涤剂。

[0004] 基于这样的观点，本发明人发现了数种碱性蛋白酶，这些碱性蛋白酶即使在高浓度脂肪酸存在下也可保持充分的酪蛋白的分解活性，对于不仅含有蛋白质、还交织有皮脂等的复合污渍显示出显著的去污力，并且分子量约为43,000(专利文献1)。这些碱性蛋白酶族在分子量、一级结构、酶学特性、特别是显示出极强的氧化剂耐性的方面，与以往公知的来自芽孢杆菌属细菌的枯草杆菌蛋白酶为代表的丝氨酸蛋白酶不同，提议将这些碱性蛋白酶族分类到新的枯草杆菌蛋白酶亚科(非专利文献1)。

[0005] 上述碱性蛋白酶族在皮脂污渍等彼此交织的条件下具有显著的去污力。此外，对于除了具有去污力、还具有充分的生产性能的碱性蛋白酶有所需求。

[0006] 通常酶活性以pH依赖性的方式变化，因为在这种酶的活性位上具有一个氨基酸残基，该氨基酸残基具有一个对于表达活性必不可少的可分离的酸性基团或可分离的碱性基团。因此，试图通过改变带电氨基酸残基来人为地改变酶活性的pH依赖性是蛋白质工程中的一个重要目标。

[0007] 例如，已报道的有：取代枯草杆菌蛋白酶BPN′上的特定氨基酸残基，通过改变酶的表面电荷，从而改变pH依赖性(非专利文献2～4)；M-蛋白酶(M-protease)是一种高耐碱蛋白酶，当改变其表面氨基酸残基以获得高等电点以及得到离子键的新网状结构时，M-蛋白酶适应高碱性条件(非专利文献5)；并且枯草杆菌蛋白酶的等电点和去污力之间的关系恒定(专利文献2)。

[0008] 然而，上述任意报道均涉及来自芽孢杆菌属细菌的丝氨酸蛋白酶，其分子量约为28,000，例如枯草杆菌蛋白酶BPN′和枯草杆菌蛋白酶309。因此，这些报道没有提供以下有用信息：具有间隙区(Gap region)和C-末端的延伸区(Extended region)的丝氨酸蛋白酶，其不存在于分子量约为28,000的蛋白酶族中，其分子量约为43,000。

[0009] 此外，无法预测为了改善酶的去污力而改变氨基酸残基是否会影响蛋白质的生产力。因此，即使引入某些突变可以对去污力产生有利的改变，但是如果这样降低了蛋白质的生产力，那么实际的生产可能受到极大地抑制。

[0010] 专利文献1：WO99/18218

[0011] 专利文献2：日本专利No.3343115

[0012] 非 专 利 文 献 1：Saeki et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，Vol.279，pp.313-319，2000

[0013] 非专利文献2：Nature，Vol.318，pp.375-376，1985

[0014] 非专利文献3：J.Mol.Biol.，Vol.193，pp.803-813，1987

[0015] 非专利文献4：Nature，Vol.328，pp.496-500，1987

[0016] 非专利文献5：Protein Engineering，Vol.10，pp.627-634，1997发明内容

[0017] 本发明涉及以下发明：

[0018] (1)一种碱性蛋白酶，其中，序列号2(SEQ ID NO：2)中的(a)9位、(b)49位、(c)194位、(d)212位、(e)237位、(f)245位、(g)281位、(h)313位、(i)379位和(j)427位的氨基酸残基选自下列氨基酸残基：

[0019] (a)位：谷氨酰胺、

[0020] (b)位：谷氨酰胺、

[0021] (c)位：赖氨酸或精氨酸、

[0022] (d)位：精氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺、

[0023] (e)位：天冬酰胺、

[0024] (f)位：天冬酰胺、

[0025] (g)位：精氨酸、

[0026] (h)位：天冬酰胺、

[0027] (i)位：赖氨酸、精氨酸、谷氨酸或天冬氨酸、

[0028] (j)位：精氨酸；

[0029] (2)一种碱性蛋白酶，其由与序列号2所示的氨基酸序列的同源性在80％以上的氨基酸序列构成，其中，与序列号2中的(a)9位、(b)49位、(c)194位、(d)212位、(e)237位、(g)281位和(i)379位对应的氨基酸残基选自下列氨基酸残基：

[0030] (a)位：谷氨酰胺、

[0031] (b)位：谷氨酰胺、

[0032] (c)位：赖氨酸或精氨酸、

[0033] (d)位：天冬酰胺或谷氨酰胺、

[0034] (e)位：天冬酰胺、

[0035] (g)位：精氨酸、

[0036] (i)位：谷氨酸或天冬氨酸；

[0037] (3)一种基因，其编码上述碱性蛋白酶中的一种；

[0038] (4)一种重组载体，其含有上述基因；以及一种转化子，其含有所述载体；

[0039] (5)一种洗涤剂组合物，其含有上述碱性蛋白酶中的一种。

具体实施方式

[0040] 本发明涉及提供一种具有工业上充分的蛋白质生产力和显著的去污力的碱性蛋白酶。

[0041] 本发明人针对分子量约为43,000的碱性蛋白酶的性能提高进行了多种考察。结果，本发明人发现：暴露于酶蛋白表面的氨基酸序列的特定位上的特定氨基酸残基的存在，能够保持或提高其在工业上充分的蛋白质生产力并能改善其去污力。基于这些发现，本发明人完成了本发明。

[0042] 根据本发明，提供一种能够在工业上有利地生产并具有显著的去污力的碱性蛋白酶。

[0043] 本发明的由序列号2所示的氨基酸序列所构成的碱性蛋白酶表示蛋白酶KP43〔来自芽孢杆菌KSM-KP43(FERM BP-6532)，WO99/18218，基因库登录号AB051423〕。本发明的碱性蛋白酶的序列号2中的(a)9位、(b)49位、(c)194位、(d)212位、(e)237位、(f)245位、(g)281位、(h)313位、(i)379位和(j)427位的氨基酸残基选自下列氨基酸残基：

[0044] (a)位：谷氨酰胺、

[0045] (b)位：谷氨酰胺、

[0046] (c)位：赖氨酸或精氨酸、

[0047] (d)位：精氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺、

[0048] (e)位：天冬酰胺、

[0049] (f)位：天冬酰胺、

[0050] (g)位：精氨酸、

[0051] (h)位：天冬酰胺、

[0052] (i)位：赖氨酸、精氨酸、谷氨酸或天冬氨酸、

[0053] (j)位：精氨酸；

[0054] 本发明的碱性蛋白酶包括野生型、野生型突变体或人工突变体。

[0055] 此外，本发明的碱性蛋白酶包括由与序列号2所示的氨基酸序列的同源性在80％以上的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶，其中，与序列号2中的(a)9位、(b)49位、(c)194位、(d)212位、(e)237位、(g)281位和(i)379位对应的氨基酸残基选自下列氨基酸残基：

[0056] (a)位：谷氨酰胺、

[0057] (b)位：谷氨酰胺、

[0058] (c)位：赖氨酸或精氨酸、

[0059] (d)位：天冬酰胺或谷氨酰胺、

[0060] (e)位：天冬酰胺、

[0061] (g)位：精氨酸、

[0062] (i)位：谷氨酸或天冬酰胺酸；

[0063] 并且还可以包括野生型、野生型突变体或人工突变体。

[0064] 由与序列号2所示的氨基酸序列的同源性在80％以上的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶的例子包括由与序列号2所示的氨基酸序列的同源性在95％以上、优选96％以上、更优选90％以上、进一步优选97％以上、更进一步优选98％以上、特别优选99％以上的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶。所有这些氨基酸序列都具有与序列号2所示的氨基酸序列同样水平的功能，并且由这些氨基酸序列构成的碱性蛋白酶与由序列号2所示的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶不同(也称为“其他碱性蛋白酶”)。

[0065] 这些其他碱性蛋白酶优选具有下面(1)或(2)所述的特性：

[0066] (1)具有氧化剂耐性，并且十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术测得的分子量为43,000±2,000；

[0067] (2)能在pH8以上的碱性环境下起作用，具有氧化剂耐性，在50℃、pH10的条件下处理10分钟，残留活性保留80％以上，受二异丙基氟磷酸(DFP)和苯甲基磺酰氟(PMSF)抑制，并且SDS-PAGE测得的分子量为43,000±2,000。

[0068] 如此处所使用的术语“具有氧化剂耐性”是指在30℃下，静置在含有50mM过氧化氢和5mM氯化钙的20mM伯瑞坦-罗比森缓冲液(Britton Robinson buffer)(pH 10)中20分钟后，残留活性保持在50％以上。

[0069] 上述其他碱性蛋白酶的例子，包括蛋白酶KP9860〔来自芽孢杆菌KSM-KP9860(FERM BP-6534)，WO99/18218，基因库登录号AB046403〕、蛋白酶E-1〔来自芽孢杆菌No.D-6(FERM P-1592)，特开昭49-71191号公报，基因库登录号AB046402〕、蛋白酶Ya〔来自芽孢杆菌Y(FERM BP-1029)，特开昭61-280268号公报，基因库登录号AB046404〕、蛋白酶SD521〔来自芽孢杆菌SD521(FERM P-11162)，特开平3-191781，基因库登录号AB046405〕、蛋白酶A-1〔来自NCIB12289，WO88/01293，基因库登录号AB046406〕、蛋白酶A-2〔来自NCIB12513，WO98/56927〕、蛋白酶9865〔来自芽孢杆菌KSM-9865(FERM P-18566)，基因库登录号AB084155〕和特开2002-218989号公报、特开2002-306176号公报、特开2003-125783号公报、特开2004-000122号公报、特开2004-057195号公报、特开2004-305175号公报、特开2004-305176号公报、特开2006-129865号公报中所记载的突变蛋白酶。

[0070] 此外，不同的氨基酸序列之间的同源性根据Lipman-Pearson法(Science，Vol.227，pp.1435，(1985))计算。具体而言，通过使用由基因信息处理软件Genetyx-Win(Software Development Co.，Ltd.)开发的同源性分析(Search homology)程序，并将参数Unit Size to Compare(ktup)设置为2进行分析。

[0071] 此外，至于由与上述序列号2所示的氨基酸序列的同源性在80％以上的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶，按照例如上述Lipman-Pearson法的公知算法，通过比较序列号2所示的氨基酸序列和其他碱性蛋白酶的氨基酸序列之间的氨基酸序列，并且，使得每个碱性蛋白酶的氨基酸序列中所存在的保守氨基酸残基的同源性达到最大，从而能够确定与序列号2的位(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(g)和(i)中的每一个对应的氨基酸残基。无论氨基酸序列中的插入和缺失，通过使用这种方法来调整蛋白酶的氨基酸序列，能够确定每个碱性蛋白酶的氨基酸序列中的对应的氨基酸残基的位。假定对应的位位于三维空间的同一位置，并且位于同一位置的氨基酸残基对目标蛋白酶的特定功能产生类似的效果。

[0072] 具体而言，序列号2的194位的氨基酸残基是丝氨酸残基。通过采用上述方法，经过氨基酸序列的调整，能够确定对应位的氨基酸残基如下：蛋白酶E-1中的193位为丝氨酸残基，蛋白酶KP9860中的194位为丝氨酸残基，以及蛋白酶Ya中的193位为丝氨酸残基。

[0073] 至于上述优选的其他碱性蛋白酶，与蛋白酶PK43(序列号2)的氨基酸序列的(a)9位、(b)49位、(c)194位、(d)212位、(e)237位、(g)281位和(i)379位的氨基酸残基对应的位和氨基酸残基的具体例子在表1中显示。

[0074] 表1

[0075]

[0076] 此外，只要酶特性不改变，本发明的碱性蛋白酶的(a)位～(j)位等的氨基酸残基的选择包括从(a)位～(j)位等选择2个以上的位同时进行取代。

[0077] 当本发明的碱性蛋白酶是突变体时，突变前的碱性蛋白酶(可以称作“亲代碱性蛋白酶”)对应的是“由序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白酶”或“由与序列号2所示的氨基酸序列的同源性在80％以上的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶”。通过在该蛋白酶的目的位上引入突变，能够得到本发明的碱性蛋白酶。例如，用其他氨基酸残基来取代位于选自上述序列号2所示的蛋白酶KP43的氨基酸序列中的(a)位～(j)位的位的氨基酸残基，或者，取代位于选自由与序列号2所示的氨基酸序列的同源性在80％以上的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶的氨基酸序列中的上述(a)位、(b)位、(c)位、(d)位、(e)位、(g)位和(i)位的位的氨基酸残基，从而得到本发明的碱性蛋白酶。

[0078] 本发明的碱性蛋白酶可以通过例如下面的方法得到。具体而言，对编码亲代碱性蛋白酶的克隆基因(序列号1)引入突变，用所得到的突变基因转化为合适的宿主，然后培养前述的重组宿主，并从培养液中收集碱性蛋白酶。编码亲代碱性蛋白酶的基因的克隆可以通过常规的基因重组技术进行，例如根据WO99/18218和WO98/56927中记载的方法进行。

[0079] 为了将突变引入编码亲代碱性蛋白酶的基因，可以使用任意通常使用的定点突变方法。具体而言，可以使用例如Site-DirectedMutagenesis System Mutan-Super Express Km试剂盒(Takara Bio Inc.)。此外，也可以使用重组PCR(聚合酶链反应)法(PCR protocols，Academic Press，New York，1990)，用对应于前述目的序列的其他基因的序列来取代基因的目的序列。

[0080] 通过使用所得到的突变基因来生产本发明的蛋白酶的方法包括，例如将所述的突变基因与可稳定扩增的DNA载体相连，再用载体转化宿主菌，或将所述的突变基因导入可保持其稳定的宿主菌的染色体DNA上。上述内容是可以采用的方法的例子。满足上述条件的宿主包括，例如：属于芽孢杆菌、大肠杆菌、霉菌、酵母和放线菌的细菌。将这些菌株接种到含可同化碳源、氮源及其他必需营养元素的培养基中，按照公知的方法照常培养。

[0081] 按照常规的用于一般酶的提取和纯化的方法从所得到的培养液中收集并纯化碱性蛋白酶。例如，通过分离或过滤培养液，在除去菌体后，再利用常规的纯化方法从培养液的上清液中收集得到目标酶。由上述方法所得到的酶液可以不进行进一步处理而使用，也可以进一步用公知的方法进行纯化、结晶化、粉末化或颗粒化。

[0082] 本发明的碱性蛋白酶因此具有氧化剂耐性，对酪蛋白的分解活性不受高浓度脂肪酸的抑制，SDS-PAGE测得的分子量为43,000±2,000，在碱性环境下具有活性，发挥改善的去污力，并且表现出在工业上的充分的生产力。即，在天然存在的酶的情况下，该酶具有新获得的特性为：保持90％以上序列号2所示的蛋白酶KP43的蛋白质生产力，优选保持95％以上，或超过蛋白酶KP43的蛋白质生产力。此外，在突变体的情况下，该酶具有新获得的特性为：保持90％以上亲代酶的蛋白质生产力，优选保持95％以上，更优选获得超过或相当于亲代碱性蛋白酶的蛋白质生产力。

[0083] 因此，本发明的碱性蛋白酶作为配合到各种洗涤剂组合物中的酶而有效。

[0084] 配合到洗涤剂组合物中的本发明的蛋白酶的量，只要可以充分显示其活性，就没有限制。每kg洗涤剂组合物，蛋白酶的配合量为0.1～5000PU，从经济性等角度考虑优选为500PU以下。

[0085] 可将本发明的蛋白酶与各种酶一起应用于本发明的洗涤剂组合物中。例子包括水解酶、氧化酶、还原酶、转移酶、裂解酶、异构酶、连接酶和合成酶。其中，优选除本发明所使用的碱性蛋白酶以外的蛋白酶、纤维素酶、角蛋白酶、酯酶、角质酶、淀粉酶、脂肪酶、支链淀粉酶、果胶酶、甘露聚糖酶、葡糖苷酶、葡聚糖酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、漆酶等，特别优选蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶和脂肪酶。蛋白酶的例子包括市售的Alcalase、Esperase、Savinase、Everlase和Kannase(注册商标；Novozymes A/S公司)、Properase和Purafect(注册商标；Genencor International Inc.)、以及KAP(注册商标；花王公司)。纤维素酶包括Cellzyme和Carezyme(注册商标；Novozymes A/S公司)、KAC、在特开平10-313859号公报中记载的芽孢杆菌菌株KSM-S237所产生的碱性纤维素酶、特愿2002-116553号公报中记载的突变碱性纤维素酶(均为注册商标；花王公司)等。淀粉酶包括Termamyl和Duramyl(注册商标；Novozymes A/S公司)、Purastar(注册商标；Genencor International Inc.)、以及KAM(注册商标；花王公司)等。脂肪酶包括Lipolase和Lipolase Ultra(注册商标；Novozymes A/S公司)。

[0086] 当将本发明所使用的蛋白酶之外的蛋白酶并用于洗涤剂组合物中时，优选每kg洗涤剂组合物，蛋白酶的配合量为0.1～500PU。当并用纤维素酶时，基于特开平10-313859号公报中第[0020]段中记载的测定酶活性的方法而确定的单位(KU)，优选每kg洗涤剂组合物，纤维素酶的配合量为300～3000000KU。

[0087] 当并用淀粉酶时，基于特开平11-43690号公报第[0040]段中记载的测定淀粉酶活性的方法而确定的单位(IU)，优选每kg洗涤剂组合物，淀粉酶的配合量为50～500000IU。

[0088] 此外，当并用脂肪酶时，基于特表平8-500013号公报中的实施例1中记载的测定脂肪酶活性的方法而确定的单位(LU)，优选每kg洗涤剂组合物，脂肪酶的配合量为10000～1000000LU。

[0089] 可以向本发明的洗涤剂组合物中配合公知的洗涤剂组分，所述公知的洗涤剂组分包括如下。

[0090] (1)表面活性剂

[0091] 表面活性剂在洗涤剂组合物中的配合量为0.5～60重量％。特别地，对于粉末洗涤剂组合物和液体洗涤剂组合物，表面活性剂的添加量分别优选为10～45重量％和20～50重量％。当本发明的洗涤剂组合物为漂白剂或自动洗碟机用洗涤剂时，表面活性剂的配合量通常为1～10重量％，优选1～5重量％。

[0092] 本发明的洗涤剂组合物中所使用的表面活性剂的例子包括阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、两性表面活性剂和阳离子表面活性剂或其组合。优选阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂。

[0093] 阴离子表面活性剂的例子包括具有10～18个碳原子的醇硫酸盐、具有8～20个碳原子的醇烷氧基化硫酸盐、烷基苯磺酸盐、链烷烃磺酸盐、α-链烯烃磺酸盐、α-磺基脂肪酸盐、α-磺基脂肪酸烷基酯或脂肪酸盐。在本发明中特别优选具有烷基链的直链烷基苯磺酸盐，所述烷基链具有10～14个碳原子，更优选具有12～14个碳原子。作为抗衡离子，优选碱金属盐和胺、特别优选钠和/或钾、单乙醇胺、二乙醇胺。

[0094] 非离子表面活性剂的优选的例子包括聚氧化烯烷基(具有8～20个碳原子)醚、烷基聚葡糖苷、聚氧化烯烷基(具有8～20个碳原子)苯基醚、聚氧化烯失水山梨糖醇脂肪酸(具有8～22个碳原子)酯、聚氧化烯二醇脂肪酸(具有8～22个碳原子)酯、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段聚合物。特别优选的非离子表面活性剂是聚氧化烯烷基醚(Griffin法计算得到的HLB值的范围为10.5～15.0，优选为11.0～14.5)，其中，例如环氧乙烷和环氧丙烷的环氧烷烃以4～20摩尔的量和具有10～18个碳原子的醇加成。

[0095] (2)二价金属离子捕捉剂

[0096] 二价金属离子捕捉剂的配合量为0.01～50重量％，优选为5～40重量％。本发明的洗涤剂组合物中所用的二价金属离子捕捉剂的例子包括缩聚磷酸盐，例如三聚磷酸盐、焦磷酸盐和正磷酸盐；铝硅酸盐，例如沸石；合成层状结晶硅酸盐；次氮基三乙酸盐；乙二胺四乙酸盐、柠檬酸盐、异柠檬酸盐、聚缩醛羧酸盐等。其中，特别优选结晶铝硅酸盐(合成沸石)，在A型、X型、P型沸石中，特别优选A型沸石。作为合成沸石，优选初级粒子的平均粒径为0.1～10μm的合成沸石，更优选初级粒子的平均粒径为0.1～5μm的合成沸石。

[0097] (3)碱剂

[0098] 碱剂的配合量为0.01～80重量％，优选为1～40重量％。用于粉末洗涤剂的碱剂的例子包括统称为重质纯碱(dense soda ash)和轻质纯碱(light soda ash)的碱金属碳酸盐，例如碳酸钠，以及无定形碱金属硅酸盐，例如JIS No.1、No.2和No.3。这些无机碱剂在洗涤剂干燥时对颗粒的骨架成形起作用，因而可以提供相对硬的流动性良好的洗涤剂。除此之外的碱剂的例子还包括倍半碳酸钠和碳酸氢钠。此外，磷酸盐，例如三聚磷酸盐也具有碱剂的活性。用于液体洗涤剂的碱剂的例子包括上述碱剂、氢氧化钠、单乙醇胺、二乙醇胺或三乙醇胺。它们也可以用作活化剂的抗衡离子。

[0099] (4)再污染抑制剂

[0100] 再污染抑制剂的配合量为0.001～10重量％，优选为1～5重量％。用于本发明的洗涤剂组合物的再污染抑制剂的例子包括聚乙二醇、羧酸类聚合物、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。其中，羧酸类聚合物具有抑制再污染的能力、捕获金属离子的能力、使固体颗粒污渍从衣料分散到洗涤液中的效果。羧酸类聚合物是丙烯酸、甲基丙烯酸、衣康酸等的均聚物或共聚物。作为共聚物，优选由上述单体和马来酸共聚而成，其分子量为几千～十万。除上述羧酸类聚合物之外，聚缩水甘油酸盐等的聚合物、例如羟甲基纤维素的纤维素衍生物、以及例如聚天冬氨酸的氨基羧酸类聚合物由于其具有用作金属离子捕捉剂、分散剂的能力以及具有抑制再污染的能力，因而优选。

[0101] (5)漂白剂

[0102] 例如过氧化氢和过碳酸盐的漂白剂的配合量优选为1～10重量％。当使用漂白剂时，可以添加0.01～10重量％的漂白活化剂(活化剂)，例如四乙酰乙二胺(TAED)以及特开平6-316700号公报中记载的漂白活化剂(活化剂)等。

[0103] (6)荧光增白剂

[0104] 作为用于本发明的洗涤剂组合物的荧光增白剂，可以使用联苯型荧光增白剂(例如Tinopal CBS-X)和茋型荧光增白剂(例如如DM型荧光染料)。荧光增白剂的配合量优选为0.001～2重量％。

[0105] (7)其他组分

[0106] 在本发明的洗涤剂组合物中，还可以含有衣料用洗涤剂领域所公知的增洁剂、软化剂、还原剂(如亚硫酸盐)、抑泡剂(如硅酮)、香料以及其他添加剂。

[0107] 本发明的洗涤剂组合物可按照常规的方法通过组合使用经上述方法获得的本发明的蛋白酶与上述公知的洗涤剂组分而制造得到。洗涤剂的形态可根据其使用目的来选择。例如包括液体、粉末、颗粒、糊剂和固体。

[0108] 由此得到的本发明的洗涤剂组合物可用作衣料洗涤剂、漂白剂、硬质表面清洁用洗涤剂、管道洗涤剂、义齿洗涤剂、医疗器械用杀菌洗涤剂。

[0109] 实施例

[0110] 下面，结合具体例子对本发明进行更详细的说明。

[0111] 实施例1

[0112] 对来自芽孢杆菌KSM-KP43(序列号1)的碱性蛋白酶结构基因的包含直到终止密码子的大约2.0kb的区域，设计引物在成熟酶区域的(1)9位、(2)49位、(3)194位、(4)212位、(5)237位、(6)245位、(7)281位、(8)313位、(9)379位和(10)427位引入定点突变。

[0113] 使用下列引物分别进行PCR。

[0114] (1)引物1(序列号3)和引物3(序列号5)以及引物4(序列号6)和引物2(序列号4)，在9位引入谷氨酰胺；

[0115] (2)引物1(序列号3)和引物5(序列号7)以及引物6(序列号8)和引物2(序列号4)，在49位引入谷氨酰胺；

[0116] (3)引物1(序列号3)和引物7(序列号9)以及引物8(序列号10)和引物2(序列号4)，在194位引入赖氨酸；引物1(序列号3)和引物7(序列号9)以及引物9(序列号11)和引物2(序列号4)，在194位引入精氨酸；

[0117] (4)引物1(序列号3)和引物10(序列号12)以及引物11(序列号13)和引物2(序列号4)，在212位引入精氨酸；引物1(序列号3)和引物10(序列号12)以及引物12(序列号14)和引物2(序列号4)，在212位引入天冬酰胺；引物1(序列号3)和引物10(序列号12)以及引物13(序列号15)和引物2(序列号4)，在212位引入谷氨酰胺；

[0118] (5)引物1(序列号3)和引物14(序列号16)以及引物15(序列号17)和引物2(序列号4)，在237位引入天冬酰胺；

[0119] (6)引物1(序列号3)和引物14(序列号16)以及引物16(序列号18)和引物2(序列号4)，在245位引入天冬酰胺；

[0120] (7)引物1(序列号3)和引物17(序列号19)以及引物18(序列号20)和引物2(序列号4)，在281位引入精氨酸；

[0121] (8)引物1(序列号3)和引物19(序列号21)以及引物20(序列号22)和引物2(序列号4)，在313位引入天冬酰胺；

[0122] (9)引物1(序列号3)和引物21(序列号23)以及引物22(序列号24)和引物2(序列号4)，在379位引入赖氨酸；引物1(序列号3)和引物21(序列号23)以及引物23(序列号25)和引物2(序列号4)，在379位引入精氨酸；引物1(序列号3)和引物21(序列号23)以及引物24(序列号26)和引物2(序列号4)，在379位引入天冬氨酸；引物1(序列号
3)和引物21(序列号23)以及引物25(序列号27)和引物2(序列号4)，在379位引入谷氨酸；以及

[0123] (10)引物1(序列号3)和引物26(序列号28)以及引物27(序列号29)和引物2(序列号4)，在427位引入精氨酸。

[0124] 在引物1的有意义链的5′端加上BamHI连接子，在引物2的反义链的5′端加上XbaI连接子。引物3和引物4、引物5和引物6、引物7和引物8、引物7和引物9、引物10和引物11、引物10和引物12、引物10和引物13、引物14和引物15、引物14和引物16、引物17和引物18、引物19和引物20、引物21和引物22、引物21和引物23、引物21和引物24、引物21和引物25、引物26和引物27被分别设计成在5′端具有10～15-bp的序列互补。在PCR中，模板DNA在94℃下变性2分钟后，使用Pyrobest(Takara Bio Inc.)作为DNA聚合酶，进行30个处理循环，每个循环是在94℃下1分钟，在55℃下1分钟，以及在72℃下1分钟。用PCR产物纯化试剂盒(Roche Ltd.)纯化扩增的DNA片段。随后，进行重组PCR，其中在94℃下进行变性2分钟后，分别只对相应的扩增片段进行30个处理循环，每个循环是在94℃下1分钟，在55℃下1分钟，以及在72℃下1分钟。对于获得的扩增片段，采用引物1和引物4进行PCR。在PCR中，模板DNA在94℃下变性2分钟后，进行30个处理循环，每个循环是在94℃下1分钟，在55℃下1分钟，以及在72℃下2分钟。结果，得到引入突变的全长基因。在纯化扩增片段后，用BamHI和XbaI(Roche Ltd.)裂解连接到末端的限制性内切酶连接子。混合扩增DNA片段和经BamHI和XbaI处理的质粒pHA64(日本专利No.349293，BamHI-裂解位和XbaI-裂解位包含在启动子64的下游区域)，然后，用Ligation High(Toyobo Co.，Ltd.)进行连接反应。通过乙醇沉淀，从反应混合物中回收质粒，并以此转化作为宿主菌的芽孢杆菌KSM-9865株(FERMP-18566)。

[0125] 9865菌株的转化体在含有脱脂牛奶的碱性琼脂培养基(脱脂牛奶(Difco Laboratories)1％(w/v)、细菌胰蛋白胨(bactotryptone)(DifcoLaboratories)1％、酵母提取物(Difco Laboratories)0.5％、氯化钠1％、琼脂1.5％、碳酸钠0.05％、以及四环素15ppm)中繁殖。根据晕圈形成的情况判断是否导入了突变蛋白酶基因。将转化体接种到
5ml种子培养基中(多聚蛋白胨S(polypeptone S)6.0％(w/v)、酵母提取物0.05％、麦芽糖1.0％、7水硫酸镁0.02％、磷酸二氢钾0.1％、碳酸钠0.25％、以及四环素30ppm)后，在
30℃下振荡培养16小时。然后将种子培养肉汤(1％(v/v))接种到30ml的主培养基(多聚蛋白胨8％、酵母提取物0.3％、麦芽糖10％、7水硫酸镁0.04％、磷酸二氢钾0.2％、无水碳酸钠1.5％、以及四环素30ppm)中，随后在30℃下振荡培养3天。

[0126] 将所得到的培养液进行离心分离，并用蛋白分析试剂盒(WakoPure Chemical Industries，Ltd.)测定蛋白质的量。通过比较从带有亲代酶基因的转化体的培养液的培养上清液获得的测量值，其中，培养是在相同的培养条件下进行的，从而评价突变蛋白酶基因的生产力(表2)。表3显示了对获得的酶液在pH 10和pH 10.5下的去污力评价的结果。

[0127] 这证明：上述本发明的突变碱性蛋白酶除了改善去污力之外，还具有亲代碱性蛋白酶的特性。具体而言，其具有氧化剂耐性，对酪蛋白的分解活性不受高浓度脂肪酸的抑制，SDS-PAGE测得的分子量为43,000±2,000，并且在碱性区域具有活性。

[0128] 测定蛋白酶活性的方法(酪蛋白法)

[0129] 1ml含1％(w/v)酪蛋白(Hammerstein法：Merck Inc.)的50mM硼酸盐缓冲溶液(pH 10.5)在30℃下保持5分钟后，添加0.1ml的酶液引发反应。反应15分钟后，加入2ml的反应终止液(0.11M三氯乙酸/0.22醋酸钠/0.33M醋酸)。混合物在室温下静置30分钟。随后，用Whattmann No.2号滤纸过滤沉淀物。根据Lowry等人的方法对降解产物进行定量。具体而言，向0.5ml的滤液中加入2.5ml的碱性铜溶液(罗谢尔盐1％；5水硫酸铜1％；2％碳酸钠/0.1N氢氧化钠＝1∶1∶100)，并将该溶液在30℃下保持10分钟后，加入0.25ml苯酚试剂(市售的苯酚试剂(Kanto Chemical Co.，Inc.)用去离子水稀释两倍而成的溶液)并充分搅拌。在30℃下静置30分钟后，将该溶液在660nm下进行吸光度测定。蛋白酶的一个单位(1PU)被定义为，在上述反应条件下，每分钟内生成相当于1mmol酪氨酸的酸溶蛋白质所需的酶量。

[0130] 相对去污率

[0131] 使用Terg-O-Tometer(Ueshima Seisakusho Co.，Ltd.)评价突变酶的去污力。制备市售的衣料用洗涤剂的溶液，使其达到规定的使用浓度，并根据需要加入10％(w/v)的硫酸或10N氢氧化钠以调整pH。添加酶至最终浓度为40mPU/l。除非另有说明，将切成6×6cm的试验布EMPA117(EMPA Testmaterialen，血液/牛奶/碳黑)投入其中，并在
20℃下以80rpm进行洗涤。用自来水漂洗后，用色度计(KonicaMinolta Holdings，Inc.，CM3500d)测定亮度。基于洗涤前后的亮度变化来计算去污率(以下公式)。

[0132] 去污率(％)＝(L2-L1)/(L0-L1)×100

[0133] L0：试验布的原始布的亮度

[0134] L1：洗涤前试验布的亮度

[0135] L2：洗涤后试验布的亮度

[0136] 相对去污率根据以下公式计算得到。

[0137] 相对去污率(％)＝(突变酶的去污率-没有酶的洗涤液的去污率)/(亲代酶的去污率-没有酶的洗涤液的去污率)×100

[0138] 表2

[0139]相对蛋白质生产力(％)
K9Q 95
K49Q 94
S194K 110
S194R 105
K212R 108
K212N 98
K212Q 112
D237N 95
D245N 94
K281R 91
D313N 103
Q379K 100
Q379R 101
Q379E 97
Q379D 98
T427R 101
亲代酶 100

[0140] 表3

[0141]