SLIM-1在心力衰竭评估中的用途转让专利
申请号 : CN200880007195.5
文献号 : CN101627306B
文献日 : 2014-02-05
发明人 : U·-H·韦恩休斯-塞伦 , D·布洛克 , A·厄米利 , V·方 , A·格拉莫利尼 , G·赫斯 , H·休迪格 , R·伊瑟林 , T·基斯林杰 , P·刘 , D·麦克伦南 , H·冯德埃尔茨
申请人 : 霍夫曼-拉罗奇有限公司 , 多伦多大学董事局
摘要 :
本发明涉及一种体外评估心力衰竭的方法，包括步骤：测量在样品中标识物SLIM-1的浓度，任选地测量样品中一种或更多种其他心力衰竭标识物的浓度，并通过将测定的SLIM-1浓度和对于所述任选的一种或更多种其他标识物测定的浓度与参考群体中确定的这个标识物或这些标识物的浓度进行比较来评估心力衰竭。同时也公开了SLIM-1作为标识物蛋白用于评估心力衰竭的用途，包括SLIM-1的标识物组合和用于测量SLIM-1的试剂盒。
权利要求 :
1.特异性测定标识物SLIM-1蛋白需要的试剂在制备用于评估个体心力衰竭的试剂盒中的用途，其中所述试剂盒进一步包含特异性测定任选地心力衰竭的一种或更多种其他标识物需要的试剂，并且所述试剂盒用于包括以下步骤的方法：a)测量从所述个体获得的样品中标识物SLIM-1蛋白的浓度，
b)任选地测量所述样品中心力衰竭的一种或更多种其他标识物的浓度，和c)通过将在步骤(a)中测定的浓度以及任选地步骤(b)中测定的浓度与对照样品中确定的这种标识物或这些标识物的浓度比较来评估心力衰竭；
其中所述样品选自血清、血浆以及全血；所述一种或更多种其他标识物选自利尿钠肽标识物、心脏肌钙蛋白标识物以及炎症标识物；所述炎症标识物选自白介素-6、C-反应蛋白、血清淀粉样蛋白A和S100蛋白。
2.根据权利要求1的用途，其进一步的特征是所述利尿钠肽标识物是NT-proBNP。
3.根据权利要求1的用途，其进一步的特征是所述心脏肌钙蛋白标识物是肌钙蛋白T。
说明书 :
SLIM-1在心力衰竭评估中的用途
发明领域
[0001] 本发明涉及一种评估个体心力衰竭的方法，包括步骤：a)测量从个体获得的样品中标识物SLIM-1的浓度，b)任选地测量样品中一种或更多种其他的心力衰竭标识物的浓度，并通过比较步骤(a)中确定的浓度以及任选地在步骤(b)中确定的浓度与对照样品中确立的该标识物或这些标识物的浓度，来评估心力衰竭。此外还公开SLIM-1作为标识物蛋白在评估心力衰竭中的用途，包括SLIM-1的标识物组合，以及用于测量SLIM-1的试剂盒。
[0002] 发明背景
[0003] 心力衰竭(HF)是一种主要的并日趋严重的公共卫生问题。例如，在美国，大约5百万患者患有HF并且每年超过550000患者被首次诊断为HF(引自美国心脏协会，心脏病和中风统计：更新至2005年，达拉斯、德克萨斯；美国心脏协会(2005))。类似的美国统计表明对于每年1200万至1500万个诊所就诊和650万个住院病例，HF是主要原因。从1990至1999年，每年以HF作为主要诊断结论住院治疗的患者数量从大约81万增长至超过100万，以HF作为主要或第二诊断结论的人数从240万增至360万。在2001年，接近53000名患者死于HF作为主因的疾病。心力衰竭主要是老年人的状况，因此普遍认为“人群的老龄化”也促使HF发生率增加。在年龄大于65岁的人群中HF的发生率每1000人近10人。仅仅在美国，2005年由HF引起的直接和间接损失总共估计约$279亿，并且每年在治疗HF的药物上花费大约$29亿(参照上述引用的AHA-统计数据)。
[0004] 心力衰竭
[0005] 心力衰竭的特征是心脏泵出身体所需血液的量的能力的丧失。衰竭不是意味心脏停止泵送，而是指不能如其应该的那样有效地泵出血。
[0006] NYHA[纽约心脏协会]和ACC/AHA[美国心脏病学协会/美国心脏协会]都建立了HF的功能分类以判断该疾病的进程。NYHA分类方案有四类疾病状态：类别1为在任何程度的行为下无症状，类别2为在重体力行为下有症状，类别III和IV分别在轻度行为和无行为下有症状。
[0007] 在四阶段的ACC/AHA方案中，阶段A为无症状但有发展HF的危险。阶段B有心脏功能紊乱的证据而无症状。在阶段C中，有心脏功能紊乱的证据并伴有症状。在阶段D中，受试者尽管受到最大程度的治疗但仍有症状。
[0008] HF的病原学
[0009] 在医学上，必须将心力衰竭(HF)理解为一种复合病。它可能由触发事件的出现所引起，比如心肌梗死(心脏病发作)，或者是其他病因的后续，比如高血压、糖尿病或心脏畸形例如心瓣病。心肌梗死或其他的HF病因导致心脏泵送能力的初始减退，例如通过损坏心肌引起。由于一种或更多种代偿机制的活化，这种泵送能力的减退可能不会立刻被注意。但是，已经发现HF的进展与患者的血液动力状态无关。因此，由疾病所引起损害性变化已经出现并发展，而患者甚至仍无症状。事实上，在HF早期过程中维持正常心血管功能的代偿机制可能实际上最终促进了疾病的进展，例如对心脏和它的容量施加有害作用以维持循环中充足的血流水平。
[0010] 一些发生在HF期间的更重要的病理生理变化有(i)下丘脑-垂体-肾上腺轴的活化，(ii)全身性内皮功能紊乱和(iii)心肌重塑。
[0011] (i)专门针对拮抗下丘脑-垂体-肾上腺轴活化的治疗包括β-肾上腺素能阻滞剂(B阻滞剂)、血管紧张素转变酶(ACE)抑制剂、某些钙通道阻滞剂、硝酸盐和内皮素-1阻滞剂。钙通道阻滞剂和硝酸盐虽然产生临床改善，却没有明确显示出能延长生存期，而作为醛甾酮拮抗药，B阻滞剂和ACE抑制剂已经表现出了明显的延长寿命的作用。使用内皮素-1阻滞剂的实验研究也已展示出有用的效果。
[0012] (ii)全身性内皮功能紊乱是HF的一种公知特征，在左心室功能紊乱体征出现时会明显表现。内皮功能紊乱对于心肌微循环与心脏肌细胞的密切关系十分重要。该迹象暗示微血管功能紊乱对于肌细胞功能紊乱以及导致进行性心肌衰竭的形态学变化有明显作用。
[0013] 依据潜在的病理生理学，有迹象暗示内皮功能紊乱可能由NO的相对缺乏所引起，而NO的相对缺乏可以归结为依赖NADH氧化酶引起的血管O2生成增加和随后的NO过度清除。潜在的提高O2生成的作用因子包括升高的交感紧张性、新肾上腺素、血管紧张素II、内皮素-1和TNF-α。此外，相对于TNF-α的水平，一种关键的抗炎性细胞因子IL-10的水平显示不相称的低。现在人们认为TNF-α与相关的促炎性细胞因子包括IL-6和可溶性TNF-α受体的水平升高，通过降低心肌收缩性、双心室膨大、血压过低而在HF的发展中发挥重要作用，并且可能涉及内皮细胞活化和功能紊乱。同时对于至今仍不可解释的在严重HF患者中肌肉消瘦现象，人们认为TNF-α也可能在其中发挥作用。在对少数患者使用可溶性TNF受体进行治疗的初步研究中，通过对生活质量指数的测量，表明有助于改善NYHA功能分类和患者健康。
[0014] (iii)心肌重塑是一个复杂过程，伴随着从无症状向有症状的心力衰竭转变，并可被描述成心肌层内的一系列适应性改变，像心室形状、质量和体积的改变(Piano，M.R. 等，J.Cardiovasc.Nurs.14(2000)1-23，quiz119-120；Molkentin，J.D.，Ann.Rev.Physiol.63(2001)391-426)。心肌重塑的主要内容是肌细胞生物学的改变，如肌细胞肥大，因为坏死或细胞程序性死亡而引起的肌细胞损失，细胞外基质的改变和左心室腔的几何学改变。现在还不清楚心肌重塑是否只是暴露于长时间神经激素刺激产生的毒性效应数年之后发生的终末器官效应，或者是否心肌重塑独立地促使心力衰竭的进展。迄今证据暗示适当的治疗可以减缓或停止心肌重塑的进展。
[0015] 标识物和疾病状态
[0016] 如上所述，肌细胞肥大可能代表发展至HF的最初步骤之一。肌细胞肥大的特征为某些编码收缩蛋白的基因，如p-肌球蛋白重链和肌钙蛋白T(TnT)，和一些非收缩蛋白，如A型和B型利尿钠肽的表达升高，同时还有细胞体积增加和细胞骨架变化(Piano，M.R. 等，J.Cardiovasc.Nurs.14(2000)1-23，quiz 119-120；Molkentin，J.D.，Ann.Rev.Physiol.63(2001)391-426)。
[0017] 对于人类和动物模型心力衰竭的研究表明心力衰竭的后期阶段肌细胞功能降低。现已暗示肌细胞功能紊乱的机制涉及钙处理网络、肌微丝和细胞支架的改变(de Tombe，P.P.，Cardiovasc.Res.37(1998)367-380)。例如，在心力衰竭的人类和动物模型中，肌浆网钙-三磷酸腺苷酶的酶活性降低，而肌膜Na+/Ca 2+交换器的mRNA和蛋白水平都增加。而且，在心力衰竭的人类和动物模型中都具有TnT的同种型转换、肌钙蛋白I(TnI)磷酸化减少、肌纤维肌动球蛋白三磷酸腺苷酶活性降低和微管形成增加。
[0018] 最开始，导致心肌重塑的心脏改变意味着补偿心肌层病变部分以维持身体对氧和营养物的需要。但是，心力衰竭的代偿期是有限的，于是在最后，衰竭的心脏不能维持足够满足身体需求的心输出量。于是有从代偿期向代偿失调期的转变。在代偿失调期内，心脏中的变化级联效应会持续但不再有利，使患者进入心力衰竭进程直到慢性状态并最终死亡。
[0019] 根据“ACC/AHA 2005成年人慢性心力衰竭的诊断和管理的更新指南”(S.Hunt等，www.acc.org＝ACC/AHA实践指南)，在心力衰竭范围内该疾病现在被分为四个阶段，如上所述。在阶段A和B，会发现个体处于心力衰竭发展的危险中，而阶段C和D表示这些患者组显示了心力衰竭的体征和症状。A至D不同阶段的详细定义如上述参考资料所示，此处通过援引包括入。
[0020] 心力衰竭的诊断方法
[0021] 评价HF患者唯一最有效的诊断试验是全面的2维超声心电图联同多普勒流量研究，以确定是否心肌层、心脏瓣膜或心包出现异常，涉及哪些腔室。必须考虑三个基本问题：1)LVEF是维持还是减少，2)LV结构是正常还是异常，3)是否还有其他可以解释临床表现的结构异常，如瓣膜、心包或右心室的异常？该信息应该由EF的数值预期、心室尺度和/或体积的测量、壁厚度的测量和腔室的几何结构以及局部室壁活动的评价来量化。应该评估右心室的大小以及收缩性能。此外还应该半定量地确定心房的大小并测量左心房的尺度和/或体积。
[0022] 对于EF保持或减少的患者来说，在进行超声波心动描记术时获得的非侵袭性血液动力学数据是重要的附加关联。综合二尖瓣输入模型、肺静脉输入模型和二尖瓣环流速的组合定量提供了关于LV充盈和左房压特征的数据。三尖瓣回流梯度的评定联同测量下腔静脉的尺度和它在呼吸过程的反应可提供对收缩肺动脉压和中心静脉压的估算。
[0023] 心搏量可以联合尺度测量和LV流出道的脉冲多普勒加以确定。但是，在没有HF时这些参数的任何一项都可能出现异常。所有的参数都不是与HF有必然的特异关联；然而总体正常的充盈模型可排除临床HF。
[0024] 一种临床观点认为，该疾病在代偿和早期的代偿失调期无临床症状(阶段A完全无症状，阶段B有结构上的心脏病变但没有HF的体征和症状，参考ACC/AHA实践指南)。直到彻底进入代偿失调期(即依照ACC/AHA指南的阶段C和D)疾病的外部体征(如气促)才会出现。现行的诊断方式基于阶段C和D的患者的外部症状。
[0025] 一般地，使用能影响心力衰竭特异机制的药物对心力衰竭患者进行标准治疗。没有诊断性试验可以可靠地反映那些特异机制并帮助医师为适当的患者选择适当的药物(和剂量)(例如，ACE抑制剂、AT II、β阻滞剂等等)。
[0026] 用标识物预诊断HF
[0027] 仅由生化标识物对具有心力衰竭风险的患者进行早期评估是可能的，因为有发展心力衰竭风险的个体在那个阶段是仍然没有HF临床症状的。现在尚无确定的生化标识物能在该疾病症状发生前进行可靠鉴定。现在到诊断出HF的时候，这个疾病已经有了深度发展。
[0028] 近年来利尿钠肽家族，尤其是心房利尿钠肽家族和脑利尿钠肽家族被证明在评估HF中有重要价值。
[0029] HF的预后和需求
[0030] 至少部分因为滞后的诊断，50％的HF患者在诊断后两年之内死亡。5年生存率小于30％。急切需要一种辅助心力衰竭早期诊断的新生化标识物。
[0031] 在心力衰竭风险个体，即，无心力衰竭临床症状的个体的早期评估中的改进是被证明是正确的(warranted)。
[0032] 最近几年确立了以B型利尿钠肽标识物作为一种很好的手段来监测HF患者的疾病进程并评估他们心脏血管并发症，如心脏病发作的风险。
[0033] 然而，对于其他很多方面的诊断单一的标识物是不够的。
[0034] NT-proBNP的低值对于HF或LVD的排除具有很高的阴性预测值，在上述的和其他的研究(参考：Triepels R.H.，等Clin.Chem.49，Suppl.(2003)A37-38)中心力衰竭的阳性预测值已经发现在50-60％的范围内。因此一种用于评估个体心力衰竭风险的标识物具有很高的临床/实际重要性，它独立地对于HF具有高的阳性预测值，或者协同NT-proBNP并且与单独的NT-proBNP比较起来对于HF具有更好的阳性预测值。
[0035] 为了使这个重要并急需的临床诊断领域取得更深远的技术进步，一种辅助评估心力衰竭患者的标识物意义重大。
[0036] 发明概述
[0037] 现在人们发现并确定了标识物SLIM-1能辅助评估心力衰竭。在一个实施方式中它可以有助于评估个体是否具有发展心力衰竭的风险。在进一步的方面中，它可以辅助评估疾病的进展。在另一个实施方式中，它可以辅助预测心力衰竭的发作。在另一个实施方式中，它能辅助评估并选择一种适当的治疗方案以预防或治疗心力衰竭。
[0038] 在此公开的是一种评估个体心力衰竭的方法，包括步骤：测量从该个体获得的样品中标识物SLIM-1的浓度，任选地测量样品中一种或更多种其他心力衰竭标识物的浓度，通过将SLIM-1的浓度和任选地一种或更多种其他标识物的浓度与对照样品中确定的该标识物或这些标识物的浓度进行比较来评估心力衰竭。
[0039] 该发明也涉及蛋白SLIM-1作为标识物分子在心力衰竭评估中的用途。
[0040] 还公开了包括SLIM-1和一种或更多种其他心力衰竭标识物的标识物组合在评估心力衰竭中的用途。
[0041] 同时提供试剂盒，其用于进行体外评估心力衰竭的方法，该方法包括步骤：测量样品中标识物SLIM-1的浓度，任选地测量样品中一种或更多种其他的心力衰竭标识物的浓度，通过将SLIM-1的浓度和任选地一种或更多种其他标识物的浓度与参考群体中确定的该标识物或这些标识物的浓度进行比较以评估心力衰竭，该试剂盒包括特异性测定SLIM-1需要的试剂和任选地特异性测定所述一种或更多种其他心力衰竭标识物的需要的试剂。
[0042] 本发明其他方面和优点将通过随后的描述而变得明显。然而应该明白，当指本发明优选实施方式时，仅是以例示方式提供详细描述和特定实施例，因为从该详细描述中在本发明精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员将是明显的。
[0043] 发明详述
[0044] 在第一个实施方式中，本发明涉及一种评估个体心力衰竭的方法，包括步骤：a)测量从该个体获得的样品中标识物SLIM-1的浓度，b)任选地测量样品中一种或更多种其他心力衰竭标识物的浓度，c)通过将步骤(a)中确定的浓度和任选地步骤(b)中确定的浓度与对照样品中确定的该标识物或这些标识物的浓度比较以评估心力衰竭。
[0045] 如在此使用的，下列每一个术语都具有与在本节中的它相关的意义。
[0046] 在此使用的冠词“一”是指一或超过一(即至少一)的该冠词的语法客体。例如，“一种抗体”表示一种抗体或一种以上的抗体。
[0047] “一或更多”表示1至50个，优选1到20，也优选2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或15。
[0048] 在此使用的术语“标识物”或“生化标识物”指一种分子，该分子作为用于分析患者的测试样品的靶标。在一个实施方式中，这些分子靶标的实例是蛋白质或多肽。在本发明中用作标识物的蛋白或多肽预计包括所述蛋白天然存在的片段，特别是免疫学可检测的片段。免疫学可检测的片段优选包含所述标识物多肽的至少6、7、8、10、12、15或20个连续氨基酸。本领域技术人员将认识到细胞释放的蛋白或细胞外基质中存在的蛋白会被损坏，比如在炎症阶段，并且可被降解或者裂解成这样的片段。某些标识物以非活性的形式合成，随后可能通过蛋白水解被活化。本领域技术人员应理解，蛋白质或其片段也可以作为复合物的一部分存在。这些复合物也可能用作本发明意义上的标识物。此外，或可选的，标识物多肽可以带有翻译后修饰。翻译后修饰的实例有糖基化、酰化和/或磷酸化等等。
[0049] 术语“评估心力衰竭”是指按照本发明的方法将辅助医师评估个体是否具有发展心力衰竭的风险，或辅助医师在HF诊断相关的一个或几个其他的领域评估HF患者。评估HF个体优选的诊断相关领域为心力衰竭的分期、急性和慢性心力衰竭的鉴别诊断、判断疾病进程的风险、指导选择适当的药物、治疗反应的监视和随访HF患者。
[0050] 本发明意义上的“心力衰竭标识物”是任何标识物，如果该标识物与标识物SLIM-1相结合能为研究中的诊断疑难增加HF评估的相关信息。对评估HF而言，将所述标识物纳入一种已包含标识物SLIM-1的标识物组合，如果在给定特异性下的敏感性或如果在给定敏感性下的特异性可被分别提高，该信息被认为是相关的或具有附加价值。优选地，在敏感性或特异性方面的提高分别是统计学上显著的，具有p＝0.05、0.02、0.01或更小的显著性水平。优选地，一种或更多种心力衰竭的其他标识物选自利尿钠肽标识物、心脏肌钙蛋白标识物和炎症标识物。
[0051] 在此使用的术语“样品”指一种为了进行体外评价而获取的生物样品。在本发明方法中，样品或患者样品优选地可包含任何体液。优选的试验样品包括血液、血清、血浆、尿液、唾液和关节液。优选样品是全血、血清、血浆或关节液，血浆或血清是最方便的样品种类。技术人员将会知道，任何这样的评估在体外进行。然后丢弃患者样品。患者样品仅仅用于本发明的体外方法并且患者样品中的物质不会回输给患者身体。一般地，样品是液体样品，例如，全血、血清或血浆。
[0052] “将……浓度与对照样品中确定的浓度进行比较”的表述仅用于进一步的举例对于技术人员来说显而易见的内容。对照样品可以是内部对照或外部对照样品。在一个实施方式中，使用内部对照样品，即在受试样品中评估标识物水平，并在取自于同一个受试者的一个或更多个其他样品中也评估该标识物水平以确定所述标识物水平是否有任何的变化。在另一个实施方式中，使用外部对照样品。对于外部对照样品，来自该个体的样品中标识物的存在或数量将与另一个体中该标识物的存在或数量进行比较，后者个体已知正患有或已知具有某种给定状况的风险，或者个体已知没有给定状况，即“正常个体”。例如，在患者样品中的标识物水平可与HF中与特定病程有关的已知水平相比较。通常，样品标识物水平直接或间接与诊断相关，并且例如该标识物水平用于确定个体是否具有HF的风险。可选择地，例如，样品的标识物水平可以与已知与在HF患者治疗时的反应、急性和慢性心力衰竭鉴别诊断、选择适当的药物治疗HF的指导、鉴别疾病进展风险或随访HF患者有关的标识物水平相比较。根据计划的诊断用途，选择适当的对照样品并且确定其中标志物的对照或参考值。技术人员将理解在一个实施方式中这些对照样品是从参考群体获得的，该群体年龄匹配并且没有混杂的疾病。同时技术人员明了，在对照样品中确定的标识物绝对值将由所用的试验方法决定。优选从来自于适当参考群体的100位明确表征的个体的样品被用于确定对照(参考)值。还优选的是，参考群体也可以被选择由20、30、50、200、500或1000个个体组成。健康个体代表优选的参考群体以确定对照值。在一个实施方式中，对照样品是内部对照样品。该实施方案中的系列样品来自接受研究的个体，并且比较标识物水平。
[0053] 从来自个体的样品测定的SLIM-1的提高的值是心力衰竭的指示。
[0054] 对照组或对照群体中测得的SLIM-1值用于例如确定截止值或参考范围。高于该截止值或超出参考范围和高端点的数值被认为是升高了。
[0055] 在一个实施方式中，固定的截止值被确定。选定该截止值以符合感兴趣的诊断问题。
[0056] 在一个实施方式中，从对照组或对照群体中测量的SLIM-1值用于确定参考范围。在优选的实施方式中，如果测量值高于参考范围的90％，SLIM-1浓度被认为升高。在进一步优选的实施方式中如果测量值高于参考范围的95％、96％、97％或97.5％，SLIM-1浓度被认为升高。
[0057] 在一个实施方式中，对照样品为内部对照样品。在该实施方式中，从研究的个体中获得系列样品并比较标识物水平。这样可能对于比如评价治疗效果是有用的。
[0058] 按照本发明的方法基于从个体获得的液体样品，并基于这些样品中的SLIM-1测量。在此使用的“个体”指单个人类或非人类生物体。因此在此描述的方法和组合物可应用到人类和动物疾病。优选的个体是人。
[0059] SLIM蛋白，特别是SLIM-1
[0060] SLIM-1、SLIM-2、SLIM-3的蛋白序列各自包括4个完整的LIM结构域和第五个LIM结构域的后半部分(FHL，四个半LIM蛋白)。SLIM-1分子量为36kD，由280个氨基酸组成(参见：SEQ ID NO：1)。
[0061] 最初，LIM蛋白家族的命名源于首次发现LIM序列的三个经鉴定的转录因子的首 字 母：lin-11(Freyd，G. 等 .，Nature 344(1990)876-879)、isle(Karlsson，O.等，Nature 344(1990)879-882) 和 mec-3(Way，J.C. 和 Chalfie，M.，Cell 54(1988)5-16)。LIM蛋白涉及大量的细胞功能，例如转录、癌转化、信号转导和细胞粘附。由于LIM结构域包含锌指结构，这可以通过蛋白-蛋白相互作用来实现。LIM结构域可以与其他LIM结构域缔合，从而形成同二聚体和异二聚体(Feuerstein，R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA
91(1994)10655-10659)。
91(1994)10655-10659)。
[0062] 据报道SLIM-1/FHL-1的定位是在骨骼成肌细胞的黏着斑，它促进依赖整联蛋白的细胞扩展和迁移(Robinson等，Am.J.Physiol.284(2003)C681)。近来人骨骼肌文库的酵母双杂交筛选鉴定出肌球蛋白结合蛋白C(MyBP-C)是FHL-1结合伴侣，并推测FHL-1的功能是MyBP-C活性和肌节装配的调节因子(McGrath，M.J.等，J.Biol.Chem.281(2006)7666-7683)。FHL-1的表达模式暗示FHL-1在胚胎发育过程中(Chu，P.H.等，Mech.Dev.95(200)259-265)和出生后骨骼肌生长过程中在心脏中发挥重要作用。
[0063] 已发现在拉伸引发的骨骼肌肥大过程中FHL-1 mRNA水平升高(Morgan，M.J.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.212(1995)840-846)。去神经支配引发的萎缩过程中FHL-1 mRNA水平下降(Loughna，P.T.等，Mol.Cell Biol.Res.Commun.3(2000)136-140)。
[0064] 不一致的研究报道了，人衰竭心脏中的SLIM-1 mRNA分别的上调或下调。据报道，人肥大心脏中的FHL-1 mRNA表达增加(Hwang，D.M.等，Circulation
96(1997)4146-4203；Hwang，D.M. 等，Genomics 66(2000)1-14；Lim，D.-S. 等，J.Am.Coll.Cardiol.38(2001)1175-1180)。 相 反，Loughna，P.T. 等，Mol.Cell.Biol.Res.Commun.3(2000)136-140和Zimmermann，R.等，Circulation 100，Suppl.1(1999)565报道FHL-1表达下降。Yang，J等(Circulation 102(2000)3046-3052)报道源自人衰竭心脏的组织中，SLIM-1的mRNA和蛋白水平均减少。
96(1997)4146-4203；Hwang，D.M. 等，Genomics 66(2000)1-14；Lim，D.-S. 等，J.Am.Coll.Cardiol.38(2001)1175-1180)。 相 反，Loughna，P.T. 等，Mol.Cell.Biol.Res.Commun.3(2000)136-140和Zimmermann，R.等，Circulation 100，Suppl.1(1999)565报道FHL-1表达下降。Yang，J等(Circulation 102(2000)3046-3052)报道源自人衰竭心脏的组织中，SLIM-1的mRNA和蛋白水平均减少。
[0065] US 2006/0094038描述了在个体对心力衰竭易感性的诊断中，众多基因的差别基因表达，包括FHL-1(上调)和FHL-2(下调)。
[0066] 此外，描述了FHL-1 mRNA差别表达在皮肤、神经、造血和胚胎干细胞群中的微阵列研究，暗示FHL-1在多种干细胞和祖细胞群中更广泛的作用(Ramalho-Santos M.等，Science 298(2002)597-600；Tumbar，T.等，Science 303(2004)359-363)。
[0067] 另外，一些专利申请通过分析FHL-1的差别表达，进行肿瘤诊断。US2005/0037389公开了众多基因，其中之一是FHL-1，可用于诊断子宫浆液性乳头状癌和卵巢浆液性乳头瘤。US 2005/0048535公开了包括FHL-1的候选基因列表，它们与原发卵巢浆液性乳头瘤有关。US2004/0029151描述了前列腺癌的基因概况分析(genetic profiling)，在其他许多差别表达的基因中提到了SLIM-1。WO 2006/112867涉及通过基因概况分析的乳头状肾细胞癌侵袭性诊断，在其他许多差别表达的基因中提到了SLIM-1。
[0068] WO 2004/092410描述了分别在类风湿性关节炎或骨关节炎中SLIM-1的差别表达。
[0069] 还报道了另一种疾病多发性硬化症与FHL-1基因表达相关(上调)(US2004/0018522和US 2004/0156826)。
[0070] 因此似乎现有技术通过分析相应的mRNA水平已广泛研究了SLIM-1的基因表达。这些研究并不清楚因为相反的数据也被报道。另外迄今也没有显示SLIM-1蛋白水平与循环中心力衰竭之间关系的数据。
[0071] 优选地，标识物SLIM-1是通过使用特异结合试剂从液体样品中特异性测定的。
[0072] 特异结合试剂是例如SLIM-1受体，结合SLIM-1的凝集素或SLIM-1的抗体。特异7
结合试剂对其相应的靶分子具有至少101/mol的亲合力。特异结合试剂优选对靶分子具有
8 9
10l/mol或更优选10l/mol的亲合力。技术人员应理解术语“特定”用于表示存在于样品中的其他生物分子不能与SLIM-1特异结合试剂有明显的结合。优选地，与非靶分子的生物分子结合程度分别产生的结合亲合力仅仅为与靶分子的亲合力的10％或更小，更优选地仅
5％或更小。优选的特异结合试剂应具有上述亲合力以及特异性的最低的标准。
结合试剂对其相应的靶分子具有至少101/mol的亲合力。特异结合试剂优选对靶分子具有
8 9
10l/mol或更优选10l/mol的亲合力。技术人员应理解术语“特定”用于表示存在于样品中的其他生物分子不能与SLIM-1特异结合试剂有明显的结合。优选地，与非靶分子的生物分子结合程度分别产生的结合亲合力仅仅为与靶分子的亲合力的10％或更小，更优选地仅
5％或更小。优选的特异结合试剂应具有上述亲合力以及特异性的最低的标准。
[0073] 特异结合试剂优选是与SLIM-1反应的抗体。术语“抗体”指多克隆抗体、单克隆抗体、这些抗体的抗原结合片段、单链抗体以及包括抗体结合结构域的遗传构建物。
[0074] 任何保留上述特异结合试剂标准的抗体片段都能被使用。抗体可通过目前工艺水平步骤所生产，例如，如Tijssen描述(Tijssen，P.，酶联免疫分析的实践和理论(Practice and theory of enzymeimmunoassays)，Elsevier Science Publishers B.V.，阿姆斯特丹(1990)，全书，特别是43-78页)。此外，技术人员非常了解基于可用于抗体特异性分离的免疫吸附剂的方法。通过这些方法，多克隆抗体的质量以及由此它们在免疫测定中的性能可被增强(Tijssen，P.，上文，108-115页)。
[0075] 对于在该本发明中公开的成果，可以使用从兔子获得的多克隆抗体。然而，很清楚，从不同的物种，例如大鼠、山羊或豚鼠中获得的多克隆抗体以及单克隆抗体也可以使用。因为单克隆抗体能以恒定性能按需要的数量生产，它们是临床常规的分析的开发中的理想工具。在根据本发明的方法中，产生和使用SLIM-1的单克隆抗体分别代表其他的优选实施方式。
[0076] 现在技术人员应理解，SLIM-1已经鉴定为在评估HF中有用的标识物，可用替代方法获得与本发明成果相当的结果。例如，可使用产生抗体的替代策略。这些策略包括使用合成或重组肽等等，这些肽代表SLIM-1的临床相关的表位以用于免疫。可选地，可以使用DNA免疫，又称做DNA疫苗接种。
[0077] 对于测量，将从个体中获得的液体样品和SLIM-1的特异结合试剂在适合形成结合试剂SLIM-1-复合物的条件下孵育。这些情况无须特别指定，因为即便没有任何创造性劳动技术人员也可以很容易地鉴定这些适当的孵育条件。测定结合试剂SLIM-1-复合物的数量并用于HF的评估。技术人员应理解，有许多的方法可测定特异结合试剂SLIM-1-复合物的数量，这些方法在相关的教科书中有详细地描述(参见，例如，Tijssen P.，上文，或 Diamandis，E.P.and Christopoulos，T.K.(eds.)，Immunoassay，Academic Press，Boston(1996))。
[0078] 优选地，使用三明治检验形式检测SLIM-1。在这种检验中，用第一特异结合试剂从一侧捕获SLIM-1，并使用带有能直接或间接检测标记的第二特异结合试剂作用于另一侧。优选地，在定性(有或无SLIM-1)或定量(确定SLIM-1的量)的免疫测定中，使用抗SLIM-1的抗体。
[0079] 如在实施例部分详细描述的，两种小鼠模型已经用于鉴定通过先进的蛋白组方法在实验动物心脏组织中发现的多肽。然而这些模型得到了至少部分矛盾的数据，当然多肽的组织数据并不能代表这些多肽在循环中的有或无。在一种模型中被发现差异表达的标识物可能不能在第二种模型中差异表达，或者甚至在进一步的模型中显示出矛盾的数据。即使蛋白可以在组织中差异表达，但如果从体液中测定，大多数情况下这种蛋白没有任何诊断性关联，因为它可能不被释放至循环中，可能变成片段或者被修饰，例如从细胞或者组织释放时，可能在循环系统中不稳定，可能在循环系统中不能被检测，可能对于特定的疾病不特异，等等。
[0080] 令人惊讶地，本发明的发明人能在体液样品中检测蛋白SLIM-1。更意外地是，他们能证明在这种获自个体的液体样品中SLIM-1的存在可以与HF相关。使用标识物SLIM-1评估HF无需组织和活检样品。测量蛋白SLIM-1的水平在HF领域被认为是十分优越的。
[0081] 在一个优选实施方式中，依据本发明的方法是以血清作为液体样品材料进行的。在一个更优选的实施方式中，按照本发明的方法是以血浆作为液体样品材料进行的。在另一个优选的实施方式中，按照本发明的方法是以全血作为液体样品材料进行的。
[0082] 在进一步优选的实施方式中，本发明涉及蛋白SLIM-1作为标识物分子从获自个体的液体样品来评价心力衰竭的用途。
[0083] 用于诊断的理想情况应是其中单一事件或者过程导致相应疾病的情况，例如传染病。在其他所有的病例中正确的诊断是很难的，尤其是该疾病的病原学没有像HF病那样被充分认识。技术人员应理解，在HF领域，针对某一诊断问题，没有生化标识物在诊断上有100％特异性并同时具有100％敏感性。生化标识物更合适用以某种可能性或者预测值来评估潜在的诊断问题。技术人员十分熟悉对于评价诊断问题时用来计算相对危险性或者可能性的常规数学/统计方法。在常规临床实践中，在医师诊断、治疗和处置潜在疾病时通常会同时考察各种的临诊症状和生物标志物。
[0084] 优选地，在本发明的进一步优选的实施方式中，用于评估HF的方法是通过测量SLIM-1和一种或更多种其他的标识物的浓度并通过在HF的评估中利用SLIM-1和一种或更多种其他的标识物的浓度来实现的。
[0085] 在评估HF中，标识物SLIM-1将会以下面的一个或更多个方面辅助医师：评估个体患心力衰竭的风险或者评估患有心力衰竭的患者，例如鉴定心力衰竭的阶段；区分急性和慢性心力衰竭；判断疾病进程的风险；对选择适当治疗提供指导；监测患者对治疗的反应；监测病程，即随访HF患者。
[0086] 筛选(评估个体是否有发展心力衰竭的风险)
[0087] 在一个优选的实施方式中，本发明涉及一种评估个体是否有发展心力衰竭风险的体外方法，包括步骤：测量样品中标识物SLIM-1的浓度，任选地测量样品中一种或更多种心力衰竭的其他标识物的浓度，通过将该SLIM-1浓度和任选地对所述任选的一种或更多种其他标识物测量的浓度与该标识物或这些标识物浓度的参考值比较来评价所述个体发展为心力衰竭的风险。
[0088] 本发明意义上的筛选涉及关于个体发展心力衰竭的风险的无偏见的评估。而这种筛选在理论上可以对任何样品进行，在临床实践中这种筛选通常会给予具有以某种方式发展心力衰竭风险的个体。按以上讨论的，这种个体可以无临床症状，即他们没有HF的体征或者症状。在一个优选实施方式中，将对具有发展心力衰竭风险的个体进行HF筛选，例如属于按ACC/AHA实践指南定义的阶段A或者B。
[0089] 如上述，心力衰竭是发达国家中流行性最高、花费最多和对生命威胁最严重的疾病之一。因为它的高流行性和无症状期长，为了干预并如果可能的话阻断该病程，对于个体发展HF风险的鉴定将变得极其重要。只有进行足够早期的风险评估，才可能阻止HF病程从无症状期进入有症状期。
[0090] 心力衰竭风险的评估是通过数学/统计方法进行的，技术人员对该方法有充分地认识和理解。优选地，个体患心力衰竭的风险是以相对值表示的并按所谓的相对风险性(＝RR)来给出。为了计算这种心力衰竭的RR，将SLIM-1的个体数值与在参考群体中确定的数值进行对比，优选不发生心力衰竭的健康个体。此外优选对这种心力衰竭RR的评估基于在研究期内，优选一年或者也可优选两年之内发展心力衰竭的个体群和在相同研究期内未发展心力衰竭的个体群。
[0091] 在另一个优选实施方式中，本发明涉及标识物SLIM-1来筛选心力衰竭的用途。如技术人员熟知，术语“用作标识物”表示标识物分子的浓度可以通过适当手段进行量化而且测出的这种标识物的值将用于指示，即标示，疾病或者临床状况的有或无。用于定量的适当手段例如是特异结合试剂，如抗体。
[0092] 优选地，HF筛选将实施于怀疑在未来出现心力衰竭风险的个体上。在该意义上，具有未来心力衰竭风险的患者是已诊断有高血压、动脉粥样硬化疾病、糖尿病、肥胖和代谢综合征的患者。优选地，对患有高血压、动脉粥样硬化疾病、糖尿病和/或代谢综合征的个体进行未来心力衰竭的风险评估。
[0093] 还优选的是，标识物SLIM-1对处于按照ACC/AHA实践指南定义的阶段B中的个体，即呈现心脏结构改变但没有显示心力衰竭症状的个体评估未来心力衰竭风险的用途。
[0094] 在一个更优选的实施方式中，本发明涉及SLIM-1作为HF标识物组合的一种标识物用于HF筛选目的的用途。
[0095] 在筛选设置中，SLIM-1的水平升高是个体发展心力衰竭的风险升高的阳性指示。
[0096] 患者的分级
[0097] 在一个优选的实施方式中，本发明涉及一种辅助对心力衰竭患者分级的体外方法，包括步骤：a)测量样品中标识物SLIM-1的浓度，b)任选地测量样品中一种或更多种心力衰竭的其他标识物的浓度，并通过将在步骤(a)中确定的浓度和任选地步骤(b)中确定的浓度与该标识物或这些标识物浓度的参考值进行比较来对心力衰竭进行分级。优选地标识物SLIM-1的水平用作在分级中辅助将受试个体分入个体组，这些组为临床“正常”(即，按照ACA/ACC分类在阶段A的个体)，具有结构心脏病但无症状的患者(按照ACA/ACC分类的阶段B)和心力衰竭患者组(即，按照ACA/ACC分类处于阶段C或阶段D的患者)。
[0098] 区别急性心脏事件和慢性心脏病
[0099] 在一个优选的实施方式中，本发明涉及辅助鉴别诊断急性心脏事件和慢性心脏病的体外方法，包括步骤：测量样品中标识物SLIM-1的浓度，任选地测量样品中一种或更多种心力衰竭的其他标识物的浓度，并通过将步骤(a)确定的浓度和任选地步骤(b)中确定的浓度与这个标识物或这些标识物浓度的参考值进行比较以确立对急性心脏事件和慢性心脏病的鉴别诊断。
[0100] 所属领域的技术人员熟悉“急性心脏事件”和“慢性心脏病”的意思。
[0101] 优选地，“急性心脏事件”涉及心脏的急性状况、疾病或机能紊乱，特别指急性心力衰竭，例如，心肌梗死(MI)或心律失常。根据MI的程度，可能后续LVD和CHF。
[0102] 优选地，“慢性心脏病”是心脏功能的减弱，例如，由于心脏缺血、冠状动脉病或前期的特别小型的心肌梗死(也许后续发生进行性LVD)造成。也可能由于炎性疾病、心脏瓣膜缺陷(例如二尖瓣缺陷)、扩张型心肌病(dilatative cardiomyopathy)、肥厚型心肌病、心脏节奏缺陷(心律失常)和慢性阻塞性肺病造成。因此，慢性心脏病显然也可以包括患有过急性冠状综合征，例如MI的患者，但他们当前没有患有急性心脏事件。
[0103] 区分急性心脏事件和慢性心脏病十分重要，因为急性心脏事件和慢性心脏病可能要求相当不同的治疗方案。例如对于存在急性心肌梗死的患者早期再灌注治疗可能极度重要。而对慢性心力衰竭的患者进行再灌注治疗最多是对这个患者无害或仅仅是几乎无害。
[0104] 按照本发明的一个更优选的实施方式，标识物SLIM-1用于鉴别诊断急性和慢性心力衰竭。
[0105] 评估疾病进展的风险
[0106] 在一个优选的实施方式中，本发明涉及一种评估HF患者疾病进展风险的体外方法，包括步骤：在样品中测量标识物SLIM-1的浓度，任选地测量样品中一种或更多种心力衰竭的其他标识物的浓度，通过将该SLIM-1浓度和任选地对所述任选的一种或更多种其他的标识物确定的浓度与该标识物或这些标识物的浓度的参考值比较来确定所述个体疾病进展的风险。
[0107] 目前很难评估或甚至预言一种合理的可能性，即诊断有HF的患者是否具有一种或多或少的稳定状态，或是否疾病将会发展，以及患者的健康状态是否最终可能恶化。心力衰竭的严重性和进展在临床上通常通过评估临床症状或使用成像技术，如超声波心动描记术鉴定有害变化而确定的。在一个具体实施方式中，心力衰竭的恶化是通过监测左侧心室射血分数(LVEF)来确定。LVEF的5％或更多的恶化被认为是疾病进展。
[0108] 在进一步优选的实施方式中，本发明因此涉及标识物SLIM-1来评估患有HF患者的疾病进展风险的用途。在患有HF的患者的疾病进展评估中，SLIM-1水平的升高指示在HF早期阶段疾病进展的风险升高，而SLIM-1水平的降低指示末期心力衰竭。
[0109] 指导选择适当的HF治疗方法
[0110] 在一个优选的实施方式中，本发明涉及辅助选择适当的HF疗法的体外方法，包括步骤：在样品中测量标识物SLIM-1的浓度，任选地测量样品中一种或更多种心力衰竭的其他标识物的浓度，并通过将该SLIM-1浓度和任选地对所述任选的一种或更多种其他的标识物测定的浓度与该标识物或这些标识物的浓度的参考值比较来选择适当的疗法。
[0111] 人们期望标识物SLIM-1能辅助医师从心力衰竭领域中手边各种治疗方案中选择最适当的治疗方案。因此一个更优选的实施方式涉及了标识物SLIM-1在选择治疗患HF患者的方案中的用途。
[0112] 监测患者对治疗方法的反应
[0113] 在一个优选的实施方式中，本发明涉及一种监测患者对HF治疗方法的反应的体外方法，包括步骤：a)在样品中测量标识物SLIM-1的浓度，b)任选地测量样品中一种或更多种心力衰竭的其他标识物的浓度，并通过将步骤(a)中确定的SLIM-1浓度和任选地步骤(b)中确定的浓度与该标识物或这些标识物的浓度的参考值比较来监测患者对HF治疗方法的反应。
[0114] 可选择地，上述用于监测患者对疗法反应的方法可以通过确定治疗前后SLIM-1和任选所述一种或更多种其他标识物的标识物水平并对治疗前后的标识物水平加以比较来实施。
[0115] 心力衰竭的诊断是临床确定的。根据本发明，如果患者到达按ACC/AHA实践指南定义的阶段C或D的标准，HF被认为是临床确定的。依据该指南，阶段C指患者具有结构性心脏病并有心力衰竭的较早或当前症状。阶段D的患者是具有难治性心力衰竭的患者，需要专门的干预。
[0116] 进一步如上所示，测定的NT-proBNP值与心力衰竭的严重性高度相关。然而，BNP和NT-proBNP在监测患者对治疗方法的反应上并不理想，参考如Beck-da-Silva，L.等，Congest.Heart Fail.11(2005)248-253，quiz 254-255。
[0117] 标识物SLIM-1看起来适合于监测患者对治疗方法的反应。本发明因此也涉及SLIM-1监测患者对治疗方法的反应的用途。在该诊断领域，标识物SLIM-1还可以用于确定在治疗之前的基线值并测定在治疗之后的一个或几个时间点的SLIM-1。在随访的HF患者中SLIM-1的水平升高是HF的治疗有效的阳性指示。
[0118] 标识物组合
[0119] 各生化标识物可以被单独测定，或者在本发明的一个优选的实施方式中，也可以用基于芯片或基于珠的阵列技术同时测定。然后用每个标识物的单独截止独立解释该生物标识物的浓度或将它们组合起来解释，即它们形成标识物组合。
[0120] 技术人员将理解将标识物水平关联于某种可能性或风险的步骤可以用不同的方法进行并完成。优选地，标识物SLIM-1和一种或更多种其他的标识物的测定值用数学的方法进行组合并且该组合值与潜在诊断问题关联。标识物的值可以用任何本领域适当的数学法与SLIM-1的测量数据组合起来。
[0121] 优选地，应用于标识物组合的数学算法是逻辑函数。应用这种数学算法或这种逻辑函数的结果优选是单一值。依赖于潜在诊断问题上，该值可以很容易地与如个体患心力衰竭的风险或在评估HF患者中有益的其他计划诊断应用相互关联。在一个优选的方式中该逻辑函数按以下步骤获得：a)将个体分成组，例如正常、具有心力衰竭风险的个体、具有急性或慢性心力衰竭患者等组，b)用单变量分析法鉴定这些组之间有显著相异的标识物，c)逻辑回归分析以评估在评估这些不同各组中有用的标识物独立差异值，d)构建逻辑函数来组合独立差异值。在这类分析中标识物不再是独立的而代表标识物组合。
[0122] 在一个优选的实施方式中，用于组合SLIM-1值和另外至少一个标识物值的逻辑函数通过以下方法获得a)将个体分别地分入正常组和心力衰竭风险个体组，b)确定SLIM-1的值和另外至少一个标识物的值，c)进行逻辑回归分析，和d)构建逻辑函数来组合SLIM-1的值和另外至少一个标识物的值。
[0123] 用于将标识物组合与疾病关联的逻辑函数优选使用算法，这种算法通过统计方法的应用而开发得到。适当统计方法例如判别分析(DA)(即线性、二次方程、正规化(regularized)-DA)，核方法(即SVM)，非参数法(即k-最近-相邻分级法)，PLS(偏最小二乘法)，基于树状法(即逻辑回归，CART，随机森林法，Boosting/Bagging法)，广义线性模型(即，逻辑回归)，基于主分量的方法(即，SIMCA)，广义加性模型，基于模糊逻辑的方法，基于神经网络和遗传算法的方法。技术人员选择适当的统计方法来评价本发明的标识物组合并藉此获得适当的数学算法应没有什么问题。优选地，应用统计方法来获得用于评估心力衰竭的数学算法，该统计方法选自于DA(即线性-，二次方程-，正规化的判别分析)，核方法(即SVM)，非参数法(即，k-最近-相邻分级法)，PLS(偏最小二乘法)，基于树状法(即逻辑回归，CART，随机森林法，Boosting方法)，或广义线性模型(即逻辑回归)。涉及这些统计方法的细节可在以下的参考资料中找到：Ruczinski，I.等，J.ofComputational and Graphical Statistics 12(2003)475-511；Friedman，J.H.，J.of the American Statistical Association 84(1989)165-175；Hastie，T.等，The Elements of Statistical Learning，Springer Verlag(2001)；Breiman，L.等，Classification and regression trees，WadsworthInternational Group，California(1984)；Breiman，L.，Machine Learning45(2001)5-32；Pepe，M.S.，the Statistical Evaluation of Medical Tests forClassification and Prediction，Oxford Statistical Science Series，28，Oxford University Press(2003)；和Duda，R.O.等，PatternClassification，John Wiley & Sons，Inc，Inc.，2nd ed.(2001)。
[0124] 发明的一个优选的实施方式是将优化多变量截止用于生物标志物的潜在组合并区分状态A和状态B，例如，分别区分正常和具有心力衰竭风险的个体，对治疗有反应的HF患者和治疗失败，患有急性心力衰竭的患者和患有慢性心力衰竭的HF患者，显示出疾病进展的HF患者和未显示疾病进展的HF患者。
[0125] 在受试者工作曲线(receiver operator curve)以下的面积(＝AUC)能指示诊断程序的有效性或正确性。诊断方法的正确性最好是由它的受试者工作特征(receiver-operating characteristics)(ROC)来进行描述(特别见Zweig，M.H.，和Campbell，G.，Clin.Chem.39(1993)561-577)。ROC图是从连续改变所有观测数据的判定阈中全部敏感性/特异性配对结果的绘图。
[0126] 实验室试验的临床效果取决于它诊断的准确性，或正确将受试者分级入临床相关亚群的能力。诊断准确性衡量该测定正确区别研究的受试者两种不同状况的能力。这些状况例如健康和疾病或疾病进展对没有疾病进展。
[0127] 在每个病例中，ROC曲线图通过在判定阈全范围中绘制敏感性对1-特异性的曲线来描述了两种分布之间的重叠。y轴是敏感性，或真阳性分数[按(真阳性测定结果数量)/(真阳性测定结果数量+假阴性测定结果数量)确定]。这也表示为疾病或状况存在的阳性。它仅是通过受影响亚群计算得到。X轴是假阳性分数，或1-特异性[按(假阳性结果数量)/(真阴性结果数量+假阳性结果数量)确定]。它是特异性的指标，完全由未受影响亚群计算得到。因为真假阳性分数完全分开计算，通过使用来自两种不同亚群的试验结果，ROC曲线图与样品中的疾病流行性无关。在ROC曲线图中的每个点表示敏感性/1-特异性配对，其对应于一个特定的判断阈。辨别力很好的测定(在两种结果分布上没有重叠)具有的ROC曲线图穿过左上角，真阳性分数为1.0或100％(非常好的敏感性)，假阳性分数是0(非常好的特异性)。对于一个无辨别力的测定(对两组的结果分布相同)来说理论曲线图是一条从左下角到右上角的45°对角线。大多数曲线在这两种极端之间。(如果ROC曲线图完全落在45°对角线下，这种情况很容易补救，即通过颠倒“阳性”标准，从“大于”到“小于”或反之亦然。)定性地，曲线图越接近左上角，测定的总精度越高。
[0128] 量化实验室试验诊断准确性的一个方便的目标是通过单一数字来表示它的效果。最常用的总体量度是ROC曲线下的面积(AUC)。按照惯例，该面积总≥0.5(如果不是这样，可以颠倒判定规则来使它如此)。数值介于1.0(两组的测试值非常好地分开)和0.5(在测试值上两组无明显的分布差异)之间。该面积不仅仅依赖曲线图的特定部分如最接近对角线的点或在90％特异性处的敏感性，而是整个曲线图。这是一个定量的、描述性的表达式，表示ROC曲线图接近完美(面积＝1.0)的程度。
[0129] 总的检验敏感性依赖于特异性，该特异性对于实践此处公开的方法是需要的。在某些优选的设定中，75％的特异性可能足够并且统计方法和结果算法可以基于该特异性的需求。在一个优选的实施方式中，应用于评估个体心力衰竭风险的方法是基于80％、85％或优选90％或95％的特异性。
[0130] 正如以上讨论的，标识物SLIM-1有助于评估个体发展心力衰竭的风险以及进一步地在体外诊断评估患有心力衰竭患者。因此一个优选实施方式是SLIM-1作为评估心力衰竭的标识物分子的用途。
[0131] 使用包括SLIM-1和一种或更多种其他的HF标识物的标识物组合来评估HF患者或评估个体患HF风险代表了本发明的一种进一步优选的实施方式。在这种标识物组合中，一种或更多种其他的标识物优选地选自利尿钠肽标识物、心脏肌钙蛋白标识物和炎症标识物。
[0132] 可与SLIM-1测量组合的一种或更多种优选的其他HF标识物优选选自利尿钠肽标识物、心脏肌钙蛋白标识物和炎症标识物。这些优选的其他标识物的测量优选地与SLIM-1的测量组合或者形成包括SLIM-1在内的HF标识物组合的一部分，它们在以下内容中分别会有更详细地讨论。
[0133] 利尿钠肽标识物.
[0134] 在本发明意义上，利尿钠肽标识物可以是从心房利尿钠肽(ANP)家族中挑选出来的标识物，也可以是从脑利尿钠肽(BNP)家族中挑选出来的标识物。
[0135] 无论是在心房利尿钠肽家族还是在脑利尿钠肽家族中的多肽标识物都是源自于相应活性激素的前形式原(preproforms)。
[0136] 按照本发明优选的利尿钠肽标识物是NT-proANP、ANP、NT-proBNP、BNP和可用免疫法检测的其生理片段。技术人员很容易理解，可用免疫法检测的片段必须包括至少一个表位以允许特异性检测这种生理片段。生理片段是天然存在于个体循环的片段。
[0137] 在两种利尿钠肽家族中的标识物代表相应激素原的片段，分别即proANP和proBNP。因为对于两个家族的考虑是相似的，仅对BNP标识物家族作一些详细描述。BNP家族的激素原，即proBNP，由108个氨基酸组成。proBNP被剪切成为32个C末端氨基酸(77-108)，其代表有生物活性的激素BNP，和叫做N末端proBNP(或NT-proBNP)的N末端氨基酸1-76。BNP、N末端proBNP(1-76)以及进一步的分解产物(Hunt，P.J.，等，Biochem.Biophys Res.Com.214(1995)1175-1183)在血液中循环。完整的前体分子(proBNP1-108)是否也存在于血浆现在还不完全明确。不过可以阐述为proBNP(1-108)在血浆中的低释放量是可检测的，但由于在其N末端的迅速局部降解，一些氨基酸是缺失的(Hunt，P.J.，等，Peptides 18(1997)1475-1481)。现在普遍接受例如对于NT-proBNP，该分子残存于氨基酸10至50之间的中心部分代表生理上更稳定的部分。包括NT-proBNP的这个中心部分的NT-proBNP分子能从体液中被可靠地测定。关于基于免疫法检测该NT-proBNP分子中心部分的方法在WO 00/45176中有详细的公开，读者可以参考该处了解细节。仅测定NT-proBNP的某一亚组份可能更为优越，对此提出了术语“天然NT-proBNP”。关于NT-proBNP亚组份的详细公开可以在WO 2004/099253中找到。技术人员将在那里找到所有必需的指导。
优选地，测定的NT-proBNP是或对应于使用来自德国Roche Diagnostics的
NT-proBNP测定剂测定的NT-proBNP。
优选地，测定的NT-proBNP是或对应于使用来自德国Roche Diagnostics的
NT-proBNP测定剂测定的NT-proBNP。
[0138] 应用NT-proBNP进行预分析是有效的，这样可使样品转移至中心实验室变得容易(Muelle，T.，等，Clin.Chem.Lab.Med.42(2004)942-944)。血样可以在室温下存储几天或可邮寄或运输而没有回收率的损失。相反，将BNP储存在室温下或4℃48小时可能造成至少20％的浓度损失(Mueller，T.，等，上文；Wu，A.H.等，Clin.Chem.50(2004)867-873)。
[0139] 脑源的利尿钠肽家族(尤其是BNP和NT-proBNP)已经在对某些群体进行HF筛选时进行了彻底的研究。这些标识物，尤其是NT-proBNP的发现是相当鼓舞人心的。NT-proBNP的值甚至在无症状“患者”中升高，这种升高的值明确地表明了“心脏问题”(Gremmler，B.等，Exp.Clin.Cardiol.8(2003)91-94)。这些作者证明了升高的NT-proBNP显示了“心-肾不适”的存在并应该迅速安排进一步检查。与其他的组的研究人员相一致，Gremmler等也发现了NT-proBNP浓度异常对于排除群体中的HF和排除气喘受试者中的左心室功能紊乱(＝LVD)是准确的诊断性试验。阴性BNP或NT-proBNP值在排除HF或LVD时的作用被其他组研究人员确证，参考如McDonagh，T.A.等，Eur.J.Heart Fail.6(2004)269-273；以及Gustafsson，F.等，J.Card.Fail.11，Suppl.5(2005)S15-20。
[0140] BNP主要在心室中产生(虽然不是唯一)并在壁压力升高时释放。因此，BNP释放的升高主要反映了心室功能紊乱或起源于心房但影响心室的功能紊乱，例如，通过流入量减少或血容量过载。与BNP相反，ANP主要从心房产生并释放。因此ANP的水平可能主要反映心房的功能。
[0141] ANP和BNP是活性激素，与他们的相应非活性对应物NT-proANP和NT-proBNP相比具有较短的半衰期。BNP在血液中被代谢，而NT-proBNP则作为完整的分子在血液中循环并通过肾脏除去。NT-proBNP的体内半衰期比BNP长120分钟，BNP的体内半衰期为20分钟(Smith，M.W.等，J.Endocrinol.167(2000)239-246)。
[0142] 因此取决于时间过程或感兴趣的性质，活性的或非活性形式的利尿钠肽的测量都可能是有益的。
[0143] 在个体心力衰竭风险的评估中，测定的SLIM-1值优选与NT-proANP和/或NT-proBNP的值相组合。优选地，NT-proBNP的值与SLIM-1的值相组合。类似的考虑应用于选择适当的治疗方法、鉴别疾病进展的风险并监测疾病的过程。
[0144] 在SLIM-1用于评估患者对治疗方法的反应的情况下，优选地将其的测量与ANP或BNP的测量组合起来。
[0145] 在SLIM-1用来区分急性和慢性心力衰竭的情况下，优选的标识物组合包含SLIM-1、ANP或proANP和BNP或proBNP。
[0146] 心脏肌钙蛋白标识物
[0147] 术语心脏肌钙蛋白涉及心脏肌钙蛋白I和肌钙蛋白T的同种型。按上述说明，术语标识物也涉及标识物分子的生理变异体，如生理片段或复合体。对于心脏肌钙蛋白标识物，它们的生理学存在的复合体已知是诊断相关的并因此明确包含在内。
[0148] 肌钙蛋白T具有约37.000Da的分子量。发现于心脏组织的肌钙蛋白T同种型(cTnT)与骨骼肌TnT有充分的区别，以至于可以生产抗体来判别这两种TnT
同种型。TnT被认为是急性心肌损伤的标识物；参见Katus，H.A.等J.Mol.Cell.
Cardiol.21(1989)1349-1353；Hamm，C.W. 等，N.Engl.J.Med.327(1992)146-150；
Ohman，E.M.， 等，N.Engl.J.Med.335(1996)1333-1341；Christenson，R.H.， 等 Clin.Chem.44(1998)494-501；和EP 0394819。
同种型。TnT被认为是急性心肌损伤的标识物；参见Katus，H.A.等J.Mol.Cell.
Cardiol.21(1989)1349-1353；Hamm，C.W. 等，N.Engl.J.Med.327(1992)146-150；
Ohman，E.M.， 等，N.Engl.J.Med.335(1996)1333-1341；Christenson，R.H.， 等 Clin.Chem.44(1998)494-501；和EP 0394819。
[0149] 肌钙蛋白I(TnI)是肌钙蛋白复合物的抑制元件，为25kDa，发现于肌肉组织。TnI在没有Ca2+时结合肌动蛋白，抑制肌动球蛋白的三磷酸腺苷酶活性。发现于心脏组织的TnI同种型(cTnI)与骨骼肌TnI有40％的差异，可以用免疫法判别两种同种型。cTnI的正常血浆浓度小于0.1ng/ml(4pM)。cTnI在心脏细胞死亡后释放进入血流；因此在有急性心肌梗死的患者血浆中cTnI浓度升高(Benamer，H.等Am.J.Cardiol.82(1998)845-850)。
[0150] 肌钙蛋白I和T独特的心脏同种型让它们可以通过免疫法与其他的骨骼肌肌钙蛋白加以区别。因此肌钙蛋白I和T由损伤心肌释放进入血液可以特异性地与心脏组织损伤相关联。现在技术人员也知道心脏肌钙蛋白可能从循环中检出，可能是游离态也可能是复合物的一部分(参考如US 6,333,397，US 6,376,206和US 6,174,686)。
[0151] 在评估个体患心力衰竭的风险以及评估已患心力衰竭患者的时候，测定的SLIM-1值优选地与肌钙蛋白T和/或肌钙蛋白I心脏同种型的值相组合。与标识物SLIM-1组合使用的优选的心脏肌钙蛋白是心脏肌钙蛋白T。
[0152] 炎症标识物
[0153] 技术人员对术语炎症标识物是熟悉的。优选的炎症标识物是白介素-6，C-反应蛋白、血清淀粉样蛋白A和S100蛋白。
[0154] 白介素-6(IL-6)是一种21kDa的分泌性蛋白质，它具有多种生物活性，可分为参与红细胞生成作用的活性和参与活化先天免疫反应的活性。IL-6是急性期反应物并刺激多种蛋白，包括粘着分子的合成。它的主要功能是介导急性期肝脏蛋白的生产，细胞因子IL-1和TNF-α诱导它的合成。IL-6通常是由巨噬细胞和T淋巴细胞产生。IL-6的正常血清浓度小于5pg/ml。
[0155] C-反应蛋白(CRP)是一种同型五聚体(homopentameric)Ca2+-结合急性期蛋白，具有参与宿主防御的21kDa亚基。CRP的合成可被IL-6诱导以及IL-1间接诱导，因为IL-1可以触发肝血窦的库柏法(kupffer)细胞的IL-6的合成。在90％的健康群体中CRP的正常血浆浓度小于3μg/ml(30nM)，在99％的健康个体中小于10μg/ml(100nM)。例如血浆的CRP浓度可以通过血清淀粉样蛋白A(＝SAA)来测定，血清淀粉样蛋白A是一种11.7kDa的低分子量急性期蛋白。它主要是在肝响应于IL-1、IL-6或TNF-α刺激时合成，并参与调控T细胞依赖的免疫反应。在急性事件中，SAA的浓度增加最高达1000倍以到达1毫克/毫升。它可以用来监测在如囊性纤维化、肾移植排斥、外伤或感染的疾病中的炎症。在类风湿性关节炎的某些病例中被用于替代CRP，但是SAA仍然没有被广泛认可。
[0156] S100蛋白形成不断扩大的Ca2+-结合蛋白家族，该家族现在已有超过20个的成员。S100蛋白的生理性相关结构是一种同源二聚体，但有些也可以互相形成异源二聚体，例如，S100A8和S100A9。其细胞内功能包括蛋白质磷酸化、酶活性或涉及细胞增殖和分化的细胞骨架动力学的调控。因为某些S100蛋白也可以从细胞中释放，其胞外功能现在也已有描述，例如，神经元存活、星形胶质细胞增殖、诱导细胞程序死亡以及炎性过程的调控。S100A8、S100A9、异源二聚体S100A8/A9以及S100A12已经在炎症中发现，S100A8对慢性炎症应答，而S100A9、S100A8/A9和S100A12在急性炎症中增多。S100A8、S100A9、S100A8/A9和S100A12已发现与有炎性成分的不同疾病有关联，包括某些癌症、肾同种异体移植排异、结肠炎，最重要的是与RA有关联(Burmeister，G.，和Gallacchi，G.，Inflammopharmacology3(1995)221-230；Foell，D.等，Rheumatology 42(2003)1383-1389)。用于评估个体患HF风险或患有HF患者的最优选S100标识物，例如按照本发明使用的标识物组合，是S100A8、S100A9、S100A8/A9异源二聚体和S100A12。
[0157] sE-选择蛋白(可溶的内皮性白细胞粘着分子-1，ELAM-1)是一种115kDa的I型跨膜糖蛋白，只在内皮细胞上并仅受炎性细胞因子(IL-1β，TNF-α)或内毒素活化后表达。细胞表面的E-选择蛋白是一种白细胞转动附着至内皮的媒介，该过程是白细胞在炎症位点外渗(extravasion)的必需步骤，由此该蛋白在局部炎性反应中具有重要的作用。在健康个体的血液中有发现可溶性E-选择蛋白，这可能是由于表面表达的分子被蛋白酶剪切后生成的。已有报道在许多病理状况下血清中sE-选择蛋白的水平升高(Gearing，A.J.H和Hemingway，I.，Ann.N.Y.Acad.Sci.667(1992)324-331)。
[0158] 在一个优选实施方式中本发明涉及SLIM-1作为HF的标识物分子，与一种或更多种HF标识物分子组合用以从个体获得的液体样品中评估HF的用途。
[0159] 按以上说明，在按照本发明的优选方法中，SLIM-1的测定值至少与至少另一种标识物的值组合，这种标识物选自利尿钠肽标识物、心脏肌钙蛋白标识物和炎症标识物。
[0160] 在一个优选实施方式中，本发明涉及SLIM-1和NT-proBNP的标识物组合来评估心力衰竭的用途。
[0161] 在一个优选实施方式中，本发明涉及SLIM-1和肌钙蛋白T的标识物组合来评估心力衰竭的用途。
[0162] 在一个优选实施方式中，本发明涉及SLIM-1和CRP的标识物组合来评估心力衰竭的用途。
[0163] 在一个更优选的实施方式中，本发明涉及包括标识物SLIM-1、肌钙蛋白T、NT-proBNP和CRP的标识物组合。
[0164] 在一个更优选的实施方式中，本发明涉及用于在体外用生化标识物来评估HF的方法的标识物组，所述方法包括测量在样品中SLIM-1和一种或更多种其他的HF标识物的浓度，并使用确定的浓度来评估HF。
[0165] 根据本发明的标识物组，优选地用蛋白阵列技术来进行测定。阵列是可寻址的个体标识物集合。这些标识物可以在空间上被寻址，如包含于微量滴定板中或印在平面表面的阵列，其中每个标识物存在于不同的X和Y轴坐标。可选择地，标识物也可根据标签、珠、纳米粒或物理性质来寻址。微阵列可按照普通技术人员已熟知的方法(参见如US5,807,522；Robinson，W.H.等，Nat.Med.8(2002)295-301；Robinson，W.H.等，Arthritis Rheum.46(2002)885-893)制备。在此使用的阵列指任何具有多种可寻址标识物的免疫学测定。在一种实施方式中，可寻址标识物是抗原。在另一个实施方式中，可寻址元件是自身抗体。微阵列是小型化形式的阵列。在此使用的抗原指任何可以特异性结合于抗体的分子。
术语自身抗体在该领域已有明确的定义。
术语自身抗体在该领域已有明确的定义。
[0166] 在一种优选实施方式中，本发明涉及蛋白阵列，其包括标识物SLIM-1和任选地包括一种或更多种HF的其他标识物。
[0167] 在一种优选实施方式中，本发明涉及蛋白阵列，其包括标识物SLIM-1和NT-proBNP。
[0168] 在一种优选实施方式中，本发明涉及蛋白阵列，其包括标识物SLIM-1和肌钙蛋白T。
[0169] 在一种优选实施方式中，本发明涉及蛋白阵列，其包括标识物SLIM-1和CRP。
[0170] 在一种进一步优选实施方式中，本发明涉及包括标识物SLIM-1、肌钙蛋白T、NT-proBNP和CRP的蛋白阵列。
[0171] 在一种更优选的实施方式中，本发明涉及试剂盒，其包括特异性测定SLIM-1需要的试剂。优选的另一种试剂盒包括特异性测定SLIM-1需要的试剂和测定一种或更多种其他心力衰竭标识物需要的试剂，这些标识物在HF标识物组合中一起使用。
[0172] 以下提供的实施例、序列表和附图用于辅助了解本发明，其真实范围在附加的权利要求中阐述。需要理解，在未偏离本发明精神前提下所述的步骤可以被修改。
附图说明
[0173] 图1
[0174] 野生型和R9C小鼠的表型分析。(A)野生型小鼠(n＝79)和R9C小鼠(n＝44)在24周后的生存曲线。(B)用超声波心动描记术进行的心脏缩短评估(＝缩短分数)。早在8周龄R9C转基因动物出现了明显的功能损害。
[0175] 图2
[0176] 野生型和AB小鼠的超声心动图和血液动力学参数。(A)术后2、4和8周最高压强的变化(mmHg)。(B)术后2、4和8周左心室射血分数(LVEF)变化的百分数。(封闭圆表示来源于假手术小鼠的数据，开口圆表示来源于具主动脉绑扎(aortic binding)(AB)的小鼠的数据)。
[0177] 图3
[0178] 分别从R9C和对照小鼠心脏组织获得的Western印迹数据。比起从健康的小鼠(＝+/+)获得的组织样品，患有心力衰竭的实验动物(R9C)的组织样品中可观察到SLIM-1的明显过量表达。染色条带下面的数字表示由质谱记录数值确定的相对表达水平。
[0179] 图4
[0180] 分别从10例HF和对照样品中测得的SLIM-1。
[0181] 分别对标记的来源于心力衰竭患者(HF＝菱形)的样品和健康对照(正常人血清＝NHS＝正方形)给出在SLIM-1检验中的光密度(ODs)。
[0182] 图5
[0183] 分别从10例HF和对照样品中测得的SLIM-1。分别对标记的来源于心力衰竭患者(HF)的样品和来自健康对照(正常人血清＝NHS)样品测出的SLIM-1给出ODs。盒须图(box-and-whisker-blots)显示了较低和较高的四分位值(盒(boxes))以及最高和最低的值(须(whiskers))。
[0184] 实施例1
[0185] 心力衰竭的小鼠模型
[0186] 1.1R9C小鼠模型
[0187] 已报道一种遗传的人类扩张型心肌病源于人受磷蛋白(PLN)基因(PLN-R9C)中的精氨酸9转变为半胱氨酸(Schmitt，J.P.等，Science299(2003)1410-1413)。扩张型心肌病的发病一般开始于患病患者的青春期阶段，随后在心脏功能上渐进性恶化以导致危险和死亡。该突变的转基因小鼠模型显示出与患病患者类似的心脏表型，存在扩张型心肌病、降低的心脏收缩力和早产儿死亡(Schmitt，2003，上文)。
[0188] 我们绘制了转基因小鼠的存活曲线。PLN-R9C小鼠平均存活仅～20周，只有少于15％的能存活超过24周(图1A)。在PLN-R9C系中，最早有记录的死亡在12周龄被观察到，而仅一只野生型对照小鼠在24周内死亡。先于最早有记录的死亡，八周被选作为疾病的‘早期’阶段的代表时间点，而16周被选为中点，介于8至24周之间(经典DCM)。一份详细的分离的心脏的病理学分析显示了PLN-R9C小鼠甚至在8周龄时心室和心房扩大的证据。分离心肌的交叉部分(获自于野生型和PLN-R9C小鼠)在苏木素和伊红染色之后也显示了左心室扩张或心室壁变薄的证据，在转基因动物中8周开始，随年龄增长扩张进程延续。
[0189] 对8、16和24周龄的雄性小鼠用超声波心动描记术进行心脏功能测定(汇总于表1中)。前后壁厚度的超声波心动描记术测定结果显示R9C小鼠在8周时具有显著的扩张，且在小鼠生存期内持续恶化。收缩性，用心脏缩短来评估(图1B)，也是在8周时出现轻的但显著的减低，而更显著的减低在16周时变得明显。雌性小鼠分析结果显示与雄性相同的结果(数据未展示)。
[0190] 表1：野生型和R9C雄性小鼠在8、16和24周时的超声心动图和血液动力学参数[0191]* * 10. * 10. * 80. * 90. * 1. * 5 * 1. *
sk 51± 0±7 0±7 0±8 0±3 2±6 .0± 3±6 2.2
C9R w42 M 205 5.0 5.0 4.5 2.4 .22 1.5 .37 ±04 5
10.0 10.0 50.0 30.0 5.1 3.0 9.2 1.3
skw 9±5 ±17 ±17 ±99 ±98 ±9. ±9. ±3.1 ±1.
TW 42 M 65 .0 .0 .3 .1 25 01 11 76 5
* 1 * 1 * 6 * 9 * * *
51 0.0 0.0 0.0 0.0 9.1 * 5.0 2.3 5.2
C9R skw61 M ±255 ±85.0 ±95.0 ±10.5 ±63.3 ±9.23 ±0.7 ±3.58 ±9.74 9
10 10 70 60 7 1 7.
s 5 .0± .0± .0± .0± .0± .0± 3±1 2.3
TW kw61 M ±965 07.0 07.0 29.3 48.1 1.35 5.01 .011 ±66 6
* 10. * 10. * 30. * 40. * 2. * 2 6. 6.
s 5± 0±0 0±1 0±1 0±3 1±6 .0± 2±8 1±6
C9R kw8 M 765 6.0 6.0 0.4 1.2 .74 1.9 .79 .06 9
1 1 5 5 4
6 0.0 0.0 0.0 0.0 9.0 2.0 .2± 3.1
T skw ±06 ±66. ±66. ±28. ±28. ±7.2 ±5.0 4.20 ±7.5
W 8 M 5 0 0 3 1 5 1 1 6 6
) ) )s/c )s )
)mp )m )m mm(D mm(D ) ric( /mc( 2s/m )n(
龄年 别性 b(RH m(WA m(WP DEVL SEVL ％(SF cFCV cVAP (AVA 品样
sk 51± 0±7 0±7 0±8 0±3 2±6 .0± 3±6 2.2
C9R w42 M 205 5.0 5.0 4.5 2.4 .22 1.5 .37 ±04 5
10.0 10.0 50.0 30.0 5.1 3.0 9.2 1.3
skw 9±5 ±17 ±17 ±99 ±98 ±9. ±9. ±3.1 ±1.
TW 42 M 65 .0 .0 .3 .1 25 01 11 76 5
* 1 * 1 * 6 * 9 * * *
51 0.0 0.0 0.0 0.0 9.1 * 5.0 2.3 5.2
C9R skw61 M ±255 ±85.0 ±95.0 ±10.5 ±63.3 ±9.23 ±0.7 ±3.58 ±9.74 9
10 10 70 60 7 1 7.
s 5 .0± .0± .0± .0± .0± .0± 3±1 2.3
TW kw61 M ±965 07.0 07.0 29.3 48.1 1.35 5.01 .011 ±66 6
* 10. * 10. * 30. * 40. * 2. * 2 6. 6.
s 5± 0±0 0±1 0±1 0±3 1±6 .0± 2±8 1±6
C9R kw8 M 765 6.0 6.0 0.4 1.2 .74 1.9 .79 .06 9
1 1 5 5 4
6 0.0 0.0 0.0 0.0 9.0 2.0 .2± 3.1
T skw ±06 ±66. ±66. ±28. ±28. ±7.2 ±5.0 4.20 ±7.5
W 8 M 5 0 0 3 1 5 1 1 6 6
) ) )s/c )s )
)mp )m )m mm(D mm(D ) ric( /mc( 2s/m )n(
龄年 别性 b(RH m(WA m(WP DEVL SEVL ％(SF cFCV cVAP (AVA 品样
[0192] 表1中的值是平均值±SEM。在表1中使用的符号：HR＝心率；AW，PW＝前壁和后壁的厚度(左心室)；LVEDD，LVESD分别表示左心室舒张和收缩末期尺寸；FS＝缩短分数＝(LVEDD-LVESD)/LVEDD x100％；ETC＝对于HR校正的射血时间；VCFC＝对HR校正的周期缩短速度＝FS/ETC；PAVC＝对HR校正的主动脉速度顶点；E-波＝早期-充盈传播(transmitral)舒张期波；LVESP，LVEDP＝左心室收缩和舒张末期压；+dP/dtmax＝左心室压的最大正一阶导数；-dP/dtmax＝左心室压的最大负一阶导数；AVA＝主动脉速度增速*(PAVc/加速时间)；相对WTP＜0.05。
[0193] 1.2主动脉绑扎(AB)小鼠模型
[0194] 在小鼠模型中由主动脉绑扎(AB)造成压力过载而诱导心脏肥大。
[0195] 通过外科手术在C57BL小鼠实施压力过载。升主动脉缩窄(coarction)(称为主动脉绑扎)诱导心脏肥大以及心肌生长，特别是在左心室，这些是作为主动脉缩窄的一种初级反应。在这种小鼠模型的后期阶段中心脏会变得肥大并最终膨胀。该模型可以很好地表征并已证明可以高度重现，根据经验该模型有10-15％或更低的低死亡率。在缩窄之后，该动物模型可用于评价响应血液动力学应力的左心室肥大和心力衰竭的发展进程。
[0196] 简言之，用氯胺酮(90mg/kg)和甲苯噻嗪(Rompun)(10mg/kg)混合麻醉C57BL小鼠并使用25号针结扎主动脉。假(sham)手术小鼠经历相同的手术步骤，只是不用针扎紧。
[0197] 实验时间点
[0198] 为了检验原发肥大反应和后期的扩张反应，绑扎的动物和假手术对照在干预后一、二、四和八周处死。通过超声心动图分析以评估心脏功能和肥大发展，并通过组织学检查处死后加以确认。表2展示了不同的时间点用超声波心动描记术评价的心脏功能的总览。技术人员熟知表2中给出的详细超声心动图参数并能在例如Asahi，M.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(2004)9199-9204以及Oudit，G.Y.等，Nat.Med.9(2003)1187-1194文献中找到。
[0199]
[0200] 除了功能参数以外，对取自于2、4和8周的AB小鼠和对照小鼠心脏组织进行苏木紫/伊红(HE)染色的组织学分析。组织学证实了在AB小鼠中预期的坏死和重塑过程，而在假手术小鼠的心脏组织中未显示任何显著的变化。在手术之后二周，结扎小鼠的心室显示出明显的左心室肥大，四周后进一步发展，并在术后八周变得十分类似于扩张型心肌病的终末期。
[0201] 实施例2
[0202] 样品制备和质谱分析
[0203] 心脏匀浆以及细胞器分离
[0204] 分离心脏，除去心房，将心室用刀片小心切碎并用冰冷却的PBS(磷酸盐缓冲盐水)彻底冲洗以除去剩余血液。使用较松的手持玻璃匀浆器在10ml裂解缓冲液(250mM蔗糖，50mM Tris-HCl，pH 7.6，1mMMgCl2，1mM DDT(二硫苏糖醇)和1mM PMSF(苯甲基磺酰氟))中匀浆组织30秒。所有后续步骤都在4℃下操作。裂解液用台式离心机在800×g下离心15分钟；上清液作为胞质溶胶、线粒体和微粒体组分的来源。包含细胞核的沉淀块用8ml裂解缓冲液稀释并加到4ml0.9M蔗糖缓冲液(0.9M蔗糖，50mM Tris-HCl pH 7.6，1mM MgCl2，1mM DDT和1mM PMSF)上层，4℃1000×g离心20min。得到的沉淀再悬浮于8ml 2M蔗糖缓冲液(2M蔗糖，50mM Tris-HCl pH 7.4，5mMMgCl2，1mM DTT和1mM PMSF)，加到4ml的
2M蔗糖缓冲液上层并在150,000×g下超速离心1h(Beckman SW 40.1转子)而沉淀。细胞核作为沉淀回收。在4℃7500×g下再离心20分钟从上清液中分离线粒体；获得的沉淀用裂解缓冲液洗涤两次。将除去线粒体的细胞质用Beckman SW 41转子在100,000×g超速离心1h沉淀微粒体。上清液为胞质溶胶部分(＝cyto)。
2M蔗糖缓冲液上层并在150,000×g下超速离心1h(Beckman SW 40.1转子)而沉淀。细胞核作为沉淀回收。在4℃7500×g下再离心20分钟从上清液中分离线粒体；获得的沉淀用裂解缓冲液洗涤两次。将除去线粒体的细胞质用Beckman SW 41转子在100,000×g超速离心1h沉淀微粒体。上清液为胞质溶胶部分(＝cyto)。
[0205] 提取细胞器
[0206] 用低渗裂解缓冲液(10mM HEPES，pH 7.9，1mM DTT，1mM PMSF)在冰上孵育线粒体30分钟，抽提可溶的线粒体蛋白。使用超声法短暂地处理悬浮物，在13,000×g离心30min除去碎片。上清液作为“mito1”组分。获得的不溶的沉淀用膜去污剂抽提缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.8，0.4M NaCl，15％甘油，1mM DTT，1mM PMSF，1.5％Triton-X-100)再悬浮并温和振摇30分钟后在13,000×g离心30分钟；上清液作为“mito 2”组分。
[0207] 通过将微粒体在膜去污剂抽提缓冲液中再悬浮来抽提膜相关蛋白。温和振动悬浮物孵育1h并在13,000×g离心30min除去不溶碎片。上清液作为“micro”组分。
[0208] 细胞器提取物的消化和MudPIT分析：
[0209] 从每个组分中取大约含100μg总蛋白的整分试样(通过Bradford测定法确定)用5倍体积的冰冷丙酮在大约20℃沉淀过液，然后在13,000×g离心15min。蛋白沉淀在小体积的8M脲、50mM Tris-HCl、pH 8.5、1mM DTT的溶液中37℃溶解1h，接着用5mM碘乙酰胺在37℃避光处理1h进行羧酰氨基甲基化。用相等体积的100mM、pH 8.5的碳酸氢铵稀释样品至4M脲，并用1∶150比例的内蛋白酶Lys-C(Roche Diagnostics，Laval，奎北克，加拿大)在37℃消化过夜。第二天，用相等体积的50mM、pH8.5的碳酸氢铵稀释样品至2M脲，补加CaCl2至终浓度1mM，并用Poroszyme胰蛋白酶珠(应用生物系统(Applied Biosystems)，Streetsville，Ontario，加拿大)在30℃转动孵育过夜。产生的肽混合物用SPEC-Plus PT C18管(AnsysDiagnostics，Lake Forest，加拿大)按厂家说明进行固相抽提然后存储于-80℃以备后期使用。如所述，设定了一个全自动、需时20h 12个步骤的多循环MudPIT程序(Mol.Cell Proteom.2(2003)96-106)。简短而言，HPLC四元泵与LCQ DECA XP离子阱质谱仪(Thermo Finnigan，San Jose，CA)连接。将一支100μM内径的熔融石英毛细管微型柱(Polymicro Technologies，Phoenix，AZ)用P-2000激光拉伸器(SutterInstruments，Novato，CA)拉成极细的尖头并填入8cm的5μM ZorbaxEclipse XDB-C18树脂(Agilent Technologies，Mississauga，Ontario，加拿大)，再填入6cm的5μM Partisphere强阳离子交换树脂(Whatman，Clifton，NJ)。将单个样品用高压容器手动加在分离柱上。层析溶剂的条件严格按Kislinger，T.等，Mol.Cell Proteom.2(2003)96-106所述。
[0210] 蛋白质的鉴定和验证：
[0211] 用SEQUEST数据库检索算法将肽串联质谱与在局部-维持最小冗余FASTA格式的小鼠和人类蛋白序列(来自于Swiss-Prot/TrEMBL和IPI数据库)数据库中的肽序列匹配。为了统计学评估实验性假发现率以控制并且因此最小化假阳性鉴定，将全部光谱都对无论正常(正向的)和倒置(翻转的)的氨基酸方向的蛋白序列进行搜索(Kislinger，T.等Mol.Cell Proteom.2(2003)96-106)。然后应用STATQUEST滤除算法至所有假定的搜索结果以获得对于每个候选鉴定结果的统计可靠性测定(置信度得分)(截止p值≤.15，相当于85％或更大可能性的是正确匹配)。高置信度匹配被解析成为一种使用基于Perl脚本的内部SQL型数据库。该数据库被设计成可容纳对与给定蛋白匹配的多种肽的数据库搜索结果和光谱信息(扫描首(scan headers))，以及关于样品名、实验编号、MudPIT步骤、细胞器源、氨基酸序列、分子量、等电点、带电性和置信水平的信息。只有那些具有预计置信度
95％或更高的p值以及至少二种光谱都一起检出的蛋白才能保留以进行进一步分析。
95％或更高的p值以及至少二种光谱都一起检出的蛋白才能保留以进行进一步分析。
[0212] 实施例3
[0213] 模型系统中获得数据的统计学评价。
[0214] 3.1用于生成R9C小鼠模型差异表达p值的统计方法
[0215] 对于137个不同实验过程的每一个，用实施例2所述的方法获得的原始数据由每种都有光谱计数的6190个蛋白组成，所有光谱都与该蛋白相关。原始数据，6190个蛋白亚组，都进行了国际通用的规范化，首先将在每个过程中的数据根据他们的光谱计数分进数目相同的组中，对于我们的分析设置成100。然后对每组(1-100)进行LOESS(Cleveland，W.S. 和 Devlin，S.J.，Journal of The American StatisticalAssociation83(1988)596-610)，对于具有类似光谱计数的一组基因调整在光谱计数中的差异。
[0216] 基于原始数据我们构建了两个线性模型，第一个模型使用对照/疾病，时间(8周，16周，末期)以及位置(cyto、micro、mitoI、mitoII)作为因子并使用下式描述：
[0217] 过程计数＝β0+β1时间+β2时间2+β3位置+β4对照 (1)
[0218] 第二个模型仅使用时间(8周，16周，末期)和位置(cyto、micro、mitoI、mitoII)作为因子并用下式描述：
[0219] 过程计数＝β0+β1时间+β2时间2+β3位置 (2)
[0220] 其中β0为截距，β1、β2、β3和β4为可变时间、时间平方、位置和对照/疾病的斜率估计值。
[0221] 用Anova对这两个模型比较，解消假设为两模型之间无差异。而低的p值显示无充足的证据说这两个模型是相同的。额外的信息显示状态(即，对照/疾病)似乎是该模型的重要部分。为了提取在我们的对照和疾病模型之间相对蛋白丰度上有重大变化的蛋白，我们的6190个蛋白列表根据他们计算的p值进行分级。这样产生了一组593个具有p值＜0.05的蛋白。
[0222] 为了从上述模型中解释多重假设检验，p值用假发现率(FDR)校正法进行校正，特别是Benjamini-Hochberg FDR校正法(Benjamini，Y.和Hochberg，Y.，Journal of the Royal Statistical Society B.57(1995)289-300)。这样产生了一组40个具有对于R9C小鼠模型校正p值＜0.05的蛋白
[0223] 3.2用于产生主动脉绑扎小鼠模型差异表达p值的统计方法。
[0224] 如上所述应用于R9C小鼠模型的相同数据分析法被用于主动脉绑扎小鼠模型的数据集。
[0225] 实施例4
[0226] 用Western印迹法检测标识物SLIM-1
[0227] 从R9C小鼠心脏组织样品得到粗组织裂解液。简言之，切碎心脏组织，在杜恩斯匀浆器中碾碎并于8000g离心30min以除去细胞核和细胞碎片。上清液用于Western印迹法。
[0228] 使用德国Karlsruhe的Invitrogen的试剂和设备进行SDS-PAGE和Western印迹。对于每个测试的组织样品，10μg的胞质组分用还原性NuP (Invitrogen)SDS样品缓冲液稀释并在95℃加热10min。样品在MES缓冲系统中用4-12％NuP 凝胶
(Tris-甘氨酸)进行电泳。将凝胶分离的蛋白混合物用Invitrogen XCell IITM印迹模块(Invitrogen))和NuP 转移缓冲系统印迹至硝酸纤维素膜上。将膜在PBS/0.05％
Tween-20洗涤3次并用 -Block封闭缓冲液(A151.1；Carl Roth GmbH，Karlsruhe，Germany)封闭2小时。将一抗，四个半LIM结构域的兔多克隆抗体(FHL-1)(IMG-3374；
Imgenex/Cedarlane)用 -Block封闭缓冲液稀释并与膜孵育1小时。将膜在
PBS/0.05％Tween-20中洗涤6次。特异性结合的SLIM-1的第一抗体用POD缀合的的抗兔IgG多克隆抗体进行标记，用0.5x -Block封闭缓冲液稀释至10mU/ml。孵育1h后，将膜在PBS/0.05％Tween-20中洗涤6次。为了检测已结合的POD缀合的抗兔抗体，将膜PLUS
用Lumi-Light Western印迹底物(货号-2015196，RocheDiagnostics GmbH，Mannheim，德国)孵育并对放射自显影膜曝光。
(Tris-甘氨酸)进行电泳。将凝胶分离的蛋白混合物用Invitrogen XCell IITM印迹模块(Invitrogen))和NuP 转移缓冲系统印迹至硝酸纤维素膜上。将膜在PBS/0.05％
Tween-20洗涤3次并用 -Block封闭缓冲液(A151.1；Carl Roth GmbH，Karlsruhe，Germany)封闭2小时。将一抗，四个半LIM结构域的兔多克隆抗体(FHL-1)(IMG-3374；
Imgenex/Cedarlane)用 -Block封闭缓冲液稀释并与膜孵育1小时。将膜在
PBS/0.05％Tween-20中洗涤6次。特异性结合的SLIM-1的第一抗体用POD缀合的的抗兔IgG多克隆抗体进行标记，用0.5x -Block封闭缓冲液稀释至10mU/ml。孵育1h后，将膜在PBS/0.05％Tween-20中洗涤6次。为了检测已结合的POD缀合的抗兔抗体，将膜PLUS
用Lumi-Light Western印迹底物(货号-2015196，RocheDiagnostics GmbH，Mannheim，德国)孵育并对放射自显影膜曝光。
[0229] 图3展示了典型的实验结果。对比在相应的时间点来源于健康小鼠的组织样品，来源于患有心力衰竭的R9C实验动物的组织样品中可以看到SLIM-1的强过量表达。
[0230] 实施例5
[0231] 用ELISA检测人血清和血浆样品中的SLIM-1
[0232] 为了在人血清或血浆中检测SLIM-1，开发了一种三明治式ELISA。为捕获抗原，使用抗SLIM-1的多克隆抗体的等分试样，它来自于用HEK细胞产生的SLIM-1对兔免疫。为检测抗原，使用由氨基酸233-346组成的SLIM片段在山羊中产生的血清，它们分别与生物素和地高辛缀合。
[0233] 将覆盖有抗生物素蛋白链菌素的96孔微量滴定板与100μl的10μg/ml生物素酰化的抗-SLIM-1多克隆抗体的1xPBS溶液孵育60分钟。之后用1xPBS+0.02％Tween-20洗涤平板三次，用PBS+1％BSA(牛血清白蛋白)封闭，然后再用1xPBS+0.02％Tween-20洗涤三次。分别用连续稀释的重组SLIM-1作为标准抗原或用来自于患者或对照个体的稀释血清或血浆样品(1∶5)孵育孔1小时。结合SLIM-1之后，平板用1x PBS+0.02Tween-20洗涤三次。为了特异性检测结合的SLIM-1，孔用100μl的0.5μg/ml的地高辛化抗SLIM-1多克隆抗体的1xPBS，1％BSA溶液孵育45min。其后洗涤平板三次以除去未结合的抗体。下一步，用75mU/ml抗地高辛-POD缀合物(Roche DiagnosticsGmbH，Mannheim，德国，货号
1633716)的1xPBS，1％BSA溶液孵育孔30分钟。然后，平板用相同的缓冲液洗涤六次。为了检测抗原-抗体复合体，用100μl ABTS溶液(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德国，货号11685767)孵育孔并于30分钟之后用ELISA读数器在405和492nm处测定光密度(OD)。
1633716)的1xPBS，1％BSA溶液孵育孔30分钟。然后，平板用相同的缓冲液洗涤六次。为了检测抗原-抗体复合体，用100μl ABTS溶液(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德国，货号11685767)孵育孔并于30分钟之后用ELISA读数器在405和492nm处测定光密度(OD)。
[0234] 测定获自于不同的患有心力衰竭患者的10份血清样品(HF样品)和从正常健康供者获得10份血清(NHS)。之后按以上描述进行分析程序，以下结果(见表3)由这些样品获得：
[0235] 表3：SLIM-1 ELISA结果(检测显影样品)
[0236]HF样品 OD
5078 0,360
5084 0,553
5085 0,353
5100 0,442
5001 0,318
5104 0,475
5107 0,344
5112 0,361
5113 0,222
5114 0,427
MW 0,385
NHS样品
2 0,232
33 0,465
36 0,299
41 0,305
44 0,349
51 0,164
57 0,336
60 0,206
62 0,117
77 0,163
MW 0,263
5078 0,360
5084 0,553
5085 0,353
5100 0,442
5001 0,318
5104 0,475
5107 0,344
5112 0,361
5113 0,222
5114 0,427
MW 0,385
NHS样品
2 0,232
33 0,465
36 0,299
41 0,305
44 0,349
51 0,164
57 0,336
60 0,206
62 0,117
77 0,163
MW 0,263
[0237] 表3总结的数据也显示在图4和5中。从图4和5中可以明显看到，与从对照个体获得的样品相比，从患HF患者获得的血清中SLIM-1的水平平均要高。
[0238] 实施例6
[0239] 评估心力衰竭的包括标识物SLIM-1的标识物组合
[0240] 实施例6.1NT-proBNP和SLIM-1的标识物组合
[0241] 评价NT-proBNP和SLIM-1标识物组合用于分别区分处于阶段B和阶段C及D的患者。通过分析从明确鉴定的个体组，即50个按照ACA/ACC的HF分类标准处于阶段B的个体和50个患有HF并按照ACA/ACC的HF分类标准处于阶段C的患者，获得的个体液体样品来评估诊断的准确性。在获自于每个这些个体的血清样品中，用一种已商品化的测定剂(Roche Diagnostics，NT-proBNP测定剂(对于 系统免疫测定分析剂货号03121640160))测定的NT-proBNP，和如上所述测定的SLIM-1被量化。按照Zweig，M.H.和Campbell，上文的方法进行ROC-分析。通过正规化的判别分析(Friedman，J.H.，J.of The American Statistical Association84(1989)165-175)来计算对于SLIM-1与已确立的标识物NT-proBNP的组合区别阶段C患者与阶段B个体的判别能力。
[0242] 实施例6.2肌钙蛋白T和SLIM-1的标识物组合
[0243] 评价肌钙蛋白T和SLIM-1标识物组合用于区分患有急性心脏事件和患有慢性心脏病的患者。通过分析从明确鉴定的个体组，即50个诊断为患急性心脏事件的个体和50个诊断为患慢性心脏病的患者，获得的个体液体样品来评估诊断的准确性。在获自于每个这些个体的血清样品中，用一种已商品化的测定剂(Roche Diagnostics，肌钙蛋白T测定剂(对于 系统免疫测定分析剂货号2017644))测定的肌钙蛋白T和如上所述测定的SLIM-1被量化。按照Zweig，M.H.和Campbell，G.上文进行ROC-分析。通过正规化的判别分析(Friedman，J.H.，J.of The American Statistical Association 84(1989)165-175)来计算对于SLIM-1与已确立的标识物NT-proBNP的组合区别阶段C患者和阶段B个体的判别能力。
[0244] 实施例6.3NT-proBNP和CRP的标识物组合
[0245] 评价C-反应蛋白和SLIM-1标识物组合用于区分诊断为患有心肌病的患者和未患任何混杂的心脏病的对照。通过分析从明确鉴定的个体组，即50个具有心肌病的个体和50个健康对照个体，获得的个体液体样品来评估诊断的准确性。在获自于每个这些个体的血清中，用一种已商品化的测定剂(Roche Diagnostics，CRP-测定剂(Tina-quant C反应蛋白(latex)高敏感性的测定剂-Roche货号11972855216)测定的CRP和如上所述测定的SLIM-1被量化。按照Zweig，M.H.和Campbell，G.上文的方法进行ROC-分析。通过正规化的判别分析(Friedman，J.H.，J.of The American Statistical Association84(1989)165-175)计算SLIM-1与已确立的标识物NT-proBNP的组合区别阶段C患者和阶段B个体的判别能力。
[0246] 虽然为了清楚和理解的目的上述发明已经进行了详细描述，本领域技术人员将能够通过阅读公开内容，从形式和细节上进行多种改变，而不偏离本发明附加权利要求的真实范围。
[0247] 所有出版物、专利和申请以与每篇所述参考文献被特异地和单独地指明全文通过援引并入本文相同的程度，全文通过援引并入本文。