利用超滤膜分离怀牛膝提取液中活性成分的方法

摘要

利用超滤膜分离怀牛膝提取液中活性成分的方法，先将怀牛膝提取液进行固液分离，得分离液；将分离液以膜孔径为0.05µm、膜材质为AL2O3的陶瓷微滤膜机组过滤，得滤液；微滤结束后，截留液用水顶洗3次，每次顶洗量为截留液体积的2倍，得微滤及顶洗合并液；将所得合并液用超滤膜机组过滤，得超滤液；截留液用水顶洗3次，顶洗温度35-40℃，每次顶洗量为截留液体积的2倍，得超滤及顶洗合并液；本方法与现有技术相比，操作简单，能耗低，活性成分透过率高，生产周期短；超滤后的药液无论是配制复方制剂还是中药酒剂，产品质量都十分稳定。

权利要求

1.利用超滤膜分离怀牛膝提取液中活性成分的方法，先将怀牛膝以乙醇回流提取，得提取液；再将提取液采用离心机进行固液分离，得分离液；其特征在于还包括下述步骤：a.将分离液以膜孔径为0.05um、膜材质为AL2O3的陶瓷微滤膜机组过滤，操作温度：45～

75℃，跨膜压力：0.05～0.25Mpa，得滤液；b.微滤结束后，截留液用水顶洗3次，每次顶洗量为截留液体积的2倍，得微滤及顶洗合并液；c.将所得合并液用超滤膜机组过滤，操作温度：35～45℃、跨膜压力：0.6～1.0Mpa、膜管型号为5万，得超滤液；d.截留液用水顶洗3次，顶洗温度35-40℃，每次顶洗量为截留液体积的2倍，得超滤及顶洗合并液；合并液中齐墩果酸及多糖的透过率分别大于或等于98.73％和99.72％，透过液浊度小于或等于

2.70NTU。

2.根据权利要求1所述的利用超滤膜分离怀牛膝提取液中活性成分的方法，其特征在于：所述怀牛膝提取液是在怀牛膝中投入12倍量50％乙醇回流提取3次，每次提取1.5h所制得的合并液。

3.根据权利要求1所述的利用超滤膜分离怀牛膝提取液中活性成分的方法，其特征在于：所述怀牛膝提取液的固液分离采用碟片式离心机，转速为6000r/min。

4.根据权利要求1所述的利用超滤膜分离怀牛膝提取液中活性成分的方法，其特征在于：所述陶瓷微滤膜机组的组合方式是将两根陶瓷膜管并联为一组，再将两组串在一起组成两并两串式，每根装0.05um膜芯9根，共36根。

5.根据权利要求1所述的利用超滤膜分离怀牛膝提取液中活性成分的方法，其特征在于：所述超滤膜机组是采用5-8根超滤膜并联，其中每根超滤膜膜管装5万分子量膜芯4根，共计20-32根膜芯，总膜面积800-1000平方米。

说明书

利用超滤膜分离怀牛膝提取液中活性成分的方法

(一)技术领域

[0001] 本发明涉及中药活性成分的分离方法，具体是利用超滤膜分离怀牛膝提取液中活性成分的方法。

[0002] (二)现有技术目前怀牛膝提取液的分离多以成分间的极性差异为基本原理来进行分离。怀牛膝提取液中除含有齐墩果酸、多糖等活性成分外，还含有大量的植物蛋白、鞣质、淀粉、细菌等大分子物质以及许多微粒、絮状物，这些物质不但没有药效作用，而且对中药复方制剂后期调配及产品的稳定性产生较大影响。而传统的分离工艺(溶剂沉淀、萃取技术)很难将这些物质完全去除，并且在除杂过程中不同程度地存在以下问题：第一、操作步骤复杂，条件苛刻、能耗高、生产周期长；第二、无效成分去除率和有效成分保留率不够高，影响药效的充分发挥；而吸附分离技术(大孔树脂)虽能很好的去除这些杂质，但此技术操作步骤复杂，并且过分强调单个组分，使中药失去了原有的复方特色，影响药效。

[0003] (三)本发明的目的就是提出一种利用超滤膜分离怀牛膝提取液中活性成分的方法，为中药复方制剂或中药酒剂的后期配制提供质量稳定的中间体；本方法活性成分透过率高，透过液浊度低，操作简单，能耗低，生产周期短。

[0004] 本方法包括下述步骤：a.将分离液以膜孔径为0.05um、膜材质为AL2O3的陶瓷微滤膜机组过滤，操作温度：45～75℃，跨膜压力：0.05～0.25Mpa，得滤液；b.微滤结束后，截留液用水顶洗3次，每次顶洗量为截留液体积的2倍，得微滤及顶洗合并液；c.将所得合并液用超滤膜机组过滤，操作温度：35～45℃、跨膜压力：0.6～1.0Mpa、膜管型号为5万，得超滤液；d.截留液用水顶洗3次，顶洗温度35-40℃，每次顶洗量为截留液体积的2倍，得超滤及顶洗合并液；合并液中齐墩果酸及多糖的透过率分别大于或等于98.73％和99.72％，透过液浊度小于或等于2.70NTU。

[0005] 所述怀牛膝提取液是在怀牛膝中投入12倍量50％乙醇回流提取3次，每次提取1.5h所制得的合并液。

[0006] 所述怀牛膝提取液的固液分离采用碟片式离心机，转速为6000r/min。

[0007] 所述陶瓷微滤膜机组的组合方式是将两根陶瓷膜管并联为一组，再将两组串在一起组成两并两串式，每根装0.05um膜芯9根，共36根。

[0008] 所述超滤膜机组是采用5-8根超滤膜并联，其中每根超滤膜膜管装5万分子量膜芯4根，共计20-32根膜芯，总膜面积800-1000平方米。

[0009] 本发明通过分析传统工艺中的一些不足，并根据怀牛膝中有效成分和杂质组成情况，采取相应规格的微滤膜及超滤膜对怀牛膝提取液中的活性成分进行分离，即将怀牛膝提取液通过超滤膜分离选择性去除其中的一些大分子物质(植物蛋白、胶质、鞣质、细菌等)，最大限度的保留活性成分齐墩果酸、多糖等，并将其用于中药复方制剂或中药酒剂的后期调配，从而达到稳定终产品质量的目的。

[0010] 本工艺与传统工艺的区别在于，传统工艺主要利用不同组分在不同溶剂中溶解度的不同而实现分离，而超滤膜分离技术是以具有选择透过性的膜为分离介质，在某种驱动力(压力差)的作用下，物料中不同分子量、不同空间结构的成分依据滤膜孔径的大小或通过或被截留，达到分离去杂的目的，它实现了中药有效部位的分离，充分有效地保留了中药原方配伍成分。

[0011] 虽然超滤技术已经在中药活性成分分离中得到应用，但每一种中药材由于其活性成分及杂质的组成不同，它们的微观分子结构不同，分离后分离液的使用方式不同，因此，采用什么型号的膜管膜芯，膜管的组合方式以及操作条件来进行分离，是膜分离中要解决的关键问题。

[0012] 为筛选出本工艺的最佳工艺参数，本发明以不同操作条件下活性成分超滤透过率及透过液的浊度为考核指标进行实验，具体实验情况如下：

[0013] 表1 九种操作条件一览表

[0014]

[0015] 表2 不同操作条件下活性成分的透过率

[0016]

[0017] 【注】：超滤进料液中齐墩果酸总量：10223.51mg，多糖总量：421.03g[0018] 透过率＝透过液中某一成分含量/进料液中某一成分总量

[0019] 表3 不同操作条件下超滤膜透过液的浊度变化情况

[0020]

[0021] 通过超滤膜活性成分透过率及透过液浊度综合比较优选出本工艺过程最佳操作参数为：温度35～45℃、跨膜压力：0.6～1.0Mpa、膜管型号：5万。

[0022] 由于齐墩果酸及牛膝多糖的含量测定尚无统一方法，本发明中专门摸索并建立了齐墩果酸及牛膝多糖含量测定方法。经验证，本检测方法易于操作，重现性好。

[0023] 具体测定方法如下：

[0024] 齐墩果酸的测定(紫外-可见分光光度法)

[0025] 1、对照品溶液的配制：

[0026] 精密称取齐墩果酸标准品5.18mg(中国药品生物制品检定所110709-200304)，至50ml容量瓶中用氯仿溶解，并用氯仿定容至刻度，摇匀，备用。

[0027] 2、标准曲线

[0028] 用可调式微量移液器分别精密吸取200，400，600，800，1000μl对照品溶液于10ml具塞比色管中，分别用氯仿定容到1ml。然后水浴挥干溶剂。各加6％香草醛冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，盖上塞子后在70℃水浴15分钟，用冰水冷却，分别加冰醋酸5ml，摇匀。另再做一空白，用TU-1901双光束紫外可见分光光度计于560nm处检测其吸光度。既可得标准曲线。线性回归方程为：Abs＝0.0516*(C)+0.00435，线性范围r＝0.9989；

[0029] 3、供试品的前处理

[0030] 取供试品溶液(包括牛膝提取液，微滤液，超滤液)水浴挥干溶剂，用5％硫酸：95％酒精(1∶1)水解6小时，水温控制在100℃左右，水解完全后蒸去酒精。然后放冷后，用氯仿20ml、10ml、10ml分3次萃取，萃取液用氯仿液定容至50ml，备用。

[0031] 4、齐墩果酸的测定

[0032] 用可调式微量移液器分别精密吸取上述前处理的提取液1ml(或者0.5ml)。挥干氯仿后，加6％香草醛冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，盖上塞子后在70℃水浴15分钟，用冰水冷却，再加冰醋酸5ml，摇匀。另再做一空白，用TU-1901双光束紫外可见分光光度计于560nm处检

[0033] 测其齐墩果酸的含量。

[0034] 牛膝总多糖的测定(硫酸苯酚法)

[0035] 1、实验原理：提取液中的多糖成分在硫酸的作用下，先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后和苯酚缩合成有色化合物，用紫外分光光度法于490nm处测定其洗光度，并由此计算其含量。

[0036] 2、标准品溶液的配制：

[0037] 精密称取D-葡萄糖标准品12mg至100ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度。摇匀即得。

[0038] 3、标准曲线的制备：

[0039] 用可调式微量移液器分别精密吸取D-葡萄糖标准品溶液0.1ml，0.2m l，0.4ml，0.6ml，0.8ml，1.0ml于10m l比色管中，分别补加蒸馏水至1ml，另再做一空白组。加入5％苯酚溶液1ml(配制苯酚溶液的苯酚需重蒸过)。然后迅速加入5ml浓硫酸，于沸水中煮沸
15分钟。冷却至室温后于490nm处测定吸光度。既可得标准曲线。线性回归方程为Abs＝
0.0579×(C)-0.00355，线性范围r＝0.9998。

[0040] 4、供试品的前处理：供试品(包括牛膝提取液，微滤液，超滤液)未做特殊的前处理，只是根据相应浓度进行稀释即可(一般稀释100～200倍)

[0041] 5、牛膝总多糖的测定：

[0042] 精密吸取上述供试品1ml，加入5％苯酚溶液1ml(配制苯酚溶液的苯酚需重蒸过)。然后迅速加入5ml浓硫酸，于沸水中煮沸15分钟。另再做一空白，冷却至室温后于490nm处测定吸光度，即可检测出供试品中多糖的浓度。

[0043] 本发明具有以下特点：

[0044] (1)在常温下操作，适于热敏性物质的分离、纯化；(2)分离过程无相变发生，不会改变中药的有效成分及结构；(3)分离系数大，能够更好地除去杂质，并能有效地保留中药原方配伍成分，有效成分损失较少，成品稳定性优于传统产品；(4)能耗低；(5)操作方便，易于自动化，生产周期短。

[0045] 本发明除具有以上特点外，还具有下述特点(1)以特定孔径、材质和组合方式的微滤膜机组和超滤膜机组二重组合，在优选的工艺条件下分离，分离液中活性成分透过率高，透过液浊度明显低于现有方法；(2)摸索并建立了中药怀牛膝中活性成分齐墩果酸及牛膝多糖的含量测定方法，为本发明定量的判断分离效果提供了直观的数据支持。

[0046] 本工艺与大孔树脂生产周期对比情况：

[0047]

[0048] 注：大孔树脂与超滤膜分离工艺进料量都为：600Kg，其中各工艺过程的的提取阶段相同。

[0049] 大孔树脂与超滤膜分离工艺有效成分转移率对比表

[0050]

[0051] 分析：本发明方法生产周期明显短于大孔树脂分离工艺，且超滤膜分离工艺的分离效果明显优于大孔树脂的分离效果。在大孔树脂的分离纯化过程中，多糖等有效成分被洗脱掉，导致多糖转移率为0.00％，而超滤膜分离工艺根据有效成分分子量的大小、空间结构的不同对有效成分进行筛分分离，实现中药有效部位的分离，充分保留了中药原方配伍成分。(四)具体实施方式

[0052] 1、怀牛膝提取液的制备 在怀牛膝中投入12倍量的50％乙醇，回流提取3次，每次提取1.5h，合并3次提取液，分别测定活性成分含量，备用；