一种治疗溃疡性结肠炎的药物及其制备方法

摘要

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种治疗溃疡性结肠炎的药物及其制备方法。本发明治疗溃疡性结肠炎的药物，是由下列重量份的原料药制成：白头翁5～30份、黄柏4～24份、黄连2～12份、秦皮4～24份、生黄芪3～18份、焦白术3～18份、槐花米3～18份、地榆3～18份、附片2～10份。本发明还利用果胶钙作为包衣材料与有效药物素片制成结肠片，能实现结肠靶向给药。其疗效明显优于现有药物。

权利要求

一种治疗溃疡性结肠炎的药物，其特征是它是由下列重量份的原料药制成：白头翁5～30份、黄柏4～24份、黄连2～12份、秦皮4～24份、生黄芪3～18份、焦白术3～18份、槐花米3～18份、地榆3～18份、附片2～10份。

2. —种权利要求1所述治疗溃疡性结肠炎的药物的制备方法，它包括下列步骤：1)称取各原料药白头翁、黄柏、黄连、秦皮、生黄芪、焦白术、槐花米、地榆和附片，备用；2)将权利要求1中所述重量配比的白头翁全处方量、焦白术全处方量和其余药味半处 方量混合，超微粉碎至粒径达IOOnm以下得纳米粉原药，备用；3)将余下的黄柏、黄连、秦皮、生黄芪、槐花米、地榆和附片7药味半处方量加水煎煮两 次，合并两次水煎液，浓缩至比重1. 2〜1. 8得提取浓缩液，备用；4)将提取浓缩液喷洒至纳米粉原药上制软材，过筛制得湿颗粒，50°C〜60°C干燥；就 制备成了药物的活性组分。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于在步骤4)后还有以下步骤：5)将低甲酯果胶加蒸馏水溶胀，热至50°C〜60°C溶解，浓度达5%〜15% ；倾入氯化 钙饱和溶液至无白色絮状沉淀生成，边加边搅拌，得钙含量10%以上的混悬胶液；6)将步骤4)活性组分压制成素片，再用步骤5)制得的果胶钙混悬胶液包衣至素片增 重8%〜20%，制得中药结肠片。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤5)中低甲酯果胶是酯化度 < 50%的甲酯果胶。

说明书

一种治疗溃疡性结肠炎的药物及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及一种治疗溃疡性结肠炎的药物及其制备方法。

背景技术

[0002] 一、溃疡性结肠炎是消化系统难治疾病之一，现代医学治疗疗效不理想，副作用大

[0003] 溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC)属于炎症性肠病，是消化系统难治疾病 之一，临床上以腹痛、腹泻和脓血黏液便，内镜下以结肠黏膜溃疡糜烂为主要表现。其发病 率在西方国家较高，在我国目前也有增高的趋势。但病因及发病机理不完全明了，现代医 学对本病多采用柳氮磺胺吡啶（SASP)结合皮质激素来进行治疗，主要是控制急性发作，缓 解病情，减少复发，防治并发症等，因SASP 口服后在结肠内被细菌的偶氮还原酶裂解，进入 肝内被乙酰化后由尿排出，生物利用度低，不能够在结肠炎症处形成有效的药物浓度；另有 皮质类固醇类药物如泼尼松、琥珀酸氢化可的松等，能够使处于急性期的溃疡性结肠炎迅 速诱导缓解，但长期应用可导致满月脸、电解质紊乱、骨质疏松等激素类药物的八大副作用 等，而且患者中还存在皮质类固醇抵抗；免疫抑制剂如6-巯基嘌呤与硫唑嘌呤等，其常用 于SASP和皮质类固醇治疗无效的患者和皮质类固醇毒性反应或长期持续依赖使用皮质类 固醇的患者，它可以阻断淋巴细胞增殖及激活，抑制趋化中性粒细胞，但却起效缓慢，毒副 反应如骨髓抑制、急性胰腺炎、恶心、发热、肝炎和过敏等相当严重；抗细胞因子调节剂如英 夫利昔单抗、达珠单抗等，其用于经皮质类固醇激素和（或）免疫抑制剂治疗效果不佳的中 重度溃疡性结肠炎患者，恶心又是频繁发生的副作用。

[0004] 二、中医中药治疗本病经验丰富但仅汤药为主，剂型单一

[0005] 近年来见诸报道的有效方药有白头翁汤、葛根苓连汤、乌梅丸、参苓白术散，理中 汤合四神丸、真人养脏汤、维和丸合愈疡汤、加味四逆散、黄芩汤有效成分配方、丹参等。用 于溃疡性结肠炎的治疗有相当多的临床报导，但是大多仅局限于临床效果观察，汤药为主，剂型单一。

[0006] 三、结肠靶向给药系统

[0007] 溃疡性结肠炎炎症主要侵犯直肠、乙状结肠、降结肠，也有少数累及横结肠及全结 肠，以左侧结肠多见。常规制剂口服后，药物在到达结肠前就会被吸收进入体循环，无法特 异性地作用于病变部位。结肠靶向给药系统药物在上消化道不释放，到回盲部或结肠才开 始崩解或溶蚀释放出来，发挥局部或全身治疗作用。

[0008] 口服结肠定位给药系统（oral colon specifi c drugdelivery system, OCDDS) 依释药机制可分为PH依赖型、时滞释药型、压力控制型、细菌触发型等多种体系。早期研究 大多建立在PH依赖型和时滞型理论基础上，但由于个体差异、胃肠道内容物和患者消化道 病理生理状况等因素的影响，常导致药物在小肠部位提前释放或不释药。压力控制型体系 的释药依赖于人体结肠内压力，但即使在正常的昼夜节律下，结肠内压力受各种生理因素 影响变化很大，以致药物释放个体差异也较大，不能确保药物预期释放。细菌触发型体系依据人体结肠独特的菌群分布，利用细菌产生的偶氮还原酶、糖苷酶（glycosidase)及糖苷 酸酶（glucuronidase)等多种酶，使载体降解而释药，从而避免上述释药系统的不确定性， 成为当前研究的一个热点。

[0009] 果胶是食品的天然成分之一，具有只能被结肠特有的细菌酶降解的特点，成为细 菌触发型结肠释药系统的一种良好载体，故得到广泛研究。

[0010] 果胶是一种异多糖的大分子化合物，由D-吡喃半乳糖醛酸通过1，4_糖苷键连接 成主链，中性糖（包括D-半乳糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖等）组成侧链，其中半乳糖醛酸的 部分羧基以甲酯化状态存在。通常将酯化度高于50% (相当于甲氧基含量7%〜16.3%) 的果胶称为高甲氧基果胶（high methoxylpectin, HMP)，酯化度低于50% (相当于甲氧基 含量小于7%)的则称为低甲氧基果胶（low methoxylpectin,LMP) 0果胶溶于水会形成黏 稠溶液，其黏度和溶解度与聚合程度及甲酯化程度有关，随甲氧基含量的增大，果胶的溶解 度减小，溶液黏度增大。

[0011] 人体自身不能产生分解果胶的酶，故果胶不会被胃肠道消化液消化，但结肠中寄 生的拟杆菌、梭杆菌、真杆菌和双歧杆菌等能产生聚半乳糖醛酸酶、果胶酯酶解聚酶及果胶 裂解酶，可将果胶分解为寡聚糖，甚至完全分解为半乳糖醛酸。由于这些细菌仅存在于结 肠，在人群中又具有高度的一致性，所以果胶作为结肠靶向制剂的载体，特异性强，研究结 果的可信度和可重复性较好。

[0012] 果胶溶于水，不能有效地保护药物，可利用果胶中游离羧基与钙离子反应制备果 胶钙。果胶钙在pH较低的溶液中稳定，而在碱性的溶液中则会发生溶胀。由于结肠具有较 高的pH，果胶钙的这种特性就能保证制剂中药物在结肠的特异性释放。当果胶的钙化度足 够高时，不溶于水、酸、碱及其它溶剂，但仍能被结肠内的果胶酶降解，产生一系列可溶性寡 聚糖。从结构上讲，果胶中的甲氧基含量越低，游离羧基越多，越易与Ca2+反应生成果胶钙， 故常用LMP。

发明内容

[0013] 本发明公开了一种治疗溃疡性结肠炎的药物及其制备方法。

[0014] 中医对溃疡性结肠炎的的认识首见于《难经》，病名为“大瘕泻”，病机核心以本虚 标实、虚实夹杂为主，虚以脾肾虚、气虚、阳虚为发病的根本，实责之于湿热壅滞、肝气郁结 或气滞血瘀。湿热贯穿本病始终。脾虚与湿热疫毒的胶结是本病的特点；对于本病的治疗， 传统医学多以健脾、温肾、清热利湿、淡渗利湿为主。针对本病病程长，虚实夹杂，类似于“休 息痢”，本发明公开的中药复方是江苏扬州五代祖传中医任达然临床有效方。该方以白头翁 汤（白头翁、黄柏、黄连、秦皮）加槐花、地榆治标，生黄芪、附片、焦白术治本组成，处方清热 利湿为主，辅以健脾益气温肾，标本兼治，疗效确切。

[0015] 一种治疗溃疡性结肠炎的药物，它是由下列重量份的原料药制成：白头翁5〜30 份、黄柏4〜24份、黄连2〜12份、秦皮4〜24份、生黄芪3〜18份、焦白术3〜18份、 槐花米3〜18份、地榆3〜18份、附片2〜10份。各中药重量份优选中间量。

[0016] 该方以白头翁（主要药效成分为原白头翁素）、黄柏和黄连（主要药效成分为小 檗碱）、秦皮（主要药效成分为七叶树苷等）、槐花米（主要药效成分为芦丁等黄酮类化合 物）、地榆（主要药效成分为鞣质和皂苷类）治标；生黄芪（主要药效成分为黄芪甲苷等）、附片（主要药效成分为生物碱类化合物、焦白术（主要药效成分为白术内酯等挥发油类） 治本组成，本方标本兼治，疗效确切。

[0017] 上述所说的治疗溃疡性结肠炎的药物，制备方法如下：

[0018] 1)称取各原料药白头翁、黄柏、黄连、秦皮、生黄芪、焦白术、槐花米、地榆和附片，

[0019] 2)将上述重量配比的白头翁全处方量、焦白术全处方量和其余药味半处方量混 合，超微粉碎至粒径达IOOnm以下得纳米粉原药，备用；

[0020] 3)将黄柏、黄连、秦皮、生黄芪、槐花米、地榆和附片7药味半处方量加水煎煮两 次，合并两次水煎液，浓缩至比重1. 2〜1. 8的提取浓缩液，备用；

[0021] 4)将提取浓缩液喷洒至纳米粉原药上制软材，过筛制得湿颗粒，50°C〜60°C干 燥；就制备成了本发明药物的活性组分。

[0022] 进一步地，为了达到更好的疗效，本发明优选利用果胶钙作为药物载体，实现结肠 靶向给药，例如，可制成中药结肠片，具体制法如下：

[0023] 在上述步骤4)后还有以下步骤：

[0024] 5)将低甲酯果胶加蒸馏水溶胀，热至50°C〜60°C溶解，浓度达5%〜15% ；倾入 氯化钙饱和溶液至无白色絮状沉淀生成，边加边搅拌，得钙含量10%以上的混悬胶液；

[0025] 6)将步骤4)活性组分压制成素片，再用步骤5)制得的果胶钙混悬胶液包衣至素 片增重8%〜20%，制得中药结肠片。

[0026] 本发明药物还包括除片剂以外的其他剂型。

[0027] 经实验表明，本发明的结肠果胶钙颗粒与结肠未包衣颗粒、结肠肠溶衣颗粒相比 较，三者均具有清除MDA、C0X-2，升高SOD、IL-4，减轻炎症反应，促进溃疡愈合的作用。本发 明结肠果胶钙颗粒的效果显著优于结肠未包衣颗粒、结肠肠溶衣颗粒。

附图说明

[0028] 图1为模型对照组药效实验病理切片图；

[0029] 图2为肠溶颗粒组药效实验病理切片图；

[0030] 图3为Sasp组药效实验病理切片图；

[0031] 图4为果胶钙包衣颗粒组药效实验病理切片图；

[0032] 图5为地塞米松组药效实验病理切片图；

[0033] 图6为空白对照组药效实验病理切片图；

[0034] 图7为未包衣颗粒组药效实验病理切片图

具体实施方式

[0035] 实施例1本发明药物的片剂制备

[0036] 将处方药材中的白头翁全处方量、焦白术全处方量和其余药味半处方量混合，超 微粉碎至粒径达IOOnm以下得纳米粉原药。

[0037] 将除白头翁、焦白术外的其余药味半处方量水煎lh，滤出药渣加水二煎lh，合并 水煎液，浓缩至比重1. 2〜1. 8做黏合剂用。

[0038] 将提取浓缩液喷洒至纳米粉原药上制软材，过14目筛制湿颗粒，50°C〜60°C干燥1.5h，过14目筛整粒后压成素片。

[0039] 将低甲酯果胶（酯化度<50%)加蒸馏水溶胀，热至50°C〜60°C溶解，浓度达 5%〜15% ；倾入氯化钙饱和溶液至无白色絮状沉淀生成，边加边搅拌，所得混悬胶液钙含 量应在10%以上（原子吸收分光光度计测定）。

[0040] 将素片以制得的果胶钙混悬胶液包衣至素片增重8%〜20%既得。

[0041] 实施例2本发明的中药结肠片的体外溶出试验

[0042] 1指标成分黄芪甲苷的测定方法

[0043] 1. 1黄芪甲苷最大吸收波长的测定

[0044] 精密称取黄芪甲苷对照品4. 895mg,用pH = 8的磷酸盐缓冲液定容至IOml量瓶 中，得浓度为0. 4895mg/ml的黄芪甲苷对照品溶液，进行紫外-可见全波长（190〜900nm) 扫描。确定最大吸收波长为538nm。处方中其他药物及果胶酸钙538nm处无干扰。

[0045] 1. 2黄芪甲苷标准曲线的建立

[0046] 精密吸取0. 4895mg/ml的黄芪甲苷对照品溶液0. 1、0. 2、0. 3、0. 5、0. 7和0. 9ml 置于50ml量瓶中，精密加入磷酸盐缓冲液定容，混勻得6个浓度的对照品溶液。于538nm 处测定吸收度。以黄芪甲苷浓度（χ)对吸收度（y)做回归分析，得标准曲线为：C = 0. 096A-0. 0014，r = 0. 9995，η = 6。线性范围为 0. 01 〜0. 08mg/ml。

[0047] 2溶出试验

[0048] 采用转篮法，水温为37 °C，转速为80r/min，溶出介质为人工胃液，溶出体积为 250ml。定时取样5ml，同时补加人工胃液5ml。精密吸取2ml，置IOml量瓶中，照3. 1. 2项 下方法操作，测吸收度值。再换人工肠液同法进行溶出试验，结果表明自制果胶钙结肠片在 人工胃液、人工肠液中均无明显泄漏（5小时内溶出百分率均低于2% )。

[0049] 在大鼠盲肠内容物溶液中的溶出（模拟人的结肠）。取6只重量在200〜300g 的大鼠，每天定时灌胃15%的果胶溶液lml，连续3天后处死大鼠，立即取出盲肠内容物，称 重后按1 ： 80比例加入pH7.0的磷酸缓冲液备用。另取6只塞上装有转篮的烧瓶，各加入 IOOml上述盲肠内容物的缓冲液。分别将6片压好的自制果胶钙结肠片放入转篮中，盖紧， 并通入C02。将瓶置于37°C恒温水浴中，不断搅拌。定时取样2ml，随即补加2ml的pH7.0 的缓冲液，经时12小时。每次取样需将样品离心，吸取上清液1ml，用pH7. 0的缓冲液稀释 至10ml，于538nm处测吸收度值，结果Ih溶出70%以上；3h溶出80%以上；5h溶出90%以 上。

[0050] 实施例3本发明的中药结肠颗粒的体内溶出试验

[0051] 将自制治疗溃疡性结肠炎的中药素片制成颗粒后包上述自制果胶钙衣膜；取6只 体重在2kg左右的家兔，每隔6h灌0. 2g上述果胶钙颗粒，罐6次。最后一次灌药3h后处 死并解剖家兔。在兔胃内找到平均约0. 2g完整的果胶钙颗粒，在小肠中找到平均0. 05g完 整的果胶钙颗粒，其余估计已在盲肠中被降解。6只家兔个体情况基本类似。

[0052] 实施例4疗效观察

[0053] 1材料与方法

[0054] 1. 1实验材料

[0055] 1. 1. 1实验动物

[0056] SD大鼠70只，体重180士20g，雄性，标准饲料喂养。（浙江省实验动物中心6SCXK (浙）2003-0001)

[0057] 1. 1.2实验药品

[0058] 取自制治疗溃疡性结肠炎的中药素片制成颗粒为未包衣颗粒组；将此颗粒包肠溶 衣为肠溶衣颗粒组；将此颗粒包自制果胶钙衣膜为果胶钙包衣颗粒组。

[0059] 阳性对照药：SASP，上海三维公司生产，批号：200712cl3，临用前配制成72mg/ml ； 地塞米松，浙江仙琚制药股份有限公司，批号：H33020822，临用前配制成0. 18mg/ml。

[0060] 1. 1. 3实验试剂

[0061] 造模试剂：5%三硝基本磺酸：Sigma公司（上海正及代理）；免疫组化试剂： 兔抗鼠cox-2多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；SABC试剂盒（北京博 奥森生物技术有限公司）；3，3 二氨基联苯胺盐酸盐（Diaminbenzidine，DAB)显色试 剂盒（北京博奥森生物技术有限公司）；生化试剂丙二醛（MaleicDialdehyde MDA) 试剂盒，批号20080410(南京建成医学生物研究）；超氧化物岐化酶（Superoxide Dismutsae SOD)试剂盒，批号20080410 (南京建成医学生物研究所提供）；考马斯亮兰 蛋白测定试剂盒，批号20080410(南京建成医学生物研究所提供）；IL-4ELISA试剂盒： ADL (ADLITTERAMDIAGNOSTIC LABORATORIES)公司（博士德代理）

[0062] 二甲苯，无水乙醇，丙酮，苏木素复染剂，双氧水，中性树胶，柠檬酸盐等试剂均为 国产分析纯。

[0063] 2 造模

[0064] 根据文献：陈英群，董福轮三硝基本磺酸诱导大鼠溃疡性结肠炎的实验研究同济 大学学报（医学版）2006-12 ；第27卷第6期31-33页所述方法造模，5 %三硝基苯磺酸 (TNBS)与无水乙醇以体积1 ： 1配成25mg (TNBS)/ml (混合液）。

[0065] 2. 1大鼠适应性饲养一周.

[0066] 2. 2造模前大鼠禁食不禁水24小时；70只预造模大鼠2 %戊巴比妥钠腹腔麻 醉（45mg/kg 5号注射器）；待大鼠完全麻醉后，随机挑选60只大鼠，经肛门轻缓插入直 径0. 2cm的塑料导管8cm，用2ml注射器缓慢注入相应体重比例的造模剂（100mg/kg即 0. 4ml/100g)，然后再注入一段长约0. 3ml的空气，尽可能清除黏附在注射器与灌肠管壁上 的药液。造模后大鼠随机分组，每组10只，并标号。分组后大鼠归笼，侧放在垫料上，采取 头低臀高位，防止大鼠窒息。剩余10只麻醉大鼠，经肛门轻缓插入直径0. 2cm的塑料导管 8cm，用2ml注射器缓慢注入2ml生理盐水，然后再注入一段长约0. 3ml的空气。作为空白 组。70只造模大鼠，自然清醒，自由饮食。造模24小时后给药，观察大鼠、称重、检测大便隐 血，每天观察精神、皮毛、大便、活动、存活等情况（等效剂量以成人常规剂量按人与动物体 表系数折算；空白对照组与模型组每日给予同体积生理盐水，每天灌胃1次，连续1周。均 以普通灭菌饲料喂养）。

[0067] 3实验标本采集处理和结果判定方法

[0068] 3. 1血标本采集与处理：各组动物经灌胃一周后结束，禁食不禁水24h后全部杀 检。麻醉大鼠后，腹腔下腔静脉采血4ml左右，置无菌试管中，室温静置自然凝固收缩后，以 3000r/min离心10分钟，分离血清，保存于_80°C冰箱，用ELISA试剂盒检测IL-4的含量。

[0069] 3. 2结肠组织采集与处理：低温条件下快速取溃疡明显处结肠组织，以冰冷生理 盐水冲洗，滤纸吸干，称重后用眼科小剪刀尽快剪碎，置于勻浆器中用9倍生理盐水勻浆7(勻浆器的末端置于放冰块的冷水中），以3500r/min离心lOmin，取上清液置-80°C冰箱 保存，待测。肠粘膜MDA、SOD测定采用比色法，参照试剂盒说明书进行操作。另取3.0〜 4. Ocm远端结肠（溃疡明显处）置于10%中性甲醛固定，用于cox-2免疫组织化学检测。

[0070] 3. 3结果判定方法

[0071] 阴性对照用O.Olmol/LPBS代替一抗，细胞浆呈黄色或棕黄色为阳性，无着色为阴 性；每张切片至少随机观察5个高倍视野下的面积，用捷达图像分析仪分析每个高倍视野 下阳性物质的平均光密度，取其均值。

[0072] 统计学处理：采用SPSS 10. 0统计软件处理，实验数据以X士 s表示，根据方差齐性 采用单因素方差分析，P < 0. 05表示统计学上差异有意义。

[0073] 4 结果

[0074] 4. IDAI 评分

[0075] 疾病活动指数（10) (DAI)比较：模型组、地塞米松组、SASP组及药物组在造模第 2天即出现疾病发作，模型组在整个实验过程中炎症持续，无明显自愈倾向；治疗组第5天 开始出现DAI下降趋势，实验终点时均有好转，第七天：果胶钙包衣组DAI (0. 85)，肠溶组 DAI (1.92)，未包衣组DAI (2)均低于阳性药物组，差异具有统计学意义(P < 0. 05)，见表1、 表2，这提示结肠颗粒可明显改善大鼠溃疡性结肠炎症状。

[0076] 表1. DAI计算表

[0077]

[0078]

[0079] 表2. DAI评分表 [0080]

[0081] 4. 2肠标本组织蛋白含量测定：[0082] 蛋白质分子具有-NH3+基团，当棕红色的考马斯亮兰显色剂加入蛋白标准液或样 品中时，考马斯亮兰染料上的阴离子与蛋白-NH3+基团结合，使溶液变为蓝色，通过测定吸 光度可计算出蛋白含量。（考马斯亮兰贮备液：临用时按所需量用蒸馏水1 ： 4稀释（即5 倍稀释），配成应用液（现用现配）。4°C保存。蛋白标准：0.563g/L蛋白标准液1支。4°C 保存。）

[0083] 准确称取待测组织的重量，按重量体积比加生理盐水制备成10%的组织勻浆， 1000〜3000转/分，离心10分钟（根据所测指标确定具体转速），然后取组织勻浆上清再 用生理盐水按1 ： 9稀释成组织匀浆，操作见表3。

[0084] 表3.蛋白测定操作表

[0086] 按表3操作，各管混勻后静置10分钟，于595nm处测定OD值，结果如表4。

[0087] 表4各组标本吸光度

[0088]

[0089] 根据下列公式计算得出蛋白含量（g/L)，结果如表5 ：

[0090]

[0091] 表5各组蛋白含量（g/L)

[0092]

[0093] 4. 3丙二醛的测定[0094] 机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基，后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪 酸，引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物。如：醛基（丙二醛MDA)、酮基、羟基、 羰基、氢过氧基或内过氧基，以及新的氧自由基等。脂质过氧化作用不仅把活性氧转化成 活性化学剂，即非自由基性的脂类分解产物，而且通过链式或链式支链反应，放大活性氧的 作用。因此，初始的一个活性氧能导致很多脂类分解产物的形成，这些分解产物中，一些是 无害的，另一些则能引起细胞代谢及功能障碍，甚至死亡。氧自由基不但通过生物膜中多不 饱和脂肪酸的过氧化引起细胞损伤，而且还能通过脂氢化过氧化物的分解产物一起细胞损 伤。因而测试MDA的量常常可反应机体内脂质过氧化的程度，间接地反应出细胞损伤的程 度。

[0095] MDA的测定常常与SOD的测定相互配合，SOD活力的高低间接反应了机体清除氧自 由基的能力，而MDA的高低又间接反应了机体细胞受自由基攻击的严重程度。

[0096] MDA测试原理：过氧化脂质降解产物中的丙二醛（MDA)可与硫代巴比妥酸（TBA) 缩合，形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰。

[0097] 试剂盒组成与配制：按说明书配制，操作见表6。

[0098] 表6MDA测定操作表

[0099]

[0100] 漩涡混勻器混勻，试管口用保鲜薄膜扎紧，用针头刺一小孔，95°C水浴40分钟，取 出后流水冷却，然后3500〜4000转/分，离心10分钟，取上清，532nm处测各管吸光度值， 结果如表7。

[0101] 表7. 532nm处测各管吸光度值

[0102]

[0103] 根据下述公式计算出MDA含量，结果如表8 ：

[0104]今旦测定管吸光度-测定空白管吸光度■口 贴冷旦 组织中浦乂 s皿=标准管吸光度-标准空白管吸光度χ—贞⑩自^

[0105] nmol/mgprot

[0106] 表8根据公式计算出的各组MDA含量MDA含量

[0107]

[0108] 统计结果如表9:

[0109] 表9各组大鼠肠黏膜MDA含量的比较（X 士 s)

[0111] 实验结果表明，果胶钙包衣颗粒组、肠溶颗粒组及未包衣组三个检验组与其他各 组间比较有统计学意义（P < 0. 05)，其中模型组MDA含量最高，两个阳性药物组sasp组高 于三个检验组，地塞米松组高于果胶钙包衣颗粒组，而空白组含量最低。

[0112] 4. 4S0D 的测定

[0113] 超氧化物岐化酶对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除超 氧阴离子自由基保护细胞免受损伤。

[0114] 测定原理：通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧 化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。当 被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减 少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中的 SOD活力。

[0115] 高等动物细胞内只有二种SOD即铜锌-SOD与锰-S0D，二者相加等于总SOD。经样 本前处理过的样本中锰-SOD活力丧失，但铜锌-SOD活力不变。

[0116] 表10总SOD活力的测定11

[0118] 按表10配制，加入试剂4后，用漩涡混勻器充分混勻，置37°C恒温水浴40分钟，然 后加入显色剂，混勻，室温放置10分钟，于波长550nm处测定吸收度，见表11。

[0119] 表11. SOD吸光度

[0120]

[0121] 根据下列公式得出SOD活力（U/mgprot)，如表12 ：

[0122]州如勺化中汉)识对照管吸光度-测定管吸光度二“ 反应液总体积

[0123]表 12S0D 活力（U/mgprot)

[0124]

[0125] 统计结果如表13:

[0126] 表13各组大鼠肠粘膜SOD活性的比较（X士s)

[0128] 实验结果表明，果胶钙包衣颗粒组、肠溶颗粒组及未包衣组三个检验组与其他各 组间比较有统计学意义（P < 0. 05)，其中空白组SOD含量最高，两个阳性药物组地塞米松组 仅高于未包衣组，sasp组低于三个检验组，而模型组含量最低。

[0129] 4. 5IL-4 测定

[0130] IL-4Elisa试剂盒测试准备工作：0. 2ml吸管，高温灭菌，烘干，保存，待用，仔细阅 读说明书，核对试剂。将-80°C冰箱血清标本取出，放在4°C冰箱待用。按说明书取出酶标 板，分别加入IOOul的标准品于空白微孔中；分别标记样品编号，依次加入IOOul样品于各 相应空白微孔中；在标准品和样品孔中加入50ul的酶标记溶液；36士2°C孵育反应60分 钟；洗板机清洗5次，每次静置10〜20秒；每孔加入底物A、B液各50ul ；36±2°C下避光 孵育反应15分钟；每孔加入50ul终止液，终止反应。于波长450nm的酶标仪上读取各孔的 OD值，结果见表14。（注：B =标准品OD值Btl =标准品0点OD值，以B/B。％值为纵坐标， 标准品的浓度为横坐标，在对数坐标纸上绘制标准曲线。标准品吸光度：1000 = 0. 274,500 =0. 452,250 = 0. 714,100 = 0. 944,50 = 1. 055,0 = 1. 540)

[0131] 表14待测物吸光度

[0132]

[0133] 根据说明书由excel软件求得计算公式为：Y = "0. 001Χ+1. 1586

[0134] 计算各组数据求得IL-4浓度如表15

[0135]表 15IL-4 浓度

[0136]

[0137] 统计结果如表16:

[0138] 表16各组大鼠血清IL-4含量（X士 S)

[0140] 实验结果表明，果胶钙包衣颗粒组、肠溶颗粒组及未包衣组三个检验组与其他各 组间比较有统计学意义（P < 0. 05)，其中空白组IL-4含量最高，两个阳性药物组地塞米松 组略高于未包衣组，sasp组低于三个检验组，而模型组含量最低。

[0141] 4. 6C0X-2 的测定

[0142] 确定多克隆抗体实验浓度。将兔抗大鼠cox-2多克隆抗体（北京博奥森）分装， 每个指形管20ul，另将其中一个指形管再分装成1 ： 200、1 ： 300,1 ： 400后进行下列操 作：

[0143] 选择8张切片，放入60°C烤箱30分钟；常规脱蜡后，蒸馏水洗2遍；高压修复2分 钟。（减压阀漏气时开始计时，2分中后立即将高压锅放入冷水中自然冷却）；滴加PBS 3分 钟处理两次，滴加3%双氧水处理30分钟（室温）；蒸馏水洗2遍，滴5%血清封闭液30分 钟（室温）后甩去（不可洗掉）。滴加一抗cox-2(l ： 200、1 ： 300、1 ： 400)，另选一张 滴加PBS作为阴性对照，放入4°C冰箱过夜。

[0144] 次日：PBS 3分钟*3次滴加试剂B 15分钟（37°C )；

[0145] PBS 3分钟*3次滴加试剂C 15分钟（37 Ό )

[0146] PBS 5分钟*4次PAB显色3分钟

[0147] 苏木素复染2分钟，脱水透明封片。

[0148] 读片：经C0X-2 —抗不同浓度实验后发现，1 ： 300效果好，阳性表达明显，阴性对 照无阳性表达，因此，把1 ： 300作为此实验一抗cox-2所需浓度，作为实验确定浓度。

[0149] 表17COX-2阳性光密度

[0150]

[0151] 统计结果如表18:

[0152] 表18各组大鼠血清cox-2含量（χ 士 s)

[0154] 实验结果表明，果胶钙包衣颗粒组、肠溶颗粒组及未包衣组三个检验组与其他各 组间比较有统计学意义（P < 0. 05)，其中空白组cox-2光密度含量最低，两个阳性对照药物 组，地塞米松组明显低于果胶钙包衣颗粒组，SASP组高于三个检验组，而模型组含量最高。