一种甲烷氧化混合菌的保存方法

摘要

本发明公开了一种甲烷氧化混合菌的保存方法。本发明提供的甲烷氧化混合菌的保存方法，包括如下步骤：将甲烷氧化混合菌加入NMS培养基中，于密封瓶中2-6℃保存；初始时，所述密封瓶中，NMS培养基、甲烷和空气的体积比为(5-30)∶(5-40)∶(30-80)。本发明提供的方法没有引入其他碳源，可以稳定地保持混合菌群的结构和功能，并且操作方便，可以快速启动。将在甲烷氧化混合菌的保存及其工业化应用中发挥巨大作用，应用前景广阔。

权利要求

1.一种甲烷氧化混合菌的保存方法，包括如下步骤：将甲烷氧化混合菌加入NMS培养基中，于密封瓶中2-6℃保存；初始时，所述密封瓶中，NMS培养基、甲烷和空气的体积比为(5-30)∶(5-40)∶(30-80)；

所述甲烷氧化混合菌为处于对数生长期的甲烷氧化混合菌；

所述NMS培养基配制方法如下：将100ml溶液A和1ml溶液B混合并用水定容至1L，灭菌后加入10ml灭菌后的溶液C，得到NMS培养基；每升所述溶液A的配制方法为：将KNO3

10g，MgSO4·7H2O 10g，CaCl2·2H2O 2g，水定容至1L；每升所述溶液B的配制方法为：Fe-EDTA

0.38g，NaMoO4 0.26g，FeSO4 0.5g，MnCl2·4H2O 0.02g，CoCl2·6H2O0.05g，H3BO3 0.015g，Na-EDTA 0.25g，ZnSO4·7H2O 0.4g，NiCl2·6H2O 0.01g，CuSO4·5H2O0.025g，水定容至1L；

每升所述溶液C的配制方法为：Na2HPO4·12H2O 71.6g，KH2PO4 26g，水定容至1L，pH值调至

6.8。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：初始时，所述密封瓶中，NMS培养基、甲烷和空气的体积比为5∶(2.5-3.5)∶(15-18)。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：初始时，所述NMS培养基中所述甲烷氧化混合菌的OD660为0.3-1.5。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：每隔10-60天重新向密封瓶中充入甲烷，使所述密封瓶中，NMS培养基、甲烷和空气的体积比为(5-30)∶(5-40)∶(30-80)。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：重新充入甲烷后，所述密封瓶中，NMS培养基、甲烷和空气的体积比为5∶(2.5-3.5)∶(15-18)。

说明书

一种甲烷氧化混合菌的保存方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种甲烷氧化混合菌的保存方法。

背景技术

[0002] 甲烷氧化菌是自然界中一类特殊的微生物，以甲烷为唯一碳源及能源，广泛存在于泥土、沼泽、稻田、河流、湖泊、森林和海洋中。虽然某些甲烷氧化菌也可以同时利用甲醇，但所有的甲烷氧化菌都不能利用多碳化合物。甲烷氧化菌以其独特的性质和多样的催化功能，在大宗化学品生产、新功能酶开发、瓦斯气体治理以及环境污染物的生物修复方面都具有极大的应用潜力。但甲烷氧化菌纯培养生长极为缓慢，功能不稳定，且甲烷氧化菌纯菌资源较少。而甲烷氧化混合菌是以甲烷氧化菌为主体的不同共生菌体的组合，相比纯菌更有利于工业应用。罗明芳等人研究表明，甲烷氧化混合菌具有高效降解苯酚、高效积累环氧丙烷的能力(罗明芳，等.含有甲烷氧化菌的混合菌群特性研究.微生物学报，2007，47(1)：103～109.)。

[0003] 在应用混合菌时，其功能的稳定性，取决于菌群结构的稳定性。而在甲烷氧化混合菌的保存方法上，既不能使用纯菌保存常用的平板传代法，也不能采用通常的添加保水性有机物(如甘油等)的菌种冷冻保存方法，因为平板传代过程会丢失混合菌中的大量菌种，而添加保水性有机物很容易引入其他碳源从而改变菌群结构。因此，迫切需要既简便易行，且能有效保持甲烷氧化混合菌的菌群结构和功能的高效保存方法。

发明内容

[0004] 本发明的目的就是提供一种甲烷氧化混合菌的保存方法。

[0005] 本发明所提供的甲烷氧化混合菌的保存方法，包括如下步骤：将甲烷氧化混合菌加入NMS培养基中，于密封瓶中2-6℃保存；初始时，所述密封瓶中，NMS培养基、甲烷和空气的体积比为(5-30)∶(5-40)∶(30-80)。

[0006] 所述保存方法中，初始时，所述密封瓶中，NMS培养基、甲烷和空气的体积比具体可为5∶(2.5-3.5)∶(15-18)。

[0007] 所述保存方法中，所述甲烷氧化混合菌具体可为处于对数生长期的甲烷氧化混合菌。

[0008] 所述保存方法中，初始时，所述NMS培养基中所述甲烷氧化混合菌的OD660为0.3-1.5，若OD660小于0.3则会影响保存效果，增加活化的难度。

[0009] 所述保存方法中，最好每隔10-60天重新向密封瓶中充入甲烷，使所述密封瓶中，NMS培养基、甲烷和空气的体积比为(5-30)∶(5-40)∶(30-80)。重新充入甲烷后，所述密封瓶中，NMS培养基、甲烷和空气的体积比优选为5∶(2.5-3.5)∶(15-18)。

[0010] 为保证菌种特性，可定期进行转接活化，转接间隔时间最好不超过一年。

[0011] 需要使用甲烷氧化混合菌时，直接将保存有所述甲烷氧化混合菌的的培养瓶进行培养即可。

[0012] 所述甲烷氧化混合菌的制备方法可包括如下步骤：

[0013] 1)采集煤矿或垃圾填埋场的土样；

[0014] 2)将步骤1)的土样加入NMS培养基中，于密封瓶中培养；初始时，所述密封瓶中，NMS培养基、甲烷和空气的体积比为(5-30)∶(5-40)∶(30-80)；每24-72小时向密封瓶中置换入甲烷，使所述密封瓶中，NMS培养基、甲烷和空气的体积比为(5-30)∶(5-40)∶(30-80)；

[0015] 3)每8-12天接种步骤2)的培养液至新的NMS培养基，进行传代；步骤2)的培养液与NMS培养基的体积比为(5-15)∶(95-85)；传至10代以上，得到甲烷氧化混合菌。

[0016] 所述步骤2)具体可为：初始时，所述密封瓶中，NMS培养基、甲烷和空气的体积比为5∶(2.5-3.5)∶(15-18)；每48小时向密封瓶中置换入甲烷，使所述密封瓶中，NMS培养基、甲烷和空气的体积比为5∶(2.5-3.5)∶(15-18)。

[0017] 所述步骤3)具体可为：每10天接种步骤2)的培养液至新的NMS培养基，进行传代；步骤2)的培养液与NMS培养基的体积比为10∶90；传至第10代，得到甲烷氧化混合菌。

[0018] 所述NMS培养基配制方法具体如下：将100ml溶液A和1ml溶液B混合并用水定容至1L，灭菌后加入10ml灭菌后的溶液C，得到NMS培养基；每升所述溶液A的配制方法为：将KNO3 10g，MgSO4·7H2O 10g，CaCl2·2H2O 2g，水定容至1L；每升所述溶液B的配制方法为：Fe-EDTA 0.38g，NaMoO4 0.26g，FeSO4 0.5g，MnCl2·4H2O 0.02g，CoCl2·6H2O 0.05g，H3BO3 0.015g，Na-EDTA 0.25g，ZnSO4·7H2O 0.4g，NiCl2·6H2O 0.01g，CuSO4·5H2O 0.025g，水定容至1L；每升所述溶液C的配制方法为：Na2HPO4·12H2O 71.6g，KH2PO4 26g，水定容至1L，pH值调至6.8。

[0019] 由于甲烷氧化菌的生长速度远远慢于其他细菌，当有非甲烷的碳源存在时，很容易改变甲烷氧化混合菌的菌群结构，从而导致混合菌功能上的变化。本发明提供的保存甲烷氧化混合菌的方法没有引入其他碳源，可以稳定地保持混合菌群的结构和功能，并且操作方便，再次使用时可以快速启动。所采用的NMS培养基，无需加入任何添加物，隔一两个月充入少量甲烷即可，简单经济，将在甲烷氧化混合菌的保存及其工业化应用中发挥巨大作用，应用前景广阔。

附图说明

[0020] 图1为甲烷氧化混合菌的变性梯度凝胶电泳图。1：一直传代培养的甲烷氧化混合菌；2：本发明的方法保存后的甲烷氧化混合菌。

具体实施方式

[0021] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

[0022] 甲烷去除率的检测方法如下：在250ml的可密封的玻璃培养瓶中分装50ml NMS液体培养基，在液体培养基中接种1ml OD660＝1.0的甲烷氧化混合菌，加盖密封橡胶塞，在上层空气中置换入30ml甲烷(使瓶中空气与甲烷的体积比约为5∶1)。30℃、170rpm空气浴摇床培养，每24小时用气相色谱检测甲烷的剩余量(％，体积百分含量)。每次检测完甲烷剩余含量之后，打开密封盖，使内部气体与外部气体流通，然后重新加盖密封橡胶塞，并重新在上层空气中置换入30ml甲烷(使瓶中空气与甲烷的体积比约为5∶1)，同时用气相色谱检测甲烷起始量(％，体积百分含量)。甲烷去除率＝(甲烷起始量-甲烷剩余量)/甲烷起始量×100％。

[0023] 实施例1、甲烷氧化混合菌的获得

[0024] 一、土样采集和培养基配制

[0025] 土壤样品：从河南省新峰矿物局的一个高瓦斯煤矿四矿采样，样品取自该煤矿排风口处表层5cm深土壤，土壤样品的基本性质见表1。

[0026] 表1新峰煤矿土壤样品性质(取样日期：2006年10月9日)

[0027]

[0028]

[0029] 用于培养和筛选甲烷氧化混合菌的培养基为NMS培养基，配制方法如下：

[0030] 溶液A(每升)：KNO3 10g，MgSO4·7H2O 10g，CaCl2·2H2O 2g，去离子水定容至1L；

[0031] 溶液B(每升)：Fe-EDTA 0.38g，NaMoO4 0.26g，FeSO4 0.5g，MnCl2·4H2O 0.02g，CoCl2·6H2O 0.05g，H3BO3 0.015g，Na-EDTA 0.25g，ZnSO4·7H2O 0.4g，NiCl2·6H2O 0.01g，CuSO4·5H2O 0.025g，去离子水定容至1L；

[0032] 溶液C(每升)：Na2HPO4·12H2O 71.6g，KH2PO4 26g，去离子水定容至1L，pH值调至6.8，高温(121℃)灭菌；

[0033] NMS培养基：100ml溶液A，1ml溶液B，去离子水定容至1L，高温(121℃)灭菌；在高温灭菌后的混合液中加入10ml灭菌后的溶液C(如配置固体培养基则加入15g琼脂粉)。

[0034] 二、甲烷氧化混合菌的培养

[0035] 摇瓶培养：采用250ml螺口摇瓶，装50ml NMS液体培养基，加入5g土壤样品，利用带有聚四氟乙烯密封垫的瓶盖密封，在上层空气中置换入30ml甲烷(使瓶中空气与甲烷的体积比约为5∶1)；30℃，170rpm空气浴摇床培养；每48小时重新置换入30ml甲烷(使瓶中空气与甲烷的体积比约为5∶1)。

[0036] 三、甲烷氧化混合菌的传代

[0037] 每10天接种10％的培养液至新的NMS培养基中，作为一次传代，培养方法同步骤二。对传至第10代的甲烷氧化混合菌进行群落多样性鉴定，方法为：对稳定菌群的部分变性梯度凝胶电泳(DGGE，Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)条带进行测序，并使用RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)方法进行克隆建库分析，通过序列比对分析，表明甲烷氧化混合菌中包括的细菌至少包括下面的菌属：甲基单胞菌属(Methylomonas)、嗜甲基菌属(Methylophilus)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、Methylosinus、甲基杆菌属(Methylobacter)、噬氢菌属(Hydrogenophaga)、类芽胞杆菌属(Paenibacillus)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)。

[0038] 实施例2、甲烷氧化混合菌的保存和保存效果鉴定

[0039] 一、甲烷氧化混合菌的保存

[0040] 取50ml实施例1获得的含有第10代的甲烷氧化混合菌(培养至对数生长期)的NMS液体培养基(0D660为1)，装入250ml的可密封的已灭菌玻璃培养瓶中，加盖密封橡胶塞。在上层空气中置换入30ml甲烷，使瓶中空气与甲烷的体积比约为5∶1。置于4℃保存，每月置换培养瓶中的气体，使密封瓶中含有30ml甲烷。

[0041] 二、保存效果鉴定

[0042] 1、甲烷氧化混合菌的活化

[0043] 甲烷氧化混合菌保存三个月后，进行活化，具体如下：向保存有甲烷氧化混合菌的密封瓶中充入甲烷(使瓶中含有30ml甲烷)，30℃、170rpm空气浴摇床培养4天，每48小时重新置换入甲烷。将活化后的甲烷氧化混合菌分别进行以下步骤2、3、4的鉴定。同时，将实施例1获得的第10代的甲烷氧化混合菌一直传代培养，作为对照，进行如下步骤2、3、4的鉴定。另外，将甘油保存(15％甘油，-80℃冻存三个月)的实施例1获得的第10代的甲烷氧化混合菌进行同样的活化，然后进行如下步骤2和步骤3的实验。

[0044] 2、生长速度鉴定

[0045] 将步骤1的甲烷氧化混合菌接入50ml NMS培养基中，使初始浓度OD660为0.05，每天充入新的甲烷30ml，密封，30℃、170rpm空气浴摇床培养。

[0046] 培养4天后，本发明的方法保存后的甲烷氧化混合菌的OD660达到1以上，与一直传代培养的甲烷氧化混合菌的生长速度相当，而甘油保存后的甲烷氧化混合菌的OD660为0.3。结果说明，经本发明的保存方法保存后，甲烷氧化混合菌仍能保持较快的生长速度。

[0047] 3、耗甲烷能力的鉴定

[0048] 检测步骤1的甲烷氧化混合菌的甲烷去除率。试验设置3瓶重复，结果取平均值，结果见表2。

[0049] 表2甲烷氧化混合菌对甲烷的去除率

[0050]第一天 第二天 第三天 第四天 第五天
一直传代培养的甲烷氧化混合菌 100％ 70％ 62％ 93％ 77％
本发明的方法保存(4℃培养瓶密封保存)
100％ 71％ 59％ 100％ 79％
后的甲烷氧化混合菌
15％甘油，-80℃冻存甲烷氧化混合菌 5％ 0％ 1％ 0％ 0％[0051] 实验结果表明，本发明保存方法保存后，甲烷氧化混合菌仍然具有高效的去除甲烷的能力。

[0052] 4、菌群结构的鉴定

[0053] 分别提取步骤1的甲烷氧化混合菌的基因组DNA，通过PCR-DGGE的方法考察微生物群落的变化。

[0054] PCR扩增所使用的引物如下：

[0055] 341f_GC(序列表的序列1)：

[0056] 5′-cgcccgccgcgccccgcgcccgtcccgccgcccccgcccgCCTACGGGAGGCAGCAG-3′；

[0057] 907r(序列表的序列2)：

[0058] 5′-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3′。

[0059] PCR的反应条件为：94℃预变性5min，循环过程为94℃1min、退火温度1min、72℃3min(其中退火温度从65~55℃，每个温度2个循环)，72℃延伸7min。

[0060] PCR反应产物用1.0％琼脂糖变性梯度凝胶电泳检验。

[0061] 琼脂糖凝胶电泳条件为：6％的聚丙烯凝胶，40％-70％的变性剂梯度，85V恒压，60℃，840min。

[0062] 走胶结束后，采用SYBR Gold(Molecular ProbesTM，Invitrogen Co.，CA)染色1h，用紫外检测并照相。电泳图见图1。

[0063] 结果表明，采用本发明的方法保存后的甲烷氧化混合菌的DNA指纹和一直传代培养的甲烷氧化混合菌非常接近，说明本发明的保存方法能很好的保持菌群结构的多样性。

[0064] 序列表

[0065] <110>清华大学

[0066] <120>一种甲烷氧化混合菌的保存方法

[0067] <130>CGGNARY92526

[0068] <160>2

[0069] <210>1

[0070] <211>57

[0071] <212>DNA

[0072] <213>人工序列

[0073] <220>

[0074] <223>

[0075] <400>1

[0076] cgcccgccgc gccccgcgcc cgtcccgccg cccccgcccg cctacgggag gcagcag 57[0077] <210>2

[0078] <211>20

[0079] <212>DNA

[0080] <213>人工序列

[0081] <220>

[0082] <223>

[0083] <400>2

[0084] ccgtcaattc mtttgagttt 20