一种肿瘤抑制剂NRN1SR42转让专利
申请号 : CN200810041470.7
文献号 : CN101642462B
文献日 : 2011-11-02
发明人 : 余龙 , 秦波 , 仙玲玲 , 韩丁丁 , 季国庆
申请人 : 复旦大学
摘要 :
本发明属于生物医药领域，涉及一种肿瘤抑制剂NRN1SR42。肿瘤严重威胁着人类的健康。本发明提供了一种用于制备抗肿瘤药物的核苷酸分子NRN1SR42，其序列包括5’-CCATTTGCGACCGCAGACC-3’或者5’-CCAUUUGCGACCGCAGACC-3’。注射NRN1SR42的裸鼠与相同培养条件下不注射NRN1SR42的裸鼠相比，瘤体的增长明显受到抑制，而且这种现象随着时间的推移日益明显。本发明为肿瘤的治疗和缓解提供了一种新的途径和手段。
权利要求 :
1.一种肿瘤抑制剂，其特征在于，它是序列为5’-CCATTTGCGACCGCAGACC-3’的核酸分子可操作地连于慢病毒载体而形成的重组载体；所述的肿瘤是肝癌。
2.如权利要求1所述的肿瘤抑制剂，其特征是，所述的肿瘤抑制剂是针剂。
3.权利要求1所述的肿瘤抑制剂的制备方法，其特征在于，核酸分子
5’-CCATTTGCGACCGCAGACC-3’由各脱氧核糖核苷酸基团依次脱水缩和而成。
说明书 :
一种肿瘤抑制剂NRN1SR42
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及一种核苷酸分子及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
[0002] 肿瘤疾病现已上升为世界第2号″杀手″，其死亡人数仅次于心血管病。几年来，国外医学界对于肿瘤疾病的发病机理在细胞基础上又有了新的认识。基于对肿瘤发病机制的进一步理解，人们利用各种途径来研制和开发能够特异，有效地杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无毒性的药物。目前，对于癌症的治疗仍以化疗及放疗为首选，两者虽对肿瘤的治疗取得了相当的疗效，但由于缺乏对肿瘤细胞的特异性因而具有较大的毒副作用以及某些肿瘤细胞对化疗和放疗处理的不敏感，因此在很大程度上限制了它们在临床中的应用。近年来，为了开发出能特异性地杀伤癌细胞而对正常细胞无毒负作用的药物，人们对癌症的发病机制从细胞，分子水平上的研究予以高度重视和巨额投资。
发明内容
[0003] 本发明的目的是提供一种肿瘤抑制剂。
[0004] 本发明提供了一种肿瘤抑制剂，它是序列中包括5’-CCATTTGCGACCGCAGACC-3’或者5’-CCAUUUGCGACCGCAGACC-3’的核酸分子，在本发明中被称为NRN1SR42。 [0005] 其中，A、U、G和C分别是腺嘌呤核苷酸、尿嘧啶核苷酸、鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸。
[0006] 在本发明中，术语“核苷酸分子NRN1SR42”指具有抑制NRN1蛋白活性、并且含有与5’-CCAUUUGCGACCGCAGACC-3’序列高度同源的核酸序列。该术语还包括与5’-CCAUUUGCGACCGCAGACC-3’的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
[0007] 该术语还包括5’-CCAUUUGCGACCGCAGACC-3’的核苷酸序列变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-15个，较佳地1-10个，更佳地1-5个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为10个以内，较佳地为5个以内)核苷酸。例如，在5’-CCAUUUGCGACCGCAGACC-3’后(3‘端)加入若干dT(脱氧胸苷)后形成的序列。
[0008] 在本发明中的核苷酸分子，其序列可以包括5’-CCATTTGCGACCGCAGACC-3’或者5’-CCAUUUGCGACCGCAGACCdTdT-3’。
[0009] 本发明中的核苷酸分子，其序列可以包括5’-CCAUUUGCGACCGCAGACC-3’。 [0010] 本发明中的核苷酸分子，其序列可以包括5’-CCAUUUGCGACCGCAGACCdTdT-3’。 [0011] 本发明中的核苷酸分子，其序列可以包括5’-CCATTTGCGACCGCAGACC-3’或者5’-CCAUUUGCGACCGCAGACCdTdT-3’。
[0012] 本发明中的核苷酸分子，其序列可以是5’-CCAUUUGCGACCGCAGACCdTdT-3’。 [0013] 本发明还提供了一种载体，它含有序列包括5’-CCATTTGCGACCGCAGACC-3’或者5’-CCAUUUGCGACCGCAGACCdTdT-3’的核苷酸分子。
[0014] 本发明的上述载体，其序列中可以包括5’-CCATTTGCGACCGCAGACC-3’或者5’-CCAUUUGCGACCGCAGACC-3’。
[0015] 在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将含有本发明NRN1SR42核苷酸序列的5’-CCAUUUGCGACCGCAGACC-3’，可操作地连于表达调控序列，可以形成重组载体。例如，可以采用慢病毒、腺病毒或者森林脑炎病毒表达系统(Semliki ForestVirus)。慢病毒(Lentivirus)属于逆转录病毒亚属，以人类免疫缺陷病毒 (human immunod efficiency virus，HIV)为代表.慢病毒不仅具有感染分裂靶细胞并整合其基因组中，尤其是具有感染包括神经元细胞、巨噬细胞、肝细胞、心肌细胞和干细胞等在内的多种非分裂细胞能力，因而，慢病毒载体已作为基因转移的有效工具，被广泛应用于基因功能尤其是基因治疗的研究。
[0016] 如本文所用，“可操作地连于”指这样一种情况，即线性RNA序列地某些部分能够影响同一线性RNA序列其他部分地活性，例如，如果信号肽RNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)RNA就是可操作地连于多肽RNA；如果启动子控制序列地转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译地位置时，那么它是可操作连于编码序列。一般，“可操作连于”意味着相临近，而对于本发明的核酸分子则意味着相邻且不影响功能。
[0017] 本发明中还提供了一种宿主细胞，它含有序列包括5’-CCATTTGCGACCGCAGACC-3’或者5’-CCAUUUGCGACCGCAGACC-3’的核苷酸分子。
[0018] 在本发明中，术语“宿主细胞”主要是真核细胞。常用的有：CHO细胞、COS-7、293细胞，等等。
[0019] 另一方面，本发明还提供了上述的核苷酸分子NRN1SR42的制备方法，即按NRN1SR42的序列，将各核糖核酸分子依次脱水缩合。
[0020] 本发明的核苷酸分子NRN1SR42可以采用各种常规的制备方法制备。本发明的核苷酸分子NRN1SR42序列通常可以用酶解法或人工合成的方法获得。
[0021] 本发明还提供了上述的核苷酸分子NRN1SR42在制备抗肿瘤药物中的应用。 [0022] 将含有NRN1SR42的细胞注射裸鼠的肿瘤中，与相同培养条件下不注射NRN1SR42的裸鼠相比，瘤体的增长明显受到抑制，而且这种现象随着时间的推移日益明显。 [0023] 本发明的核苷酸分子NRN1SR42及其类似物，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可 随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。
[0024] 以本发明的核苷酸分子NRN1SR42为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的核苷酸分子NRN1SR42可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的NRN1SR42还可与其他治疗剂一起使用。
[0025] 当本发明的核苷酸分子NRN1SR42被用作药物时，可将治疗有效剂量的该多肽施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0026] 本发明中，所述的抗肿瘤药物是由含有效治疗量的核苷酸分子NRN1SR42和药学上的载体或者赋形剂组成的药物组合物。所述药物组合物可以是针剂或者片剂。其有效治疗量可以为每天1微克/千克至10毫克/千克体重。
[0027] 本发明中，所述药物可以是针剂、粉剂或者片剂。
[0028] 本发明的核苷酸分子NRN1SR42注射入裸鼠的肿瘤中，与相同培养条件下不注射NRN1SR42的裸鼠相比，瘤体的增长明显受到抑制，而且这种现象随着时间的推移日益明显。本发明为肿瘤的治疗和缓解提供了一种新的途径和手段。
具体实施方式
[0029] 实施例NRN1抑制剂抑制裸鼠肿瘤生长实验
[0030] 一、实验材料
[0031] 1.裸鼠：上海斯莱克实验动物有限公司
[0032] 2.Lentivirus vector(慢病毒载体)：上海吉凯基因技术有限公司 [0033] 二、实验步骤
[0034] 1.将裸鼠放入SPF级动物房(无特定病原体级实验动物房)，使其适应培养环境约一个星期。
[0035] 2. 用 DMEM(Dulbecco’s Medified Eagle Medium，invitrogene 公 司，12800-82)+10％FBS培养SMMC-7721细胞。
[0036] 3.将SMMC-7721细胞(购自中国科学院细胞库)用胰酶消化后离心，去上清，用无7
血清的DMEM重悬，然后去上清，加入适量PBS，制成每毫升约4×10 个细胞的悬液。 [0037] 4.向4-6周龄的裸鼠的腋下注射0.2ml约含有8×106个单位的细胞的PBS悬液。 [0038] 5.待瘤体直径达到3-5mm(毫米)时，按瘤体积大小将相同的2只分别归为实验组和对照组，并给这2组的每只小鼠都剪耳朵编号，记录此时的每只小鼠瘤体的长径短径和体重。
血清的DMEM重悬，然后去上清，加入适量PBS，制成每毫升约4×10 个细胞的悬液。 [0037] 4.向4-6周龄的裸鼠的腋下注射0.2ml约含有8×106个单位的细胞的PBS悬液。 [0038] 5.待瘤体直径达到3-5mm(毫米)时，按瘤体积大小将相同的2只分别归为实验组和对照组，并给这2组的每只小鼠都剪耳朵编号，记录此时的每只小鼠瘤体的长径短径和体重。
[0039] 6.向2组小鼠的瘤体内分别直接注射0.1ml(毫升)的病毒和病毒空载体，以注射病毒空载体为对照。每4天重复注射一次，共注射三次。
[0040] 7.从第一次注射病毒之日开始，每3天测量并记录每只小鼠的瘤体的长径短径和2
体重，瘤体的体积v＝ab/2(a长径长度，b短径长度)。约4个星期后取瘤。 [0041] 结果显示，与对照组相比，注射病毒(含有NRN1SR42)的裸鼠瘤体生长明显减慢，注射病毒20天后，NRN1SR42组瘤体体积仅为对照组瘤体体积的40％左右。这说明，本发明的NRN1SR42可以明显抑制肿瘤生长。 SEQUENCE LISTING
体重，瘤体的体积v＝ab/2(a长径长度，b短径长度)。约4个星期后取瘤。 [0041] 结果显示，与对照组相比，注射病毒(含有NRN1SR42)的裸鼠瘤体生长明显减慢，注射病毒20天后，NRN1SR42组瘤体体积仅为对照组瘤体体积的40％左右。这说明，本发明的NRN1SR42可以明显抑制肿瘤生长。 SEQUENCE LISTING